NK细胞和抗体的药物组合物及其在治疗癌症中的用途转让专利
申请号 : CN202111037406.3
文献号 : CN113577267B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 王京 , 钟桂华
申请人 : 江西北正干细胞生物科技有限公司
摘要 :
本发明涉及NK细胞和抗体的药物组合物及其在治疗癌症中的用途，所述药物组合物含有特异性针对VEGFR2蛋白的VEGFR2单克隆抗体、多西他赛以及高活性的NK细胞，三者一起使用能够有效的抑制肝癌肿瘤的生长，具有较好的应用前景。
权利要求 :
1.特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体、多西他赛以及NK细胞的组合在制备用于治疗肝癌的药盒中的用途；其特征在于，其中，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；其中NK细胞采用如下的方法制备获得：将外周血
2000r/min离心10min后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；血细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液的离心管中，2000r/min离心20min收集白膜层细胞并用生理盐水洗7
涤，计数备用；用GT‑T551H3培养基将2×10个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，然后向体系中加入IL‑2、白藜芦醇、NK滋养细胞及自体血浆，其中，IL‑2为500U/mL、白藜芦醇终浓度
6 ‑1
为2μmol／L、滋养细胞为1×10 mL ，血浆体积为5%，37℃5%CO2条件下体外共培养15d，其中培养第7天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细胞数量的1/
6 ‑1
4；培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5×10 mL 补充培养基，补加
6 ‑1
的培养基为含有240U/mL IL‑2的GT‑T551H3培养基，补液后密度维持在1.0×10 mL ，共培养15d，收集细胞即得到高活性的NK细胞；其中，NK细胞、单克隆抗体、多西他赛的用量分别9
是NK细胞为5×10/kg、单抗为100μg/kg和多西他赛为100μg/kg。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述药盒中还含有药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述药盒中包含至少一种赋形剂。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述药盒中的赋形剂选自组氨酸，海藻糖，甘露醇，蔗糖或柠檬酸钠。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述药盒中包含缓冲液。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述药盒中的缓冲液为组氨酸，甘氨酸或磷酸缓冲液。
说明书 :
NK细胞和抗体的药物组合物及其在治疗癌症中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物领域，更具体的涉及NK细胞和抗体的药物组合物及其在治疗癌症中的用途。
背景技术
[0002] 肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，每年全世界死于肝癌的患者估计达125万，而我国是肝癌高发区，因此研究肝癌的诊断和治疗具有重要的意义。自1975年Kohler和
Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，它们在疾病诊
治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用，其中肝癌单抗的研制更是为这种难治性
肿瘤带来了新的希望。
Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，它们在疾病诊
治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用，其中肝癌单抗的研制更是为这种难治性
肿瘤带来了新的希望。
[0003] 肝癌单抗研究大多为甲胎蛋白，铁蛋白单抗，肝癌单抗研究很少，在肝癌单抗的制备方面，多数采用传统的方法，即以可溶性物质或肝癌培养细胞为免疫原，由于肿瘤抗原的
变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的单抗。用肿瘤新鲜组织制备细
胞悬液免疫动物制备单抗已有成功报道，该法虽然筛选麻烦，但能较好地保持抗原性，不失
为制备单抗的好方法，用该方法融合获得特异性肝癌单抗，其中特异性较好的HAb18肝癌免
疫组化染色阳性率为75％，已通过了中国药品生物制品检定所的《人用鼠源性单克隆抗体
制备及质量控制要点》的要求。此外，中科院上海细胞所谢弘报道了一株鼠抗人原发性肝癌
(PHC)细胞膜抗体Hepama‑I，研究证明对PHC细胞有较高的亲和力。这些均为我国肝癌单抗
