菠萝叶片高效离体再生方法

摘要

本发明涉及植物再生领域，具体涉及菠萝叶片高效离体再生方法。本发明以菠萝幼嫩叶片为起始外植体材料，培养条件配合合理的激素配方，诱导叶片产生愈伤组织，并能够产生大量的不定芽，在此基础上进一步采取分阶段的诱导分化和不定芽和伸长，使得分化和不定芽伸长更有效。通过本发明的方法，能够在短时间内生产大量的菠萝优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。通过建立以菠萝叶片为起始外植体的离体再生系统，对开展菠萝遗传改良、新品种(系)培育和优质种苗繁殖等研究，具有深远意义。

权利要求

1.一种菠萝叶片高效离体再生方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）愈伤组织诱导：

a) 取菠萝消毒后的幼嫩无菌叶片或组培苗的叶片接种至愈伤诱导培养基I，所述愈伤诱导培养基I是MS基本培养基+2‑4mg/L 6‑BA+0.2‑0.4mg/L NAA+0.1 g/L肌醇，暗培养10‑

20天；

b) 将上述暗培养后的材料转入愈伤诱导培养基II，所述愈伤诱导培养基II是MS基本培养基+2‑3mg/L NAA+0.2‑0.3mg/L 6‑BA+0.5‑1.5mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L脯氨酸，光照培养；

（2）不定芽诱导：将第（1）步获得的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基I，所述不定芽诱导培养基I是MS基本培养基+1.5‑2.5mg/L 6‑BA与0.15‑0.25 mg/L NAA+0.1 g/L肌醇，光照培养，每日32℃‑37℃培养12‑18 h和22℃‑28℃培养6‑12 h，培养10‑20天后转入不定芽诱导培养基II，所述不定芽诱导培养基II是MS培养基+0.3‑1mg/L 6‑BA+0.03‑0.1 mg/L NAA+

0.1 g/L肌醇，培养20‑35天；

（3）不定芽伸长：将第（2）步获得的不定芽转入不定芽伸长培养基，所述不定芽伸长培养基是MS基本培养基+0.1‑0.5mg/L 6‑BA+0.01‑0.05 mg/L NAA+0.01‑0.1 mg/L独脚金内酯+0.1 g/L肌醇，光照培养20‑40天；

（4）生根培养：将第（3）步中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，诱导生根实现再生。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基I中 6‑BA为3mg/L，NAA为0.3mg/L。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基II中 NAA为2mg/L，6‑BA为0.2mg/L，TDZ为1mg/L。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，不定芽诱导培养基I中 6‑BA 2mg/L， NAA为

0.2 mg/L，光照培养，每日35℃培养15‑17 h和25℃培养7‑9 h。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，不定芽诱导培养基II中6‑BA为0.5mg/L，NAA为0.05 mg/L。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽伸长培养基中 6‑BA为0.3mg/L，NAA为0.03 mg/L，独脚金内酯为0.05 mg/L。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基是1/2MS基本培养基+0.1‑1 mg/L吲哚丁酸，培养14‑21 d至生根。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：（5）炼苗：挑选步骤（4）中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5‑

1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2‑3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：（6）移栽：将步骤（5）炼苗后再生苗进行移栽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述移栽中，移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石=3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。

12.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述光照培养的光照强度为

2000‑3000lx。

说明书

菠萝叶片高效离体再生方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物再生领域，具体涉及菠萝叶片高效离体再生方法。

背景技术

[0002] 菠萝(Ananascomosus(Linn.)Merr.)又名凤梨、黄梨，原产美洲热带地区，世界第二大热带水果(鄂晓丹.主干形桃树新栽培技术研究[J].中国林副特产，2010(2)：49‑50)；
中国菠萝年收获面积居世界第四位，产量居世界第六位，其产区主要分布在广东、海南、广
西、福建、云南等省(石伟琦，孙伟生，习金根，陈菁，左雪冬.我国菠萝产业现状与发展对策
[J].广东农业科学，2011,38(03):181‑186)。目前，国内菠萝主栽品种种性退化严重，品质
外观欠佳，采后处理落后，加工水平偏低，产业链条延展性差，优质菠萝进口依存度高(金
琰.2015年中国菠萝产业发展报告及形势预测[J].世界热带农业信息，2016(09):16‑24)。
菠萝是异花授粉植物，存在基因组杂合度高、遗传基础窄、育种周期长、花期不同步、育种周
期过长等问题(Roostika I,Khumaida N,Ardie S W.RAPD analysis to detect 
somaclonal variation of pineapple in vitro cultures during micropropagation
[J].Biotropia,2015,22(2)：109‑119)，难以在短期内育成集高产量、品味佳、抗逆性强等
特性的新种质。目前，菠萝的离体再生研究主要集中在组培快繁、体细胞发生和器官发生等
方面，尤其组织培养成为菠萝优质种苗生产的重要技术手段。研究人员虽然建立了部分菠
萝品种的再生体系(Global DNA Methylation Levels During the Development of 
Nodule Cluster Cultures and Assessment of Genetic Fidelity of In Vitro‑
Regenerated Pineapple Plants(Ananas comosus var.comosus)[J].Journal of Plant 
Growth Regulation,2015,34(3):677‑683)。但目前的研究主要以菠萝冠芽和吸芽为外植
体，其外植体数量有限、来源易受限制，并且再生效果有待提高，实用性还不够强，尚不能推
广应用。

