一种高纯度胶原蛋白提取工艺

摘要

本发明提供了一种高纯度胶原蛋白的提取工艺，属于蛋白质提取技术领域。所述的提取工艺包括跟腱预处理步骤和胶原蛋白提取纯化步骤，在实施过程中通过合理控制预处理过程中的试剂，以及各种试剂的浓度，混合方式以及加入顺序，明显提高了预处理过程中跟腱脂肪的去除效率，提高了胶原蛋白的纯度和活性，并且得到的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，安全性更好，可满足化妆品，医疗器械、组织工程等需求。

权利要求

1.一种胶原蛋白提取工艺，其特征在于：包括以下步骤：（1）跟腱预处理步骤；

所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用酒精浸泡，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

③取跟腱切片进行以下处理：

第一步：采用过氧乙酸浸泡，然后用纯化水清洗三次；

第二步：重复第一步处理一次；

第三步：用磷酸三丁酯和吐温80混合溶液浸泡，用纯化水清洗三次；

第四步：用氢氧化钠和TritonX‑114混合溶液浸泡，纯化水清洗三次；

第五步：用氯化钠和碳酸钠混合溶液浸泡，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粉末，得到跟腱粉末，备用；

（2）胶原蛋白提取纯化步骤；

第一步中所述的过氧乙酸的浓度为0.2%‑0.5%；浸泡时间为2‑5分钟；

第三步中所述的磷酸三丁酯的浓度为0.2%‑0.5％；所述的吐温80的浓度为0.1%‑0.5%；

浸泡时间为3‑6分钟；所述的磷酸三丁酯和吐温80混合溶液的浓度比例为1‑2:1；

第四步中所述的氢氧化钠的浓度为0.1%‑0.3%；所述的TritonX‑114的浓度为0.1%‑

0.5%；浸泡时间为2‑6分钟；所述的氢氧化钠和TritonX‑114混合溶液的浓度比为1‑3:1；

第五步中所述的氯化钠的浓度为0.9%，所述的碳酸钠的浓度为0.1%‑0.5%；浸泡时间为

1.5‑2.5小时；所述的氯化钠和碳酸钠混合溶液的浓度比为1:0.2‑0.5。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取工艺，其特征在于：所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用75%酒精浸泡8分钟，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

③取跟腱切片进行以下处理：

第一步：采用0.4%的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

第二步：重复步骤a处理一次；

第三步：用0.4%的磷酸三丁酯和0.2%的吐温80混合溶液浸泡5分钟，用纯化水清洗三次；

第四步：用0.3%的氢氧化钠和0.2%的TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

第五步：用0.9%的氯化钠和0.3%的碳酸钠混合溶液浸泡2小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1毫米的粉末，得到跟腱粉末，备用。

说明书

一种高纯度胶原蛋白提取工艺

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种从跟腱中提取高纯度胶原蛋白的工艺。

背景技术

[0002] 胶原蛋白(collagen)是动物体内含量最为丰富的一类蛋白质，约占全部蛋白质含量的30％以上，广泛分布于骨骼、软骨、筋腱、皮肤、血管等组织和器官中。在已知的28种胶
原类型中，I型胶原含量最为丰富、分布最为广泛。因其具有良好的生物相容性、低免疫原
性、良好的生物力学性能等，可作为天然的生物框架组分，在临床医学、组织工程、医学生物
工程等领域具有巨大的应用空间。

[0003] 现有的胶原蛋白的提取方法很多，但几乎都存在一个杂质的去除问题，通过加入丙酮等有机溶剂去除脂类物质都会有不同程度的残留，并且这些有机溶剂很多都有毒性。
提高胶原的提取纯度，除选择适合的组织作为原材料外，恰当的预处理方法也是极其重要
的。原材料中的脂肪组织必须充分去除，胶原中一旦有脂质混入，无论是进行中性还是酸性
沉淀溶解，都是不能去除的，最后只能得到乳浊状的胶原溶液。化妆品级胶原溶液对微生物
的含量都有一定的要求，更高端的一些医用胶原溶液最终都需要以无菌提供。无论是冻干
品还是液体状态保存，都需要在跟腱预处理阶段以合适的方法减少微生物的含量，让后期
的除菌工艺更容易。