的深入研究增添了信心。
变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的单抗。用肿瘤新鲜组织制备细
胞悬液免疫动物制备单抗已有成功报道，该法虽然筛选麻烦，但能较好地保持抗原性，不失
为制备单抗的好方法，用该方法融合获得特异性肝癌单抗，其中特异性较好的HAb18肝癌免
疫组化染色阳性率为75％，已通过了中国药品生物制品检定所的《人用鼠源性单克隆抗体
制备及质量控制要点》的要求。此外，中科院上海细胞所谢弘报道了一株鼠抗人原发性肝癌
(PHC)细胞膜抗体Hepama‑I，研究证明对PHC细胞有较高的亲和力。这些均为我国肝癌单抗
的深入研究增添了信心。
[0004] 以单抗为载体的导向化疗，放疗及放免显象诊断，近年取得了实质性进展。①化学药物—单抗交联物：国内外用于交联的抗癌药物有数十种，主要有MTX，MMC，DM，AM等，依肿
瘤类别选择。谢弘用Hepama‑I IgG‑BSA‑MTX对肝癌细胞的IC50值为8×10‑8M，而对Hela细
胞的IC50值只有3×10‑6M；②细胞毒素—单抗交联物：用于制备细胞毒素的有蓖麻毒蛋白，
天花毒蛋白，白喉毒素，植物毒蛋白，A链类似的致核糖体失活蛋白；③同位素—单抗交联
物：由于肿瘤抗原的不均一性，抗体不能到达肝癌细胞，因此用特异性放疗，效果比化疗好。
瘤类别选择。谢弘用Hepama‑I IgG‑BSA‑MTX对肝癌细胞的IC50值为8×10‑8M，而对Hela细
胞的IC50值只有3×10‑6M；②细胞毒素—单抗交联物：用于制备细胞毒素的有蓖麻毒蛋白，
天花毒蛋白，白喉毒素，植物毒蛋白，A链类似的致核糖体失活蛋白；③同位素—单抗交联
物：由于肿瘤抗原的不均一性，抗体不能到达肝癌细胞，因此用特异性放疗，效果比化疗好。
[0005] 抗体导向化疗可改变药物在体内自然分布，造成药物在瘤区浓集，从而发挥其特异性杀伤作用。张尚权等研究了抗肝癌单抗Hepama‑I丝裂霉素结合物，经荷瘤裸鼠动物实
验表明，该导向化疗药物较单纯的化疗有明显的亲和性，是其应用的前提和关键。
验表明，该导向化疗药物较单纯的化疗有明显的亲和性，是其应用的前提和关键。
[0006] 用放射性核素标记单抗制备而成的放免显象剂和治疗剂已成为肿瘤早期诊断，综合治疗及术后清扫的有力手段之一。截止目前，美国约有近十种显象剂和治疗剂通过FDA，
进入I，II期临床验证阶段，但尚无一种针对肝癌的制剂，国内这方面的研究已初露端倪。施
乐华报道了131I‑Hepama‑I经股动脉介入放免定位及治疗30例失去手术指征的原发性肝癌
患者的研究，显象率为14/18，很优等显象时间在注射后96h，AFP下降率为75.0％，肿瘤部分
缩小率66。6％，与对照组比较，生存时间明显延长，认为核素碘标记的Hepama‑Ⅰ肝癌单抗可
作为治疗晚期肝癌的综合疗法之一。肝癌单抗HAb18也得到了广泛的应用研究，其中131I‑
HAb18放免显象剂和导向治疗剂均已通过国家一类新药评审，获得临床批号进入I，II期临
床，成为我国首批通过的核素—抗体放射药品。临床应用显示，肝癌患者的体内双核素减影
阳性显象率达90.9％(40/44)，能检出的小肝癌瘤块直径为0.5cm。导向治疗肿瘤完全缓解
率3.7％(1/27)，部分缓解率48.1％(13/27)，稳定14.3％(4/27)，无效33.3％(9/27)，2a以
上生存率46.2％(6/13)，对患者血液学功能，肾功能及甲状腺功能无明显影响。
进入I，II期临床验证阶段，但尚无一种针对肝癌的制剂，国内这方面的研究已初露端倪。施
乐华报道了131I‑Hepama‑I经股动脉介入放免定位及治疗30例失去手术指征的原发性肝癌
患者的研究，显象率为14/18，很优等显象时间在注射后96h，AFP下降率为75.0％，肿瘤部分
缩小率66。6％，与对照组比较，生存时间明显延长，认为核素碘标记的Hepama‑Ⅰ肝癌单抗可
作为治疗晚期肝癌的综合疗法之一。肝癌单抗HAb18也得到了广泛的应用研究，其中131I‑
HAb18放免显象剂和导向治疗剂均已通过国家一类新药评审，获得临床批号进入I，II期临
床，成为我国首批通过的核素—抗体放射药品。临床应用显示，肝癌患者的体内双核素减影
阳性显象率达90.9％(40/44)，能检出的小肝癌瘤块直径为0.5cm。导向治疗肿瘤完全缓解
率3.7％(1/27)，部分缓解率48.1％(13/27)，稳定14.3％(4/27)，无效33.3％(9/27)，2a以
上生存率46.2％(6/13)，对患者血液学功能，肾功能及甲状腺功能无明显影响。
[0007] 近年，集化疗和内照射治疗于一体的“双弹头”免疫导向治疗药物已有报道，隋延方报道以肝癌单抗HAb18为载体，以131I‑ADM为弹头，制备出肝癌双弹头组合单抗免疫导向
结合物131I‑HAb18‑ADM，结果表明，双弹头集中了化疗与放疗的优点，二者协同提高了肝癌
导向治疗的效果，该药物提高了对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。
结合物131I‑HAb18‑ADM，结果表明，双弹头集中了化疗与放疗的优点，二者协同提高了肝癌
导向治疗的效果，该药物提高了对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。