[0003] 由此可知，目前仍然没有找到高效的再生体系，菠萝诱变育种、新品种(系)培育和优质种苗繁殖受到限制，因此有必要建立高效再生体系以达到缩短育种周期、定向改良性
状的目的。

发明内容

[0004] 本发明以菠萝幼嫩叶片为起始外植体材料，因而使得整个再生体系能够有效的基础。另一方面，在诱导分化方面，经过大量研究筛选，培养条件配合合理的激素配方，诱导叶
片产生愈伤组织，并能够产生大量的不定芽，在此基础上进一步采取分阶段的诱导分化和
不定芽和伸长，使得分化和不定芽伸长更有效。通过本发明的方法，能够在短时间内生产大
量的菠萝优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。由此获得大量菠萝
再生植株表型一致性高，一方面可以以此再生系统作为诱变育种的受体系统诱导新品种
(系)，一方面可以以此再生系统做为转基因的受体系统进一步制备转基因植株，使之既能
保持亲本的遗传表型，又具有所转入的外源目的基因的性状。通过建立以菠萝叶片为起始
外植体的离体再生系统，对开展菠萝遗传改良、新品种(系)培育和优质种苗繁殖等研究，具
有深远意义。

[0005] 本发明提供一种菠萝叶片高效离体再生方法，其包括如下步骤：

[0006] (1)愈伤组织诱导：取菠萝消毒后的幼嫩无菌叶片或组培苗的叶片接种至愈伤诱导培养基Ⅰ，其以MS作为基本培养基，添加2‑4mg/L 6‑BA与0.2‑0.4mg/L NAA，优选添加3mg/
L 6‑BA与0.3mg/L NAA，暗培养10‑20天；将上述暗培养后的材料转入培养基愈伤诱导培养
基Ⅱ，其MS作为基本培养基，添加2‑3mg/L NAA、0.2‑0.3mg/L 6‑BA、0.5‑1.5mg/L TDZ、
0.5g/L脯氨酸，优选添加2mg/L NAA、0.2mg/L 6‑BA、1mg/L TDZ、0.5g/L脯氨酸，光照培养
20‑30天。

[0007] (2)不定芽诱导：将(1)获得的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，其以MS作为基本培养基，添加1.5‑2.5mg/L 6‑BA与0.15‑0.25mg/L NAA，优选2mg/L 6‑BA与0.2mg/L 
NAA，光照培养，每日32℃‑37℃12‑18h和25℃6‑12h，优选的每日35℃15‑17h和25℃7‑9h，
10‑20天后转入MS培养基，添加0.3‑1mg/L 6‑BA与0.03‑0.1mg/L NAA，优选0.5mg/L 6‑BA与
0.05mg/L NAA，培养20‑35天。

[0008] (3)不定芽伸长：将(2)获得的不定芽转入不定芽伸长培养基中，其以MS作为基本培养基，添加0.1‑0.5mg/L 6‑BA、0.01‑0.05mg/L NAA，0.01‑0.1mg/L 独角金内酯
(strigolactone,SL)，光照培养20‑40天，优选添加0.3mg/L 6‑BA、0.03mg/L NAA，0.05mg/L
独角金内酯。

[0009] (4)生根培养：将(3)中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中。优选地，所述生根培养基使用1/2MS作为基本培养基，添加0.1‑1mg/L添吲哚丁酸(IBA)。14‑21d
可生根。

[0010] 优选地，进一步包括(5)炼苗：挑选(4)中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，优选地炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5‑1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2‑3天，将
瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。

[0011] 更进一步包括(6)移栽，优选地，移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，
待苗生长强健后除去套袋，正常养护。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。

[0012] 其中，上述步骤中培养条件为，所有培养基均添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。除特别说明外，培养条件为25‑28℃，光照强度2000‑
3000lx，光照16h/d。

[0013] 本发明方法中，两步诱导法的愈伤诱导率可达100％；最佳不定芽诱导培养基中，增殖率达93.17％，平均芽数32.83个/外植体，而不定芽伸长率达100％。此外，本发明的生
根环节中仅需14‑21d可生根，生根诱导率达100％，平均生根条数3‑5条。因此，本发明建立
以菠萝幼嫩叶片为起始外植体材料，培养条件配合合理的激素配方，诱导叶片产生愈伤组
织，并能够产生大量的不定芽，在此基础上进一步采取分阶段的诱导分化和不定芽和伸长，
使得分化和不定芽伸长更有效。通过本发明的方法，能够在短时间内生产大量的菠萝优质
种苗。通过建立以菠萝叶片为起始外植体的离体再生系统，对开展菠萝遗传改良、新品种
(系)培育和优质种苗繁殖等研究，具有深远意义。