[0004] 如中国专利申请201110361186.X中公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法，以新鲜猪皮为原料，经预处理，去除脂肪，经酸酶解法处理后，使用超声波处理，进一步提高提取效
率，最后纯化制得高纯度的胶原产品，在通过酶法交联和冷冻干燥制得胶原蛋白海绵，该申
请的猪皮预处理过程中使用丙酮或无水乙醚作为有机溶剂用于去除脂类，容易产生毒性残
留。

[0005] 中国专利申请201811465406.1中公开了一种胶原蛋白提取方法，包括：①牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；②步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，
用溶液进行二次预处理；③步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；④将前
处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；⑤调节胶原粗提液pH，加入中
性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；⑥加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶
原蛋白，该申请中预处理步骤进行了两次，目的是将脂肪组织等全部去除，其中在预处理中
使用的试剂为乙醇溶液、次氯酸钠、EDTA‑Na2、TritionX‑114、磷酸三丁酯、Triton X‑100、
氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液，该申请仅关注了胶原蛋白的纯度，但是并没有对胶原蛋白的三
螺旋结构完整性进行研究，并且未进行病毒工艺验证，提取的胶原蛋白无法应用于组织工
程领域。

[0006] 因此，需要开发一种三螺旋结构完整，纯度更高，安全性更好，可满足化妆品，医疗器械、组织工程等需求的胶原蛋白的提取方法。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的不足，本发明旨在提供了一种高纯度胶原蛋白提取工艺，本发明采用独特的跟腱预处理工艺，能够明显降低跟腱碎片中微生物的含量，达到病毒灭
活效果，处理后的跟腱碎片提取的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，纯度更高，安全性更
好，可满足化妆品，医疗器械、组织工程等需求。

[0008] 为达到本发明的技术效果，本发明是通过以下技术方案来实现：

[0009] 一种高纯度胶原蛋白提取工艺，包括以下步骤：

[0010] (1)跟腱预处理步骤；

[0011] (2)胶原蛋白提取纯化步骤；

[0012] 所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

[0013] ①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用酒精浸泡，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

[0014] ②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

[0015] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0016] 第一步：采用过氧乙酸浸泡，然后用纯化水清洗三次；

[0017] 第二步：重复第一步处理一次；

[0018] 第三步：用磷酸三丁酯和吐温80混合溶液浸泡，用纯化水清洗三次；

[0019] 第四步：用氢氧化钠和TritonX‑114混合溶液浸泡，纯化水清洗三次；

[0020] 第五步：用氯化钠和碳酸钠混合溶液浸泡，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0021] 上述步骤①中所述的酒精的体积分数为70‑75％，优选为75％，浸泡时间为3‑10分钟，优选为6‑8分钟；

[0022] 上述第一步中所述的过氧乙酸的浓度为0.2％‑0.5％，优选为0.3％‑0.4％；浸泡时间为2‑5分钟；优选为3‑4分钟。

[0023] 上述第三步中所述的磷酸三丁酯的浓度为0.2％‑0.5％；优选为0.3％‑0.4％；所述的吐温80的浓度为0.1％‑0.5％，优选为0.2‑0.4％；浸泡时间为3‑6分钟，优选为4‑5分
钟；

[0024] 在一些优选实施例中，所述的磷酸三丁酯和吐温80混合溶液的浓度比例为1‑2:1；优选为2:1。

[0025] 上述第四步中所述的氢氧化钠的浓度为0.1％‑0.3％；优选为0.2％‑0.3％；所述的TritonX‑114的浓度为0.1％‑0.5％，优选为0.2％‑0.4％；浸泡时间为2‑6分钟，优选为3‑
5分钟。

[0026] 在一些优选实施例中，所述的氢氧化钠和TritonX‑114混合溶液的浓度比为1‑3:1；优选为1‑2:1；再优选为1.5:1。

[0027] 上述第五步中所述的氯化钠的浓度为0.9％，所述的碳酸钠的浓度为0.1％‑0.5％，优选为0.2％‑0.4％；浸泡时间为1.5‑2.5小时，优选为2小时。

[0028] 在一些优选实施方案中，所述的氯化钠和碳酸钠混合溶液的浓度比为1:0.2‑0.5，优选为3:1。

[0029] 上述第五步中所述的冻干是采用液氮进行冻干，研磨得到的粉末的粒径为0.1毫米。

[0030] 作为一个优选的技术方案，所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

[0031] ①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用75％酒精浸泡8分钟，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