[0008] AU2016232104B2公开了用于预防和治疗肝细胞癌的抗Claudin 1单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制肝癌细胞系HUH‑7.5.1，但是抑制效果并不是特别突出。
[0009] US10927170B2公开了通过施用这种单克隆抗体或其药物组合物预防和/或治疗肝细胞癌的方法，给出了肝癌细胞系HUH‑7.5.1的实验结果。同样的，所述单克隆抗体的效果
同样不是很突出。
同样不是很突出。
[0010] 现有技术已知了阿帕替尼能够高度选择性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，阻断信号传导，强效抗肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长、转移和散播。但是目前针
对VEGFR2的单克隆抗体还不够多，可选择的种类也不够丰富，因此，存在巨大的市场需求。
对VEGFR2的单克隆抗体还不够多，可选择的种类也不够丰富，因此，存在巨大的市场需求。
[0011] 此外，自然杀伤(Naturalkiller，NK)细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，杀伤机制包括:FasL与Fas相互作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体
依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、肿瘤凋亡相关因子(TNF‑α、IFN‑γ)的分泌作用。NK
细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞
可通过对Mφ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T
细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。但是目前，将NK细胞联合其他抗肿瘤药物一起作用的
方式还比较少，有待于进一步的研究。
依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、肿瘤凋亡相关因子(TNF‑α、IFN‑γ)的分泌作用。NK
细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞
可通过对Mφ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T
细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。但是目前，将NK细胞联合其他抗肿瘤药物一起作用的
方式还比较少，有待于进一步的研究。
发明内容
[0012] 本发明一方面，提供特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体、多西他赛以及NK细胞在制备用于治疗肝癌的药盒中的用途。
[0013] 提供一种特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)
[0014] EVQLEESATELARPSASVKLSCKASGYIFSFNSYNWIKQRPGQGLEWIGVLIMPWPKQVLRYPMGGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGWFWLKHQWGLGTTLAVSS
[0015] 轻链可变区(SEQ ID NO:2)
[0016] DIVITQRPALMAASPGAKVTITCMVHVTTEMWWGGWYQQKSGISPKPWIYTRKKNHEGVPARFSGSGSGTSDSLTITSMEAEDAATYYCRIYKHCYQWFGAGTKLELK。
[0017] 跟进一步的，其中NK细胞采用如下的方法制备获得：将外周血2000r/min离心10min后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；血细胞用生理盐水稀释后加至装有
Ficoll溶液的离心管中，2000r/min离心20min收集白膜层细胞并用生理盐水洗涤，计数备
7
用；用GT‑T551H3培养基将2×10个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，然后向体系中加入
IL‑2、白藜芦醇、NK滋养细胞及自体血浆，其中，IL‑2为500U/ml、白藜芦醇终浓度为2μmol/
6 1
L、滋养细胞为1×10ml‑，血浆体积为5％，37℃5％CO2条件下体外共培养15d，其中培养第7
天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细胞数量的1/4；培养过
6
程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5×10 cells/ml补充培养基，补加的培
6
养基为含有240U/ml IL‑2的GT‑T551H3培养基，补液后密度维持在1.0×10cells/ml，共培
养15d，收集细胞即得到高活性的NK细胞；其中，NK细胞：单克隆抗体：多西他赛的用量分别
9
是NK细胞为5×10/kg、单抗100μg/kg和多西他赛100μg/kg。
