一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法

摘要

本发明提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法。所述引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种。本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，该引物组能够精准、快速地检测水稻干尖线虫，且具有较高的灵敏度和特异性。该方法可以高效检测到最低浓度为1copy/μL的样品，而且可以通过增加反应时间，来提高荧光值，从而提高检测结果的准确性，能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。

权利要求

1.一种检测水稻干尖线虫的方法，其特征在于，所述方法包括采用引物组进行检测，所述引物组包括：第五crRNA、第一上游引物、第一下游引物和报告基团，所述第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，所述报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：采用RPA扩增水稻干尖线虫DNA，得到RPA扩增产物；

将所述RPA扩增产物采用如权利要求1所述的引物组进行检测。

说明书

一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病原检测领域，更具体地，涉及检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法。

背景技术

[0002] 水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie，1942)属于滑刃线虫属，水稻干尖线虫为细长的蠕虫形，半透明，长度大约在620～880μm之间。水稻干尖线虫主要寄生在植物的地上部分，会危害植物的生长发育。水稻是水稻干尖线虫的最主要寄主，发病时水稻会出现“干尖”病或“白尖”病，并降低水稻的产量，严重时会使水稻减产50％以上。中国是世界上最大的稻米生产国，水稻干尖线虫广泛分布于我国大陆，并且近十多年来，该病害的危害也越来越严重，目前已经遍布于我国的各个主要稻作区。水稻干尖线虫潜伏在谷粒的颖壳和米粒间越冬，因而带虫的种子是本病主要初侵染源，一旦水稻干尖线虫病发生，就很难有好的手段记性彻底防控。所以，通过早期检测选用无病种子是简单易行且快速有效的预防措施。

[0003] 目前，已经开发出的水稻干尖线虫的检测方法，包括荧光定量PCR和普通PCR等。目前，荧光定量PCR是检测水稻干尖线虫较为有效的方法，但是，对于核酸含量极低即Ct值在30‑40的样品，无法百分百确定样品阴阳性。对于水稻干尖线虫量极少的水稻种子是无法实现早期检测的。

发明内容

[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。

[0005] 一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，所述引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种，所述第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

[0006] 具体地，所述引物组还包括：第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

[0007] 具体地，所述引物组还包括：报告基团，所述报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

[0008] 另一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的体系，所述体系包括上述引物组。

[0009] 又一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

[0010] 再一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的方法，所述方法包括采用上述引物组进行检测。

[0011] 具体地，所述方法还包括：采用RPA扩增水稻干尖线虫DNA，得到RPA扩增产物；

[0012] 将所述RPA扩增产物采用上述引物组进行检测。

[0013] 本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，该引物组能够精准、快速地检测水稻干尖线虫，且具有较高的灵敏度和特异性。本发明实施例采用的引物组的序列较短，一般情况下第一上游引物和第一下游引物的长度分别为35个碱基左右，在保证扩增效果的基础上，本发明实施例提供的第一上游引物和第一下游引物的序列长度均控制在30～31个碱基，从而降低第一上游引物和第一下游引物的合成成本。同时，该检测方法对于水稻干尖线虫含量极低的弱阳性及疑似阳性样品的高效检测，该方法可以高效检测到最低浓度为1copy/μL的样品，而且可以通过增加反应时间，来提高荧光值，从而提高检测结果的准确性，这使得该方法能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。而且，本发明实施例提供的方法不需要昂贵的仪器设备，大大降低了检测成本。进行检测时只需要水浴锅或恒温培养箱及荧光检测仪，可节省荧光定量PCR仪器的昂贵费用。

[0014] 本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

[0015] 附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

[0016] 图1是本发明实施例一提供的琼脂糖凝胶电泳图。

[0017] 图2是本发明实施例一提供的Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量的CRISPR/Cas12a检测20min的荧光值图。