[0032] ②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

[0033] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0034] 第一步：采用0.4％的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0035] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0036] 第三步：用0.4％的磷酸三丁酯和0.2％的吐温80混合溶液浸泡5分钟，用纯化水清洗三次；

[0037] 第四步：用0.3％的氢氧化钠和0.2％的TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0038] 第五步：用0.9％的氯化钠和0.3％的碳酸钠混合溶液浸泡2小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1mm的粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0039] 所述的胶原蛋白提取纯化步骤还包括以下分步骤：

[0040] S1：取跟腱粉末样品用0.5mol/L乙酸浸泡并搅拌3h，加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为5％，持续搅拌酶解72h，得到酶解液；

[0041] S2：将S1中得到的酶解液在4℃条件下以10000rpm的速度离心20min，收集上清液，得到胶原蛋白粗提液；

[0042] S3：将S2中得到的胶原蛋白粗提液用20％氢氧化钠溶液调节pH在6‑8之间静置过夜，在4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，收集胶原蛋白沉淀；

[0043] S4：将S3中得到的胶原蛋白沉淀再次溶解在0.5mol/L乙酸中，待其完全溶解后进行超滤纯化，即得到纯化的胶原蛋白。

[0044] 与现有技术相比本发明的有益效果在于：

[0045] (1)本发明针对跟腱预处理工艺进行了长期的研究，发现预处理工艺对胶原蛋白的性能具有较大的影响，本发明通过长期创造性的研究发现，合理选择预处理过程中的试
剂，通过合理配比，控制各种试剂的浓度会明显影响得到的胶原蛋白的三螺旋结构，本发明
在预处理步骤中先后使用过氧乙酸、磷酸三丁酯、吐温80、氢氧化钠、TritonX‑114、氯化钠
和碳酸钠等溶液进行浸泡能够更好的去除跟腱上的脂肪，提高胶原蛋白的纯度；

[0046] (2)本发明在预处理过程中控制混合溶液的具体组分，即采用磷酸三丁酯和吐温80混合、氢氧化钠和TritonX‑114混合、氯化钠和碳酸钠混合，磷酸三丁酯能有效的灭活病
毒，而吐温80作为一种表面活性剂则有助于磷酸三丁酯更好的与可能存在的病毒接触，灭
活后更充分的洗掉灭活后的病毒；氢氧化钠能去除内毒素，但是碱性太强，易导致蛋白质变
性，加入TritonX‑114混合处理能减轻氢氧化钠对蛋白质的影响而不影响去内毒素的效果；
碳酸钠能使组织变得蓬松，而氯化钠则能更好的穿透组织去掉残余的脂肪；另外，本发明提
供的试剂的浸泡顺序也会对跟腱中胶原蛋白的提取纯度、胶原蛋白三螺旋结构产生影响，
这可能是前后处理步骤的目的不同，更换顺序可能会造成胶原蛋白不可逆的损伤，影响最
终的结构和纯度。

附图说明

[0047] 图1为本发明实施例3中胶原‑乙酸溶液紫外扫描结果；

[0048] 本实验采用紫外分光光谱分析，胶原溶液在220～230nm处有一个吸收峰，这个吸收峰是由于电子的跃迁产生的强吸收，从胶原紫外扫描结果可以看出我们的最大吸收峰约
225nm，证明得到的胶原三螺旋结构完整。

[0049] 图2为本发明实施例3中胶原溶液SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

[0050] 本发明中提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所解释的所有特征可与任意方法形式并用，说明书中揭示的各个特征，可被任何可提供相同、均
等或相似目的的取代性特征取代。因此除有特殊说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征
的一般性例子。

[0051] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件或按
照制造厂商所建议的条件。除非特殊说明，否则所有的百分比和分数按重量计。

[0052] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中
所述的优选实施方法与材料仅做示范作用。

[0053] 实施例1一种高纯度胶原蛋白提取工艺

[0054] 包括以下步骤：

[0055] (1)跟腱预处理步骤；

[0056] 所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

[0057] ①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用70％酒精浸泡10分钟，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

[0058] ②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

[0059] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0060] 第一步：采用0.2％过氧乙酸浸泡5分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0061] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0062] 第三步：用0.2％磷酸三丁酯和0.1％吐温80混合溶液浸泡6分钟，用纯化水清洗三次；

[0063] 第四步：用0.1％氢氧化钠和0.1％TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0064] 第五步：用0.9％氯化钠和0.1％碳酸钠混合溶液浸泡2.5小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0065] (2)胶原蛋白提取纯化步骤；

