用于肝损伤保护的药物组合物及其应用

摘要

本发明属于医药领域，涉及一种用于肝损伤保护的药物组合物及其应用，该用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参、仙鹤草、当归、重楼、南沙参以及桔梗制备而成。本发明提供了一种具有良好的促肝细胞增殖活性、减轻肝细胞氧化损伤活性及抗肝纤维化活性的用于肝损伤保护的药物组合物及其应用。

权利要求

1.一种用于肝损伤保护的药物组合物，其特征在于：所述用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参20‑30份、仙鹤草20‑30份、当归10‑20份、重楼10‑20份、南沙参10‑20份以及桔梗10‑20份制备而成。

2.根据权利要求1所述的用于肝损伤保护的药物组合物，其特征在于：所述用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参20份、仙鹤草30份、当归10份、重楼15份、南沙参15份以及桔梗10份制备而成。

3.一种基于如权利要求1或2所述的用于肝损伤保护的药物组合物制备得到的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物。

4.根据权利要求3所述的水提物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1）按原料药的配比称取西洋参、仙鹤草、当归、重楼、南沙参以及桔梗，得到原料药混合物；

2）原料药混合物煎煮3次，每次加入10倍量水，前两次煎煮每次1.5小时，第三次煎煮1小时，合并三次煎煮的水煎液，于60℃下真空减压浓缩至相对密度为1.05‑1.15的稠膏，喷雾干燥，收集细粉及喷雾干燥器内壁粘附的所有药粉，混匀，得水提物。

5.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备肝损伤保护药物时的应用。

6.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备促进肝细胞增殖活性药物时的应用。

7.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝细胞损伤活性药物时的应用。

8.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝细胞氧化损伤活性药物时的应用。

9.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备抗肝纤维化药物时的应用。

10.如权利要求3所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝纤维化药物时的应用。

说明书

用于肝损伤保护的药物组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种药物组合物及其应用，尤其涉及一种用于肝损伤保护的药物组合物及其应用。

背景技术

[0002] 慢性肝病是世界范围内发病率和死亡率较高的疾病。肝纤维化是由各种急性或慢性肝病，如乙型或丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂
肪性肝炎、胆道疾病、淤胆性肝病等多种疾病引起的组织病理学改变。肝损伤将导致肝星状
细胞(HSCs) 过度活跃，进而触发细胞外基质(ECM)合成增加，过多的胶原纤维沉积在肝细
胞的胞外间隙，导致肝细胞失去血液供应，如果不给予适当的重视和治疗，肝纤维化将进一
步发展为肝硬化，甚至肝癌。它是一种可逆性瘢痕形成的反应，以结节形成和器官收缩为其
重要特征，几乎所有的慢性肝脏疾病都可能引起肝纤维化发生。值得庆幸的是，肝纤维化的
过程是可逆的，即使在肝硬化晚期进行干预也可以改善临床结果。目前，肝纤维化的治疗原
则是去除病因、抗炎，治疗策略有抗HSCs活化、胶原降解和药物靶向治疗，但目前尚无特效
药用于治疗肝纤维化。中医药以其辨证论治、整体观的特点，在抗肝纤维化方面具有独特的
优势。

[0003] 中医认为，肝纤维化属“肝积”范畴，“积之成者，正气亏虚而后邪气踞之”(《医宗必读》)，多因正气虚损，外感六淫乘虚而入，而致气滞血瘀，日久而成。《诸病源候论·积聚病
诸候》提及“诸脏受邪，初未能成积聚，留滞不去，乃成积聚”，即指出了本病迁延日久的特
点。由此见正气虚弱、湿热邪毒、气血瘀阻等皆可致肝损伤，目前中医药在治疗方面，主要体
现于扶正祛邪，祛邪则重活血化瘀，通过益气养阴、清利湿热、活血化瘀等治法进行辨证用
药。现代研究报道，许多中草药具有抗肝纤维化、抗病毒、减轻肝细胞损伤、修复受损肝细
胞、降低转氨酶等作用。如丹酚酸、白芍总苷、水飞蓟素、柴胡、黄芪苷、黄芪多糖、苦参碱、黄
芩苷、大黄酸、当归多糖、五味子甲素、三七总皂苷、姜黄素等，均能减轻肝细胞和组织损伤，
修复受损肝细胞并促进其再生，改善炎症，有效降低转氨酶，恢复肝功能，部分相关制剂还
具有抗肝纤维化、抗病毒的作用。中医药可通过配伍用药，起减毒增效作用，发挥多成分、多
靶点、多通路干预疾病的特点，在对慢性损伤及需要长期用药的疾病有一定缓解功效，由
此，当前研究重点需放在研究保护肝损伤，尤其是逆转肝纤维化，干预、缓解肝硬化的作用
机制，寻找新的治疗靶点，开发新型治疗肝损伤且安全性高的药物。