附图说明

[0014] 图1菠萝叶片起始外植体。

[0015] 图2实施例1中两步培养的菠萝叶片愈伤诱导的愈伤(疏松，未添加脯氨酸)。

[0016] 图3实施例1中两步培养的菠萝叶片愈伤诱导的愈伤(致密，添加脯氨酸)。

[0017] 图4实施例2中处理2的不定芽诱导。

[0018] 图5实施例2中处理5的不定芽诱导。

[0019] 图6实施例2中处理4的不定芽诱导。

[0020] 图7实施例2中处理6的不定芽诱导。

[0021] 图8实施例2中处理7的不定芽诱导。

[0022] 图9实施例3中不定芽伸长(未添加SL)。

[0023] 图10实施例3中不定芽伸长(添加SL)。

[0024] 图11实施例4中不定芽生根。

[0025] 图12实施例4中不定芽生根底面观。

具体实施方式

[0026] 下面通过具体实施方式对本发明进行阐述，以期对本发明的更好的理解，但并不构成对本发明的限制。

[0027] 实施例1、愈伤组织诱导

[0028] 取菠萝消毒后的幼嫩无菌叶片或组培苗的叶片(图1)进行愈伤组织诱导实验，以MS为基本培养基，设置不同实验处理(详见表1)，所有处理为暗培养。

[0029] 实验结果表明：培养基添加2‑4mg/L 6‑BA与0.2‑0.4mg/L NAA，均能诱导出愈伤组织，添加3mg/L 6‑BA、0.3mg/L NAA或添加3mg/L 6‑BA与0.4mg/L NAA的诱导效果最佳，培养
40d开始诱导出愈伤组织，培养60d的愈伤诱导率为65‑66％。

[0030] 为进一步提高愈伤诱导率，进行两步培养，先将菠萝叶片在添加3mg/L 6‑BA与0.3mg/L NAA的培养基培养，暗培养14天后转接至添加1‑3mg/L NAA、0.1‑0.3mg/L 6‑BA、
0.5‑1.5mg/L TDZ培养基中培养(详见表2)。结果表明，经过两步培养的菠萝叶片愈伤诱导
率显著提高，达100％，且与一步诱导相比，开始形成愈伤组织时间缩短，但愈伤组织较为松
散(采用愈伤组织诱导Ⅱ的配方诱导后的状态，其中没有添加脯氨酸)(图2)，但在愈伤组织
诱导Ⅱ的配方基础上进一步优化，加入0.5g/L脯氨酸，可提高愈伤组织致密度(图3)，利于
后续诱导不定芽。

[0031] 表1不同植物激素组合对叶片愈伤诱导的影响

[0032]

[0033] 表2不同植物激素组合对叶片愈伤诱导的影响

[0034]

[0035]

[0036] 实施例2、不定芽诱导

[0037] 将实施例1获得的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中。不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加1.5‑2.5mg/L 6‑BA与0.15‑0.25mg/L NAA，处理1‑3，25℃光照培
养；处理4，进行热处理，35℃16h，25℃8h，结果如表3所示。分析表明同样的激素水平下，热
处理培养的不定芽诱导效果显著优于在25℃下的常温培养(图4‑6)。在此基础上进行进一
步优化不定芽诱导效率，在处理4中培养14天的材料转接至入MS培养基，添加0.3‑1mg/L 6‑
BA与0.03‑0.1mg/L NAA(处理6、7、8)，优选0.5mg/L 6‑BA与0.05mg/L NAA，培养30天，不定
芽诱导率达93.17％，平均芽数32.83个/外植体(图7、8)。

[0038] 表3不同处理对不定芽诱导的影响

[0039]

[0040]

[0041] 实施例3、不定芽伸长

[0042] 将实施例2获得的不定芽转入不定芽伸长培养基中。不定芽伸长培养基使用MS作为基本培养基，添加0.1‑0.5mg/L 6‑BA、0.01‑0.05mg/L NAA，0.01‑0.1mg/L独角金内酯
(strigolactone,SL)(详见表4)，光照培养30天。结果表明，不同植物激素组合均可诱导菠
萝不定芽伸长，但不同组合诱导效果不同，添加SL的培养基组合不定芽伸长率(图10)显著
高于只添加6‑BA、NAA的激素组合(图9)，添加0.3mg/L 6‑BA、0.03mg/L NAA，0.05mg/L SL组
合的不定芽伸长效果最佳，不定芽伸长率达100％。

[0043] 表4不同植物激素组合对不定芽伸长的影响

[0044]

[0045]

[0046] 实施例4、生根培养

[0047] 将实施例3中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导，生根培养基使用1/2MS作为基本培养基，添加0.1‑1mg/L添吲哚丁酸(IBA)。14‑21d可生
根，生根诱导率达100％，平均生根条数3‑5条(图11、12)。

[0048] 实施例5、炼苗与移栽

[0049] 将实施例4中获得的已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5‑1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2‑3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培
养基洗净，准备移栽。移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水
中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除
去套袋，正常养护。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。