[0018] 图3是8个crRNA对标准质粒样品CRISPR/Cas12a检测0‑60min的荧光值图。

[0019] 图4是本发明实施例一提供的CRISPR/Cas12a检测20min的检测浓度图。

[0020] 图5是本发明实施例一提供的荧光定量PCR的检测浓度的Ct值图。

[0021] 图6是本发明实施例一提供的荧光定量PCR的扩增曲线图。

[0022] 图7是本发明实施例二提供的Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量的CRISPR/Cas12a检测0‑60min的不同样品浓度的荧光值图。

具体实施方式

[0023] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0024] 一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种，第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。在本实施例中第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0025] 具体地，引物组还包括：第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

[0026] 具体地，引物组还包括：报告基团，报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

[0027] 另一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的体系，体系包括上述引物组。

[0028] 又一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的试剂盒，试剂盒包括上述引物组。

[0029] 再一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的方法，方法包括采用上述引物组进行检测。

[0030] 具体地，该方法还包括：采用RPA扩增目标DNA，得到RPA扩增产物；将所述RPA扩增产物采用上述引物组进行检测。

[0031] 实施例一

[0032] 一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，引物组包括：第五crRNA，第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

[0033] 具体地，引物组还包括：第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

[0034] 具体地，引物组还包括：报告基团，报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

[0035] 另一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的试剂盒，试剂盒包括上述引物组。

[0036] 再一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的方法，方法包括采用上述引物组进行检测。

[0037] 具体地，该方法还包括：提取待测的水稻干尖线虫DNA，采用RPA扩增水稻干尖线虫DNA，得到RPA扩增产物；将所述RPA扩增产物采用上述引物组进行检测。

[0038] 更具体地，水稻干尖线虫DNA的提取方法包括：

[0039] 取容积为200μL的离心管，向该离心管中加入8μLddH2O(双蒸水)和1μL无Mg2+的10×PCR Buffer，挑取单条水稻干尖线虫放入该离心管中，将离心管置于液氮中冰冻1min，然后置于85℃下2min，向离心管中加入1μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，采用移液枪轻轻吸打混匀并进行离心，然后将离心管置于56℃下15min，95℃下10min，吸取上清液，得到水稻干尖线虫DNA，将该上清液作为扩增DNA的模板。

[0040] 另一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的体系，体系包括上述引物组。采用该检测水稻干尖线虫的体系分别对阳性对照(PC)、ddH2O、未感染水稻干尖线虫的水稻叶片(Rice Leaf，来源于上海市农业科学院庄行试验站2020年正季田间种植材料)、南方根结线虫(Meloidogyne，来源于南京农业大学)和2份水稻干尖线虫样品(Sample1和Sample2，分别来源于南京农业大学和上海市农业科学院)进行检测。

[0041] 具体地，该体系包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，其中，RPA扩增体系如表1所示。

[0042] 表1为RPA扩增体系

[0043]

[0044] 即表1中待测样品分别为阳性对照、2份水稻干尖线虫样品、ddH2O、水稻叶片和南方根结线虫。在本实施例中，阳性对照为水稻干尖线虫18S核糖体RNA的非常保守的237bp序列并连接在pUC57载体上构建的标准质粒，该阳性对照的序列如序列表中SEQ ID NO：12所示。2份水稻干尖线虫样品的DNA和南方根结线虫的DNA均采用上述水稻干尖线虫DNA的提取方法获得，水稻叶片的DNA提取采用CTAB法。将除了280mM MgOAc以外的其他组分混合，得到TM混合液，该混合液的体积为47.5μL，并将该混合液转移到装有冻干酶粉的TwistAmp Basic反应管中，用移液枪吹打至冻干酶粉完全溶解，然后加入2.5μL 280mM MgOAc并混匀，将TM
TwistAmp  Basic反应管放在39℃恒温培养箱中培养20min，完成RPA扩增，分别得到RPA扩增产物，将该RPA扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，其检测结果如图1所示。

[0045] CRISPR/Cas12a检测体系如表2所示。

[0046] 表2为CRISPR/Cas12a检测体系

[0047]