发明内容

[0004] 为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种具有良好的促肝细胞增殖活性、减轻肝细胞氧化损伤活性及抗肝纤维化活性的用于肝损伤保护的药物组合物
及其应用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种用于肝损伤保护的药物组合物，其特征在于：所述用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参、仙鹤草、当归、重楼、南沙参以及桔梗制备而成。

[0007] 上述用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参20‑30份、仙鹤草20‑30份、当归10‑20 份、重楼10‑20份、南沙参10‑20份以及桔梗10‑20份制备而成，优选的，用于肝损伤
保护的药物组合物由原料药西洋参20份、仙鹤草30份、当归10份、重楼15份、南沙参15份以
及桔梗10 份制备而成。

[0008] 一种基于如前所述的肝损伤保护的药物组合物制备得到的肝损伤保护的药物组合物的水提物。

[0009] 如前所述的水提物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0010] 1)按原料药的配比称取西洋参、仙鹤草、当归、重楼、南沙参以及桔梗，得到原料药混合物；

[0011] 2)原料药混合物煎煮3次，每次加入10倍量水，前两次煎煮每次1.5小时，第三次煎煮1 小时，合并三次煎煮的水煎液，于60℃下真空减压浓缩至相对密度为1.05‑1.15的稠
膏，喷雾干燥，收集细粉及喷雾干燥器内壁粘附的所有药粉，混匀，得水提物。

[0012] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备肝损伤保护药物时的应用。

[0013] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备促进肝细胞增殖活性药物时的应用。

[0014] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝细胞损伤活性药物时的应用。

[0015] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝细胞氧化损伤活性药物时的应用。

[0016] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备抗肝纤维化药物时的应用。

[0017] 如前所述的用于肝损伤保护的药物组合物的水提物在制备减轻肝纤维化药物时的应用。

[0018] 本发明提供了用于肝损伤保护的药物组合物及其应用，该药物组合物是由西洋参、仙鹤草、南沙参、当归、重楼以及桔梗6味药组成，具有固本正源，扶正解毒，生血止血等
功效，故命名为“正源方”。方中西洋参、南沙参益气养阴，补益正气，仙鹤草、重楼清热解毒，
当归补血活血，桔梗祛痰排脓，多味药物配伍增强补益气血之效。此外，现代药理学研究表
明，西洋参中人参皂苷，当归中当归多糖，桔梗中桔梗多糖、桔梗皂苷，南沙参多糖等化合物
均具有保肝作用，仙鹤草、桔梗、重楼具有抗氧化、抗炎功效。本发明发现正源方对人正常肝
细胞有明显促增殖作用，以过氧化氢H2O2诱导L02肝细胞造成氧化损伤模型，给药后发现正
源方对H2O2损伤的肝细胞具有保护作用；经过本发明的作用，大鼠肝细胞脂肪变性现象明显
减轻，纤维母细胞及淋巴细胞数目减少，且胶原沉积数量减少，大鼠肝纤维化程度大大减
轻，说明正源方各剂量组对肝纤维化有明显修复作用具有良好的抗肝纤维化活性，有望研
发成为抗肝纤维化、肝损伤保护方面的新药。