Ficoll溶液的离心管中，2000r/min离心20min收集白膜层细胞并用生理盐水洗涤，计数备
7
用；用GT‑T551H3培养基将2×10个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，然后向体系中加入
IL‑2、白藜芦醇、NK滋养细胞及自体血浆，其中，IL‑2为500U/ml、白藜芦醇终浓度为2μmol/
6 1
L、滋养细胞为1×10ml‑，血浆体积为5％，37℃5％CO2条件下体外共培养15d，其中培养第7
天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细胞数量的1/4；培养过
6
程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5×10 cells/ml补充培养基，补加的培
6
养基为含有240U/ml IL‑2的GT‑T551H3培养基，补液后密度维持在1.0×10cells/ml，共培
养15d，收集细胞即得到高活性的NK细胞；其中，NK细胞：单克隆抗体：多西他赛的用量分别
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是NK细胞为5×10/kg、单抗100μg/kg和多西他赛100μg/kg。
[0018] 本发明另外一方面，所述药盒中还含有药学上可接受的载体。
[0019] 更进一步的，所述药盒中包含至少一种赋形剂。
[0020] 在一些实施方案中，VEGFR2的单克隆抗体是特异性结合人VEGFR2的人免疫球蛋白。在一些实施方案中，VEGFR2的单克隆抗体选自Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，小体或双抗体
的抗体片段。
的抗体片段。
[0021] 在一些实施方案中，TSLP‑结合分子是特异性结合人VEGFR2的FABs，例如人或人源化FABs。
[0022] 另一方面，本文提供了包含至少一种本文所述的VEGFR2的单克隆抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施例中，VEGFR2的单克隆抗体为约5％至约
95％，或约10％至约90％，或约15％至约85％，或约20％至约80％，或约25％至约75％，或约
30％至约70％，或约40％至约60％，或约40‑50％(w/w)的药物组合物。在一些实施方案中，
所述药盒包含壳形成剂，例如三亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，三亮氨酸或亮氨酸为
组合物的约10‑75％(w/w)。在一些实施方案中，三亮氨酸为组合物的约10‑30％(w/w)。在其
它实施方案中，亮氨酸为组合物的约50‑75％(w/w)。在一些实施方案中，所述药盒包含至少
一种玻璃形成赋形剂，其中所述玻璃形成赋形剂选自组氨酸，海藻糖，甘露醇，蔗糖或柠檬
酸钠。在一些实施方案中，至少一种玻璃形成赋形剂是海藻糖或海藻糖和甘露醇的混合物。
在一些实施方案中，玻璃形成赋形剂为药盒的约15‑35％(w/w)。在一些实施方案中，药盒包
含缓冲液，例如组氨酸，甘氨酸，乙酸酯或磷酸酯缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液为药盒
的约5‑13％。
95％，或约10％至约90％，或约15％至约85％，或约20％至约80％，或约25％至约75％，或约
30％至约70％，或约40％至约60％，或约40‑50％(w/w)的药物组合物。在一些实施方案中，
所述药盒包含壳形成剂，例如三亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，三亮氨酸或亮氨酸为
组合物的约10‑75％(w/w)。在一些实施方案中，三亮氨酸为组合物的约10‑30％(w/w)。在其
它实施方案中，亮氨酸为组合物的约50‑75％(w/w)。在一些实施方案中，所述药盒包含至少
一种玻璃形成赋形剂，其中所述玻璃形成赋形剂选自组氨酸，海藻糖，甘露醇，蔗糖或柠檬
酸钠。在一些实施方案中，至少一种玻璃形成赋形剂是海藻糖或海藻糖和甘露醇的混合物。
在一些实施方案中，玻璃形成赋形剂为药盒的约15‑35％(w/w)。在一些实施方案中，药盒包
含缓冲液，例如组氨酸，甘氨酸，乙酸酯或磷酸酯缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液为药盒
的约5‑13％。
[0023] 在一些实施方案中，本文提供的药盒被配制成干粉制剂，例如适于吸入的干粉制剂。
[0024] 有益效果
[0025] 本发明提供一种药盒，所述药盒含有特异性针对VEGFR2蛋白的VEGFR2单克隆抗体、多西他赛以及高活性的NK细胞，三者一起使用能够有效的抑制肝癌肿瘤的生长，具有较
好的应用前景。
好的应用前景。
附图说明
[0026] 图1Western检测结果图
[0027] 图2NK细胞杀伤效果图
[0028] 图3肿瘤抑制率效果图
[0029] 图4联合使用药盒的肿瘤抑制率效果图
具体实施方式
[0030] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
[0031] 实施例1VEGFR2单抗抗体的制备及鉴定
[0032] 首次免疫时，在小鼠颈背部皮下注射100μg VEGFR2蛋白(重组人血管内皮生长因子受体‑2，货号：PKA‑242，艾美捷科技有限公司)。首免后第21天进行第2次免疫，每只小鼠