[0048] 表2中LbCas12a购自于南京有晴生物科技有限公司。

[0049] 将CRISPR/Cas12a检测体系分别加入到96孔酶标板中，封膜后进行避光培养20min，培养结束后用Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量荧光值。具体地，检测波长为λex：530nm；λem：565nm。其测量结果如图2所示，由图2可知，本发明实施例一提供的检测水稻干尖线虫的体系对水稻干尖线虫具有较高的特异性。

[0050] 在本实施例中，如图3所示，第五crRNA的荧光值较高，且反应5～10min即可达到较高的荧光值，当反应30min即可达到最高的荧光值，说明第五crRNA的质量较高。

[0051] 检测水稻干尖线虫的体系的灵敏度，具体如下：

[0052] 将水稻干尖线虫DNA按照10倍的倍比依次稀释至108‑100copies/μL浓度，然后分别用本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a检测体系和荧光定量PCR法进行检测，检测时，所选用的正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO：13所示，所选用的反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，检测的扩增体系如下：模板DNA 1μL，2×SYBR Green PCR Master Mix(TOYOBO公司)5μL，正向引物Primer‑F(10μM)0.5μL，反向引物Primer‑R(10μM)0.5μL，ddH2O3μL，共10μL。检测的扩增程序为：(1)95℃1min；(2)每个循环为：95℃15s，60℃15s，共计40个循环；(3)72℃1min。结果如图4至图6所示，由图4可知，随着稀释倍数的升高，其荧光值越来越低，当稀释到浓度为1copy/μL时，本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a检测体系仍能检测到较高的荧光值。结合图5和图6可知，采用荧光定量PCR进行检测时，随着稀释倍数的升高，Ct值逐渐增大，当稀释到浓度为10copies/μL时，平均Ct值为35.32，此时较难准确判定检测样品的阴阳性，而稀释至浓度为1copy/μL时，无扩增曲线和Ct值，即浓度为10copies/μL是荧光定量PCR的最低检测浓度。上述两种方法比较可知，可见本发明实施例二提供的CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度最高。

[0053] 实施例二

[0054] 本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA，第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

[0055] 具体地，引物组还包括：第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

[0056] 具体地，引物组还包括：报告基团，报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

[0057] 另一方面，本发明实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的体系，体系包括上述引物组。

[0058] 具体地，该体系包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，其中，RPA扩增体系与本发明实施例一提供的RPA扩增体系相同。本实施例提供的待测样品为分别为阳性对照、2份水稻干尖线虫样品、ddH2O、水稻叶片和南方根结线虫。在本实施例中，阳性对照为基因合成的水稻干尖线虫特异片段。2份水稻干尖线虫样品采用上述水稻干尖线虫DNA的提取方法获得。将除了280mM MgOAc以外的其他组分混合，得到混合液，该混合液的体积为47.5μL，TM
并将该混合液转移到装有冻干酶粉的TwistAmp  Basic反应管中，用移液枪吹打至冻干酶TM
粉完全溶解，然后加入2.5μL 280mM MgOAc并混匀，将TwistAmp  Basic反应管放在39℃恒温培养箱中培养20min，完成RPA扩增，得到RPA扩增产物，将该RPA扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

[0059] CRISPR/Cas12a检测体系如表3所示。

[0060] 表3为CRISPR/Cas12a检测体系

[0061]

[0062]

[0063] 表3中LbCas12a购自于南京有晴生物科技有限公司。

[0064] 将CRISPR/Cas12a检测体系分别加入到96孔酶标板中，封膜后进行避光培养1h，培养结束后用Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量荧光值。具体地，检测波长为λex：530nm；λem：565nm。其测量结果如图6所示，由图6可知，本发明实施例二提供的检测水稻干尖线虫的体系对水稻干尖线虫具有较高的特异性。

[0065] 检测水稻干尖线虫的体系的灵敏度，具体如下：

[0066] 将水稻干尖线虫DNA依次稀释至108‑100copies/μL浓度，然后分别用本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a检测体系。结果如图7所示，由图7可知，随着稀释倍数的升高，其荧光值越来越低，当稀释到浓度为1copy/μL时，本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a检测体系仍能检测到较高的荧光值，即本发明实施例二提供的CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度最高。

[0067] 虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

[0068]

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]