附图说明

[0019] 图1是实施例2所得L02细胞存活率柱状图；

[0020] 图2是实施例3中不同浓度的正源方对H2O2诱导的L02肝细胞氧化损伤的保护作用柱状图；

[0021] 图3是实施例3中Hoechst 33342/PI荧光染色结果图；

[0022] 图4是实施例4中肝纤维化大鼠体质量变化图；

[0023] 图5是实施例4中肝纤维化大鼠肝脏/体质量比值图；

[0024] 图6是实施例4中肝纤维化大鼠脾脏/体重比值图；

[0025] 图7是实施例5中H&E、Masson染色病理切片示意图；

[0026] 图8是实施例6中肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶水平结果图；

[0027] 图9是实施例7中肝纤维化大鼠血清总蛋白、白蛋白水平结果图；

[0028] 图10是实施例8中肝纤维化大鼠血清总胆汁酸水平结果图；

[0029] 图11是实施例9中肝纤维化大鼠肝组织总超氧化物歧化酶水平结果图；

[0030] 图12是实施例10中肝纤维化大鼠肝组织丙二醛水平结果图；

[0031] 图13是实施例11中肝纤维化大鼠血清羟脯氨酸水平结果图；

[0032] 图14是实施例12中肝纤维化大鼠血清TGF‑β1水平结果图；

[0033] 图15是实施例13中肝纤维化大鼠血清TNF‑α水平结果图。

具体实施方式

[0034] 本申请人于2013年提出并经审查后已获授权的专利号是201310071107.0、发明名称是《一种具有抗辐射保护作用的复方药物》，提供了一种作为抗核辐射保护的复方药物专
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利，其以 Co射线辐射所致血虚型小鼠的影响证实了该用于核辐射损伤保护的药物可有效
保护核辐射造成的造血系统盒生殖系统的损伤，提高免疫力。经过多年研究，对原复方药物
组方进行优化，确定了现有的以西洋参、仙鹤草、南沙参、当归、重楼、桔梗成方的中药复方
组合物正源方。本发明研究发现此药物组合物对人正常肝细胞L02具有促增殖作用，且具有
抗肝细胞氧化损伤的作用，初步推断此药物组合物具有肝保护作用。慢性肝损伤可致肝纤
维化，至今未见有该药物组合物正源方用于防治肝纤维化疾病的报道。经本发明人长期大
量实验，最终得到用于肝损伤保护的药物组合物由原料药西洋参20‑30份、仙鹤草20‑30份、
当归10‑20份、重楼10‑20份、南沙参10‑20份以及桔梗10‑20份制备而成，在该比例范围下所
形成的用于肝损伤保护的药物组合物都具有非常好或具有基本同等的的效果。

[0035] 为了说明问题，本发明在上述范围内，随机采用原料药西洋参20份、仙鹤草30份、当归 10份、重楼15份、南沙参15份以及桔梗10份制备而成用于肝损伤保护的药物组合物进
行相关试验并对其效果进行验证。下面将结合具体实施方式对本发明所提供的技术方案进
行详细说明：

[0036] 实施例1正源方水提物的制备

[0037] 中药组合物制剂按如下重量份数配比的原料药制得：西洋参20份、仙鹤草30份、当归10 份、重楼15份、南沙参15份、桔梗10份，煎煮3次，每次加入10倍量水，前两次煎煮每次
1.5 小时，第三次煎煮1小时，合并三次煎煮的水煎液，于60℃下真空减压浓缩至相对密度
为 1.05‑1.15的稠膏，喷雾干燥，收集细粉及喷雾干燥器内壁粘附的所有药粉，混匀，即得
正源方水提物。

[0038] 本发明所采用的西洋参，性凉，味甘、微苦，归心、肺、肾经，具有补气养阴，清热生津功效。仙鹤草，性平，味苦、涩，归心、肝经，具有收敛止血，截疟，止痢，解毒，补虚功效。当
归，性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，补血活血，调经止痛，润肠通便。重楼，性微寒，味苦，有小
毒，归肝经，清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊。南沙参，性微寒，味甘，归肺、胃经，养阴清肺，益
胃生津，化痰，益气。桔梗，性平，味苦、辛，归肺经，宣肺，利咽，祛痰，排脓。

[0039] 实施例2正源方水提物对L02人正常肝细胞活力的影响

[0040] 将L02细胞以1.5×105个/mL密度接种于96孔板中，过夜，加入正源方水提物，使每孔中的正源方水提物的工作浓度为20、50、100、200、500、1000μg/mL，24h后加入MTT进行细
胞活力测定，测定不同浓度的正源方水提物对L02人正常肝细胞活力的影响，L02细胞存活
率的柱状图详见图1，本发明发现正源方水提物在100μg/mL到500μg/mL范围内，对人正常肝
细胞L02具有促增殖作用，在500μg/mL时促增殖作用显著。