颈背部皮下注射100μg VEGFR2蛋白。第2次免疫后第14天进行第3次免疫，经腹腔给每只小
鼠注射100μg VEGFR2蛋白，并经小鼠眼眶静脉丛采血。第3次免疫后的第14天进行第4次免
疫，分别在邻近脾和腹腔内给小鼠注射50μg VEGFR2蛋白。第4次免疫7d后经眼眶静脉丛采
血，与三免血清一起用ELISA检测血清效价。融合前3～4d再经脾给小鼠注射100μg生理盐水
稀释的VEGFR2蛋白。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规方法融合。间接ELISA法筛选、有
限稀释法克隆化。
颈背部皮下注射100μg VEGFR2蛋白。第2次免疫后第14天进行第3次免疫，经腹腔给每只小
鼠注射100μg VEGFR2蛋白，并经小鼠眼眶静脉丛采血。第3次免疫后的第14天进行第4次免
疫，分别在邻近脾和腹腔内给小鼠注射50μg VEGFR2蛋白。第4次免疫7d后经眼眶静脉丛采
血，与三免血清一起用ELISA检测血清效价。融合前3～4d再经脾给小鼠注射100μg生理盐水
稀释的VEGFR2蛋白。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规方法融合。间接ELISA法筛选、有
限稀释法克隆化。
[0033] 经细胞融合、筛选及克隆化，获得2株能稳定分泌VEGFR2单抗的杂交瘤细胞株，克隆号分别为6C11和4E09。按照常规方法，用上述杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，将腹水纯化后
获得单抗。
获得单抗。
[0034] (1)利用小鼠Ig类/亚类/亚型检测试剂盒对单抗进行检测，结果如表1所示。
[0035] 表1 6C11单克隆抗体亚型检测结果
[0036] 克隆号 重链亚类 轻链亚型6C11 IgM κ
[0037] (2)单克隆抗体的鉴定‑Western印迹法：检测分别将VEGFR2蛋白、VEGFR和BSA蛋白制备成Western印迹样本，进行电泳并转膜，依次孵育抗体，4℃反应过夜，HRP标记的山羊抗
小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。如图1所示，克隆号为6C11的单抗能够特异性的结
合VEGFR2蛋白，而不与VEGFR和BSA结合，具由较好的特异性。
小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。如图1所示，克隆号为6C11的单抗能够特异性的结
合VEGFR2蛋白，而不与VEGFR和BSA结合，具由较好的特异性。
[0038] (3)单克隆抗体6C11的解离常数测定
[0039] 对于单克隆抗体6C11，通过以下的方法测定解离常数(Kd值)。将VRGFR2蛋白用10mM乙酸钠溶液(pH5.0)稀释，制备终浓度50μg/mL的配体溶液。关于配体的固定化和Kd值
的计算，使用Biacore T200。使用胺偶联试剂盒，将配体溶液固定在感应芯片CM5上。然后，
用电泳缓冲液HBS‑P+制作0.1～50nM的6C11抗体稀释溶液，得到传感图线。作为拟合模型，
采用1:1绑定，对传感图线进行分析，结果，6C11单克隆抗体的Kd值为8.73nM，具有较好的结
合特性。
的计算，使用Biacore T200。使用胺偶联试剂盒，将配体溶液固定在感应芯片CM5上。然后，
用电泳缓冲液HBS‑P+制作0.1～50nM的6C11抗体稀释溶液，得到传感图线。作为拟合模型，
采用1:1绑定，对传感图线进行分析，结果，6C11单克隆抗体的Kd值为8.73nM，具有较好的结
合特性。
[0040] (4)抗体可变区序列鉴定：使用总RNA提取试剂盒从6C11杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物将其逆转录为cDNA。随后通过PCR试剂盒扩增鼠免疫
球蛋白重链和轻链V‑区域片段，将所得的PCR片段亚克隆至pMD19‑T载体系统中，并使用载
体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆6C11的独特V‑区域核苷酸/氨基酸序
列。其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID
NO:2所示。
球蛋白重链和轻链V‑区域片段，将所得的PCR片段亚克隆至pMD19‑T载体系统中，并使用载
体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆6C11的独特V‑区域核苷酸/氨基酸序
列。其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID
NO:2所示。
[0041] 重链可变区(SEQ ID NO:1)
[0042] EVQLEESATELARPSASVKLSCKASGYIFSFNSYNWIKQRPGQGLEWIGVLIMPWPKQVLRYPMGGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGWFWLKHQWGLGTTLAVSS
[0043] 轻链可变区(SEQ ID NO:2)