[0066] S1：取跟腱粉末样品用0.5mol/L乙酸浸泡并搅拌3h，加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为5％，持续搅拌酶解72h，得到酶解液；

[0067] S2：将S1中得到的酶解液在4℃条件下以10000rpm的速度离心20min，收集上清液，得到胶原蛋白粗提液；

[0068] S3：将S2中得到的胶原蛋白粗提液用20％氢氧化钠溶液调节pH在6‑8之间静置过夜，在4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，收集胶原蛋白沉淀；

[0069] S4：将S3中得到的胶原蛋白沉淀再次溶解在0.5mol/L乙酸中，待其完全溶解后进行超滤纯化，即得到纯化的胶原蛋白。

[0070] 实施例2一种高纯度胶原蛋白提取工艺

[0071] 包括以下步骤：

[0072] (2)跟腱预处理步骤；

[0073] 所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

[0074] ①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用75％酒精浸泡3分钟，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

[0075] ②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

[0076] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0077] 第一步：采用0.5％过氧乙酸浸泡2分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0078] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0079] 第三步：用0.5％磷酸三丁酯和0.5％吐温80混合溶液浸泡3分钟，用纯化水清洗三次；

[0080] 第四步：用0.3％氢氧化钠和0.5％TritonX‑114混合溶液浸泡2分钟，纯化水清洗三次；

[0081] 第五步：用0.9％氯化钠和0.5％碳酸钠混合溶液浸泡1.5小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0082] (2)胶原蛋白提取纯化步骤；

[0083] S1：取跟腱粉末样品用0.5mol/L乙酸浸泡并搅拌3h，加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为5％，持续搅拌酶解72h，得到酶解液；

[0084] S2：将S1中得到的酶解液在4℃条件下以10000rpm的速度离心20min，收集上清液，得到胶原蛋白粗提液；

[0085] S3：将S2中得到的胶原蛋白粗提液用20％氢氧化钠溶液调节pH在6‑8之间静置过夜，在4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，收集胶原蛋白沉淀；

[0086] S4：将S3中得到的胶原蛋白沉淀再次溶解在0.5mol/L乙酸中，待其完全溶解后进行超滤纯化，即得到纯化的胶原蛋白。

[0087] 实施例3一种高纯度胶原蛋白提取工艺

[0088] 包括以下步骤：

[0089] (1)跟腱预处理步骤；

[0090] 所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤：

[0091] ①将跟腱解冻，去除血水和表面筋膜，纯化水清洗后，用75％酒精浸泡8分钟，然后用纯化水冲洗三遍，放入冰箱中，冷冻备用；

[0092] ②待跟腱完全冻硬后取出，将跟腱表面残余的脂肪膜去掉，然后进行切片处理，得到跟腱切片；

[0093] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0094] 第一步：采用0.4％的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0095] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0096] 第三步：用0.4％的磷酸三丁酯和0.2％的吐温80混合溶液浸泡5分钟，用纯化水清洗三次；

[0097] 第四步：用0.3％的氢氧化钠和0.2％的TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0098] 第五步：用0.9％的氯化钠和0.3％的碳酸钠混合溶液浸泡2小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1mm的粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0099] (2)胶原蛋白提取纯化步骤；

[0100] S1：取跟腱粉末样品用0.5mol/L乙酸浸泡并搅拌3h，加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为5％，持续搅拌酶解72h，得到酶解液；

[0101] S2：将S1中得到的酶解液在4℃条件下以10000rpm的速度离心20min，收集上清液，得到胶原蛋白粗提液；

[0102] S3：将S2中得到的胶原蛋白粗提液用20％氢氧化钠溶液调节pH在6‑8之间静置过夜，在4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，收集胶原蛋白沉淀；

[0103] S4：将S3中得到的胶原蛋白沉淀再次溶解在0.5mol/L乙酸中，待其完全溶解后进行超滤纯化，即得到纯化的胶原蛋白。

[0104] 对比例1

[0105] 与实施例3的区别在于：

[0106] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0107] 第一步：采用0.4％的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0108] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0109] 第三步：用0.4％的磷酸三丁酯浸泡5分钟，用纯化水清洗三次；

[0110] 第四步：用0.3％的氢氧化钠浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0111] 第五步：用0.9％的氯化钠混合溶液浸泡2小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1mm的粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0112] 对比例2