[0041] 实施例3正源方水提物对H2O2诱导的L02肝细胞氧化损伤的保护作用

[0042] 由实施例2中结果筛选合适的正源方水提物的作用浓度范围，进一步通过H2O2诱导构建肝细胞氧化损伤模型，MTT测定各组细胞存活率，其结果详见图2，本发明发现正源方对
人正常肝细胞有明显促增殖作用，以过氧化氢H2O2诱导L02肝细胞造成氧化损伤模型，经浓
度摸索后设置H2O2浓度为250μM进行损伤，给药后发现正源方对过氧化氢损伤的肝细胞具有
保护作用。通过Hoechst 33342/PI双染对各组活细胞进行染色，运用荧光显微镜在Hoechst 
33342荧光通道下观察染色的细胞，总荧光数目表示L02细胞数目变化，在PI荧光通道下观
察，染色细胞为坏死细胞，染色结果详见图3。本发明通过Hoechst 33342/PI试剂盒对细胞
进行染色，发现在明场中，与空白组相比，模型组细胞数目明显减少，Hoechst 33342荧光图
像显示模型组细胞核质出现凝集皱缩现象，说明过氧化氢损伤后肝细胞出现凋亡现象，由
PI荧光图像可见模型组细胞中存在明显坏死细胞，而正源方给药组干预给药可缓解细胞凋
亡坏死现象。

[0043] 实施例4正源方水提物对CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝保护作用

[0044] 雄性SD大鼠随机分为8组：对照组、模型组、阳性组、正源方低剂量组、正源方中剂量组、正源方高剂量组、正源方阴性对照组、重楼阴性对照组，每组6只。除两组阴性对照组
外，模型组、给药组大鼠腹腔注射40％CCl4(CCl4：橄榄油＝2：3，1mL/kg)，对照组大鼠腹腔注
射等量的橄榄油溶液，每周2次，共8周。阳性组给予水飞蓟素(200mg/kg)，正源方低、中、高
剂量组(1‑2、2‑4、4‑6g/kg，在本实施例及在后的实施例中，均采用正源方低剂量组是1.6 
g/kg、中剂量组采用3.2g/kg、高剂量组采用4.8g/kg)给予正源方水提工艺供试液，每天一
次，连续8周。第8周末次造模后继续给药2天，禁食，第3天全部大鼠麻醉后进行腹主动脉采
血，分离血清；取大鼠肝脏标本，取肝脏左叶中部固定于10％多聚甲醛固定液中，进行肝组
织病理学检测；取肝脏特定部分，加入9倍量生理盐水进行组织匀浆，离心提取上清液待用。
其余肝组织保存于‑80℃冰箱，用于检测目的蛋白表达水平。大鼠体质量连续监测数值如附
图4，各组大鼠肝、脾脏器指数如附图5以及图6。由图5、6可知，与空白组相比，模型组大鼠
肝、脾脏器指数均显著升高，提示模型组肝、脾脏器出现异常，给药组肝、脾脏器指数较模型
组显著下降，说明正源方水提物对于四氯化碳诱导的肝、脾脏器异常有一定的改善作用。

[0045] 实施例5正源方水提物改善大鼠肝纤维化程度的作用效果

[0046] 由附图7中的H&E、Masson染色结果可以看出，经四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝细胞出现大面积脂肪变性，假小叶结构明显变多，纤维母细胞及淋巴细胞增加，且胶原纤维
数量较多。结果显示：①与空白组相比，模型组出现肝细胞大面积脂肪空泡变性，纤维母细
胞及淋巴细胞增多现象；②与空白组相比，模型组胶原沉积数量明显增加；③空白组大鼠正
常肝表象为红色，模型组大鼠肝脏颜色异常，表面呈现明显肝纤维状。而给药组大鼠肝细胞
脂肪变性现象明显减轻，纤维母细胞及淋巴细胞数目减少，且胶原沉积数量减少，大鼠肝纤
维化程度大大减轻，说明正源方各剂量组对肝纤维化有明显修复作用。上述结果表明药物
组合物正源方具有良好的抗肝纤维化活性，有望研发成为抗肝纤维化的新药。

[0047] 实施例6正源方水提物对肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶水平的影响

[0048] 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)为肝的代谢酶，是临床检验肝损伤的指标。使用全自动生化仪(Mindray，BS‑330E)对各组大鼠血清中谷丙转氨酶 
(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酯酶(ALP)的表达水平进行测定。由图8可知，与实施例5
结果一致，相较于四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠，给药组血清中ALT、AST、ALP水平均下调，
说明正源方水提物给药后大鼠肝纤维化程度明显减轻。