[0044] DIVITQRPALMAASPGAKVTITCMVHVTTEMWWGGWYQQKSGISPKPWIYTRKKNHEGVPARFSGSGSGTSDSLTITSMEAEDAATYYCRIYKHCYQWFGAGTKLELK。
[0045] 实施例2 6C11对肝癌细胞的抑制实验
[0046] (1)种板:取对数生长期的肝癌SMMC‑7721细胞用胰蛋白酶消化，使用吸管小心吹打(尽量避免产生气泡)，将细胞悬液充分混合均匀，通过细胞计数板计数，使用低血清
5
(5％)完全培养液稀释密度为1×10个/mL的细胞悬液，取出96孔板，其中3‑5个孔加入不含
细胞悬液的完全培养基作为调零孔，其余各孔精确加入100uL细胞悬浮液，均匀铺板，确保
4
每孔接种的细胞浓度为1×10个，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h以使悬浮细胞贴壁。
5
(5％)完全培养液稀释密度为1×10个/mL的细胞悬液，取出96孔板，其中3‑5个孔加入不含
细胞悬液的完全培养基作为调零孔，其余各孔精确加入100uL细胞悬浮液，均匀铺板，确保
4
每孔接种的细胞浓度为1×10个，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h以使悬浮细胞贴壁。
[0047] (2)加药：待细胞贴壁后，用无菌PBS或生理盐水清洗1‑2遍，外圈36孔加入PBS溶液，调零孔仍只加入完全培养基，选取其中3‑5个孔仅加入100ul RPMI‑1640完全培养基，不
加入任何药物作为对照孔，其余孔使用移液枪将含有不同药物浓度的RPMI‑1640完全培养
基100uL加入其中，作为实验孔。分别设置3种单抗预浓度(5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL)，并分
别干预24h、72h二个时间点，每个时间点复测两次。以阿帕替尼20ug/mL作为阳性对照；
加入任何药物作为对照孔，其余孔使用移液枪将含有不同药物浓度的RPMI‑1640完全培养
基100uL加入其中，作为实验孔。分别设置3种单抗预浓度(5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL)，并分
别干预24h、72h二个时间点，每个时间点复测两次。以阿帕替尼20ug/mL作为阳性对照；
[0048] (3)MTT与细胞作用：分别在24h、72h后用生理盐水或PBS液清洗1‑2遍，96孔板中加入100uL RPMI‑1640完全培养基，然后再在每孔加入20ul已配好的MTT溶液，继续在培养箱
中孵育4h，4h后轻轻将96孔板中的溶液吸尽，再向96孔板中分别加入150ulDMSO溶液，将其
再摇床上避光慢速震荡10min，待甲瓒与DMSO溶液充分混合均匀。
中孵育4h，4h后轻轻将96孔板中的溶液吸尽，再向96孔板中分别加入150ulDMSO溶液，将其
再摇床上避光慢速震荡10min，待甲瓒与DMSO溶液充分混合均匀。
[0049] (4)测定吸光度并计算：使用酶标仪测定490nm处吸光度值(OD值)。按公式计数：细胞生长抑制率(％)＝(0D值对照组‑OD值实验组)/(OD值对照组‑OD值调零组)×100％。结果
如表2所示。
如表2所示。
[0050] 表2不同浓度单抗作用细胞的增殖抑制率
[0051]
[0052]
[0053] 实验组与空白对照组相比，实验组对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用，且随着时间及浓度的增加，抑制作用效果越明显，差异有统计学意义(P<0.05)，(如表2)。在上述抗
体药物的浓度和时间内，抗体对细胞的增殖抑制作用有量‑效及时‑效依赖关系，说明单抗
对人肝癌细胞HepG2的增殖有明显的抑制作用。该抗体药物在同浓度条件下比阳性对照组
阿帕替尼在72h的抑制率效果上要有大幅度的提高，具有较好的效果。
体药物的浓度和时间内，抗体对细胞的增殖抑制作用有量‑效及时‑效依赖关系，说明单抗
对人肝癌细胞HepG2的增殖有明显的抑制作用。该抗体药物在同浓度条件下比阳性对照组
阿帕替尼在72h的抑制率效果上要有大幅度的提高，具有较好的效果。
[0054] 实施例3高活性NK细胞的制备
[0055] 将成人外周血2000r/min离心10min后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；血细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液的离心管中，2000r/min离心20min收集白膜
层细胞并用生理盐水洗涤2次，计数备用。用30mlGT‑T551H3培养基将2×107个PBMCs重悬
后，接入T75细胞培养瓶，然后向体系中加入IL‑2、NK滋养细胞及自体血浆，其中，IL‑2为
6 1
500U/ml、白藜芦醇终浓度为2μmol/L、滋养细胞为1×10ml‑ ，血浆体积为5％。37℃5％CO2
条件下体外共培养15d，其中培养第7天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细
胞的数量为NK细胞数量的1/4。培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5
6
×10 cells/ml必须补充培养基，补加的培养基为含有240U/ml IL‑2的GT‑T551H3培养基，