[0113] 与实施例3的区别在于：

[0114] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0115] 第一步：采用0.4％的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0116] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0117] 第三步：用0.2％的吐温80混合溶液浸泡5分钟，用纯化水清洗三次；

[0118] 第四步：用0.2％的TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0119] 第五步：用0.3％的碳酸钠混合溶液浸泡2小时，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1mm的粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0120] 对比例3

[0121] 与实施例3的区别在于：

[0122] ③取跟腱切片进行以下处理：

[0123] 第一步：采用0.4％的过氧乙酸浸泡3分钟，然后用纯化水清洗三次；

[0124] 第二步：重复步骤a处理一次；

[0125] 第三步：用0.3％的氢氧化钠和0.2％的TritonX‑114混合溶液浸泡5分钟，纯化水清洗三次；

[0126] 第四步：用0.9％的氯化钠和0.3％的碳酸钠混合溶液浸泡2小时，

[0127] 第五步：用0.4％的磷酸三丁酯和0.2％的吐温80混合溶液浸泡5分钟，用纯化水清洗三遍后，将跟腱碎片冻干后研磨成粒径为0.1mm的粉末，得到跟腱粉末，备用。

[0128] 对比例4

[0129] 与实施例3的区别在于：

[0130] 采用中国专利申请201811465406.1中公开的处理方法对跟腱进行预处理。

[0131] 效果实验

[0132] 1、纯度检测

[0133] 测试方法：根据SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)银染法及凝胶成像系统进行纯度的检测计算。

[0134] 检测结果：

[0135] 表一胶原溶液纯度比较

[0136]   纯度％实施例1 98.5
实施例2 98.8
实施例3 99.5
对比例1 97.2
对比例2 97.5
对比例3 98.0
对比例4 97.8

[0137] 根据上表一的检测数据可以看出，本发明实施例1‑3得到的胶原蛋白的纯度明显高于对比例1‑4，尤其是实施例3中得到的胶原蛋白通过控制各种试剂的最优浓度比，明显
提高了胶原蛋白的纯度；对比例1和对比例2中切片处理后每步仅使用一种试剂进行处理，
得到的胶原蛋白纯度较实施例3明显降低，对比例3中虽然每一步使用两种试剂，但是改变
了试剂的处理顺序造成胶原蛋白不可逆的损伤，也在一定程度上影响了胶原蛋白的纯度，
对比例4中采用的试剂与本申请不同，得到的胶原蛋白的纯度不如本申请。

[0138] 另外，根据图2也可以看出本发明实施例3提取得到的胶原蛋白与对照品相同，检测杂蛋白含量基本为零，说明本发明实施例3制备的胶原蛋白具有较高的纯度。

[0139] 2、安全性检测

[0140] 检测方法：依据《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》2017年修订版。

[0141] 检测结果判定：至少有一个步骤病毒去除/灭活降低系数需达到4logs以上，且总降低系数达到6logs以上。

[0142] 表二预处理后病毒灭活检测结果

[0143]

[0144] 表三持续搅拌酶解72h后病毒灭活检测

[0145]

[0146] 由此可见，以上提取纯化工艺两步病毒灭活检测结果远超出最终病毒灭活要求。

[0147] 3、跟腱预处理后微生物和内毒素含量检测

[0148] 检测方法：无菌按照《中华人民共和国药典(二部)》(2020年版)附录XI H规定的方法进行检测；细菌内毒素含量按《中华人民共和国药典(二部)》(2020年版)附录XIE规定的
方法进行检测。

[0149] 检测结果：

[0150] 表四预处理后菌落数和内毒素检测结果比较

[0151]

[0152]

[0153] 根据上表四的检测数据可以看出，本发明实施例1‑3得到的胶原蛋白的菌落数和内毒素明显低于对比例1‑4，尤其是实施例3中得到的胶原蛋白通过控制各种试剂的最优浓
度比，明显降低了胶原蛋白的菌落数和内毒素；对比例1和对比例2中切片处理后每步仅使
用一种试剂进行处理，得到的胶原蛋白安全性较实施例3明显降低，对比例3中虽然每一步
使用两种试剂，但是改变了试剂的处理顺序也在一定程度上影响了胶原蛋白的菌落数和内
毒素，对比例4中采用的试剂与本申请不同，得到的胶原蛋白的纯度不如本申请。

[0154] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本
发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变
化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其
等效物界定。