[0049] 实施例7正源方水提物对肝纤维化大鼠血清总蛋白、白蛋白水平的影响

[0050] 使用全自动生化仪(Mindray，BS‑330E)对各组大鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB) 的表达水平进行测定。由图9可知，与空白对照组相比，模型组TP、ALB水平均下调。与
模型组相比，给药组TP水平上调，ALB水平无显著性差异。

[0051] 实施例8正源方水提物对肝纤维化大鼠血清总胆汁酸水平的影响

[0052] 总胆汁酸(TBA)是胆固醇在肝脏分解代谢的产物，是由肝脏分泌到胆汁中，并随胆汁排入肠腔，作用于脂肪的消化吸收，胆汁酸的生成和代谢与肝脏关系密切，肝细胞发生病
变时，血清总胆汁酸易升高，亦为检测肝实质性损伤的一个较为灵敏的诊断指标。使用全自
动生化仪(Mindray，BS‑330E)对各组大鼠血清中总胆汁酸(TBA)的表达水平进行测定。结果
表明，模型组TBA水平较空白对照组明显升高，与模型组相比，正源方水提物给药组明显下
调TBA水平，说明模型组大鼠肝细胞受损，肝功能代谢异常，而正源方给药组能够减轻肝脏
受损程度。

[0053] 实施例9正源方水提物对肝纤维化大鼠肝组织中总超氧化物歧化酶水平的影响

[0054] 采用总超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)测定大鼠肝组织中总超氧化物歧化酶(SOD)的水平，由结果可知，模型组SOD水平较空白组显著下调，与模
型组比较，正源方给药组显著上调SOD水平。

[0055] 实施例10正源方水提物对肝纤维化大鼠肝组织中丙二醛水平的影响

[0056] 采用丙二醛检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)测定大鼠肝组织中丙二醛(MDA) 的水平，结果显示，相较与空白组大鼠，肝纤维化模型组大鼠肝组织中MDA水平显著
上调，正源方给药组显著下调模型组异常升高的MDA水平。与实施例9结果结合分析，说明正
源方水提物具有减轻四氯化碳所致肝纤维化带来的氧化应激水平。实施例9与实施例10测
定结果相互印证，表明了相较空白组，模型组出现了氧化损伤现象，给药组可逆转模型组中
异常的SOD、 MDA水平，说明正源方对改善肝氧化损伤有一定的作用效果。

[0057] 实施例11正源方水提物对肝纤维化大鼠血清羟脯氨酸水平的影响

[0058] 羟脯氨酸是一个检验肝纤维化程度的指标，采用羟脯胺酸检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)对各组大鼠血清中的羟脯氨酸(HYP)的表达水平进行测定。由图13可
知，与实施例5结果一致，相较于肝纤维化大鼠，经正源方给药后，纤维化程度相对减轻，血
清中 HYP水平显著下调。

[0059] 实施例12正源方水提物对肝纤维化大鼠血清TGF‑β1水平的影响

[0060] 采用TGF‑β1酶联免疫吸附法检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)对各组大鼠血清中的TGF‑β1的表达水平进行体外定量测定。由图14可知，与实施例5结果一致，相较于
肝纤维化大鼠，经正源方低、中剂量给药后，大鼠TGF‑β1含量水平显著下调。TGF‑β1为转化
生长因子β1，其关键功能为调节炎症过程，实验结果表明，与空白组比较，肝纤维化大鼠血
清中 TGF‑β1水平显著升高，阳性组及正源方低、中剂量给药组可显著下调模型组中TGF‑β1
水平。

[0061] 实施例13正源方水提物对肝纤维化大鼠血清TNF‑α水平的影响

[0062] 采用TNF‑α酶联免疫吸附法检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)对各组大鼠血清中的TNF‑α的表达水平进行体外定量测定。TNF‑α为肿瘤坏死因子α，是一种涉及到系统性
炎症的细胞因子，实验结果表明，与空白组比较，肝纤维化大鼠血清中TNF‑α水平显著升高，
阳性组及正源方低剂量给药组可显著下调模型组中TNF‑α水平，说明正源方对改善肝纤维
化的炎症水平有一定作用。由图15可知，与实施例5结果一致，相较于肝纤维化大鼠，经正源
方低剂量给药后，大鼠TNF‑α含量水平显著下调。

[0063] 上述实验结果从体重变化、脏器指数、血清生化指标以及氧化、炎性指标方面均可表明正源方在动物水平上有一定抗肝纤维化作用。