补液后密度维持在1.0×106cells/ml，共培养15d。细胞扩增第15天时，细胞数量从初始接
7 10
种量的4×10个左右，扩增达到(2.52±0.04)×10 个，数量得到显著的提高，特别是白藜
芦醇的加入能够相对于现有技术，显著的提高扩增效果。
层细胞并用生理盐水洗涤2次，计数备用。用30mlGT‑T551H3培养基将2×107个PBMCs重悬
后，接入T75细胞培养瓶，然后向体系中加入IL‑2、NK滋养细胞及自体血浆，其中，IL‑2为
6 1
500U/ml、白藜芦醇终浓度为2μmol/L、滋养细胞为1×10ml‑ ，血浆体积为5％。37℃5％CO2
条件下体外共培养15d，其中培养第7天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细
胞的数量为NK细胞数量的1/4。培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5
6
×10 cells/ml必须补充培养基，补加的培养基为含有240U/ml IL‑2的GT‑T551H3培养基，
补液后密度维持在1.0×106cells/ml，共培养15d。细胞扩增第15天时，细胞数量从初始接
7 10
种量的4×10个左右，扩增达到(2.52±0.04)×10 个，数量得到显著的提高，特别是白藜
芦醇的加入能够相对于现有技术，显著的提高扩增效果。
[0056] 取约5×106个细胞，1500r/min离心5min后重悬于1ml生理盐水中并将其平均分成两管，向其中一管中加入5μl anti‑CD3－FITC和5μl anti‑CD56‑PE，另一管加入对应的同
型抗体作为对照，30min后流式细胞仪检测CD3－CD56+细胞百分比。结果显示CD3－CD56+细
胞比例达96.53％以上，说明该培养方法可以有效诱导NK细胞的扩增并保证扩增纯度。
型抗体作为对照，30min后流式细胞仪检测CD3－CD56+细胞百分比。结果显示CD3－CD56+细
胞比例达96.53％以上，说明该培养方法可以有效诱导NK细胞的扩增并保证扩增纯度。
[0057] 实施例4NK细胞的杀伤实验
[0058] NK细胞对肝癌SMMC‑7721的杀伤效果研究以肝癌细胞为靶细胞，NK细胞为效应细胞，按10∶1的效/靶比将效应细胞加入到靶细胞中，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和
4
培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。靶细胞数为1×10个，靶细胞接种6h后加入效应
细胞，分别于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养0、12、24、36h时向各孔加入10μl CCK‑8溶
液，37℃孵育1h±10min，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。杀伤率由下式计算:杀伤率％
＝[1－(效靶细胞作用孔OD值－效应细胞孔OD值)]/靶细胞孔OD值×100％。结果如图2所
示。
4
培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。靶细胞数为1×10个，靶细胞接种6h后加入效应
细胞，分别于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养0、12、24、36h时向各孔加入10μl CCK‑8溶
液，37℃孵育1h±10min，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。杀伤率由下式计算:杀伤率％
＝[1－(效靶细胞作用孔OD值－效应细胞孔OD值)]/靶细胞孔OD值×100％。结果如图2所
示。
[0059] 从图2的NK细胞杀伤效果的时间关系上可以看出，肝癌的杀伤效果呈现一定的时间依赖性，说明NK细胞可实现对肿瘤细胞的杀伤作用，在36h时，杀伤率可达到57.2％左右，
具有较好的效果。
具有较好的效果。
[0060] 实施例5肝癌移植瘤的建立与分组实验
[0061] 将收集的SMMC‑7721肝癌细胞株(2×107/mL)直接腹腔接种到5只小鼠体内，7d后小鼠腹腔产生大量腹水，在无菌条件下抽取3mL小鼠腹水作为肿瘤源，并加入15mL生理盐水
8
进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×10 /mL，分别取0.3mL细胞悬液接种于小鼠右前肢腋部
皮下，3d后小鼠皮下即可长出瘤块。将小鼠随机分为对照组、单抗处理组、NK细胞处理组和
单抗联合NK细胞处理组以及阳性对照氯喹处理组，每组各10只。阳性氯喹处理组小鼠于建
模后第2天开始腹腔注射氯喹(100μg/kg)，单抗处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射单
抗(100μg/kg)，NK细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5×
9
10/kg)，单抗联合NK细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5
9
×10 /kg)以及单抗(100μg/kg)，对照组则注射生理盐水作为对照，连续处理16d并密切观
察小鼠存活状态。16d后所有小鼠腹腔注射0.8％戊巴比妥(60mg/kg)，待小鼠失去意识后处
2
死，收集肿瘤标本，根据steel公式(V＝a×b/2)计算建模后的肿瘤体积以及处死后的肿瘤
体积，计算肿瘤体积的生长抑制率。结果如图3所示。
8
进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×10 /mL，分别取0.3mL细胞悬液接种于小鼠右前肢腋部
皮下，3d后小鼠皮下即可长出瘤块。将小鼠随机分为对照组、单抗处理组、NK细胞处理组和
单抗联合NK细胞处理组以及阳性对照氯喹处理组，每组各10只。阳性氯喹处理组小鼠于建
模后第2天开始腹腔注射氯喹(100μg/kg)，单抗处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射单
抗(100μg/kg)，NK细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5×
9
10/kg)，单抗联合NK细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5
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×10 /kg)以及单抗(100μg/kg)，对照组则注射生理盐水作为对照，连续处理16d并密切观
察小鼠存活状态。16d后所有小鼠腹腔注射0.8％戊巴比妥(60mg/kg)，待小鼠失去意识后处
2
死，收集肿瘤标本，根据steel公式(V＝a×b/2)计算建模后的肿瘤体积以及处死后的肿瘤
体积，计算肿瘤体积的生长抑制率。结果如图3所示。
[0062] 从图3的结果可以看出，NK处理组、单抗处理组、单抗联合NK细胞处理组以及阳性对照氯喹处理组均能够有效的抑制肿瘤的生长。特别是单抗联合NK细胞一起使用，能够显
著的提高肿瘤生长的抑制率抑制率达到94.1±2.03％，具有较好的效果。
著的提高肿瘤生长的抑制率抑制率达到94.1±2.03％，具有较好的效果。
[0063] 实施例6肝癌治疗的联合实验
[0064] 将收集的SMMC‑7721肝癌细胞株(2×107/mL)直接腹腔接种到5只小鼠体内，7d后小鼠腹腔产生大量腹水，在无菌条件下抽取3mL小鼠腹水作为肿瘤源，并加入15mL生理盐水
8
进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×10 /mL，分别取0.3mL细胞悬液接种于小鼠右前肢腋部
皮下，3d后小鼠皮下即可长出瘤块。将小鼠随机分为对照组、单抗联合NK细胞处理组、多西
他赛处理组以及以及单抗联合多西他赛和NK细胞处理组，每组各10只。单抗联合NK细胞处
9
理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5×10/kg)以及单抗(100μg/
kg)，单抗联合NK细胞以及多西他赛处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的
9
NK细胞(5×10 /kg)以及单抗(100μg/kg)和多西他赛(100μg/kg)，多西他赛处理组小鼠于
建模后第2天开始腹腔注射多西他赛(100μg/kg)。对照组则注射生理盐水作为对照，连续处
理16d并密切观察小鼠存活状态。16d后所有小鼠腹腔注射0.8％戊巴比妥(60mg/kg)，待小
2
鼠失去意识后处死，收集肿瘤标本，根据steel公式(V＝a×b/2)计算建模后的肿瘤体积以
及处死后的肿瘤体积，计算肿瘤体积的生长抑制率。结果如图4所示。
8
进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×10 /mL，分别取0.3mL细胞悬液接种于小鼠右前肢腋部
皮下，3d后小鼠皮下即可长出瘤块。将小鼠随机分为对照组、单抗联合NK细胞处理组、多西
他赛处理组以及以及单抗联合多西他赛和NK细胞处理组，每组各10只。单抗联合NK细胞处
9
理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的NK细胞(5×10/kg)以及单抗(100μg/
kg)，单抗联合NK细胞以及多西他赛处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的
9
NK细胞(5×10 /kg)以及单抗(100μg/kg)和多西他赛(100μg/kg)，多西他赛处理组小鼠于
建模后第2天开始腹腔注射多西他赛(100μg/kg)。对照组则注射生理盐水作为对照，连续处
理16d并密切观察小鼠存活状态。16d后所有小鼠腹腔注射0.8％戊巴比妥(60mg/kg)，待小
2
鼠失去意识后处死，收集肿瘤标本，根据steel公式(V＝a×b/2)计算建模后的肿瘤体积以
及处死后的肿瘤体积，计算肿瘤体积的生长抑制率。结果如图4所示。
[0065] 从图4的结果可以看出，单抗联合NK细胞以及多西他赛处理组能够显著的提高肿瘤生长的抑制率，肿瘤基本完全消失，这种联合使用，能够显著的提高肿瘤治疗效果，具有
较好的应用前景。
较好的应用前景。
[0066] 应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都
属于本发明的保护范围。
属于本发明的保护范围。