一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如式(I)所示。所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯所得。该比率型多硫化氢荧光探针具有合成原料易得、合成简单、目标化合物产率高及比率型响应等优点，避免了传统荧光探针不宜在高浓度下检测及单一发射在检测过程中易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点，荧光强度高、响应快、分辨率高、抗干扰能力强，能够用于细胞和活体内多硫化氢的定性和定量检测，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种比率型多硫化氢荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：其中，R为 中的任意一种；

R为 时，所述荧光探针的结构式为

R为 时，所述荧光探针的结构式为

R为 时，所述荧光探针的结构式为

2.权利要求1所述的比率型多硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸所得；

所述前体化合物的结构式为：

中的任意一种；

所述前体化合物为 时，所述前驱体为

所述前体化合物为 时，所述前驱体为

所述前体化合物为 时，所述前驱体为

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将所述前体化合物、所述2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，得到中间化合物；

(2)将所述中间化合物与所述2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4‑二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；

所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇；所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间为10～12小时。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述前体化合物、所述2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1‑2.5)：(1‑2)：(0.1‑

0.5)；所述中间化合物、所述2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述前体化合物、所述2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为1：2：1.5：0.2。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的Knoevenagel反应完成后，还包括将所得产物进行后处理的步骤，所述后处理包括以下步骤：将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；

将所述浓缩物进行柱层析，得到所述中间化合物。

说明书

一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子探针技术领域，具体涉及一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 活性硫种(RSS)是一种含硫分子，在生物系统中具有重要的调节功能。其中硫化氢(H2S)是一种重要的内源性气体传递体，由于参与多种生理活动而被广泛研究。作为硫化氢的一种氧化形式，多硫化氢(H2Sn)一直没有引起人们的注意。然而，最近的一些证据表明，多硫化氢参与了越来越多与硫化氢有关的生理活动。例如，多硫化氢比硫化氢更有可能激活2+
TRAP1通道，诱导星形胶质细胞内Ca 内流。

[0003] 为了更好地了解多硫化氢在生物系统中的作用，开发新技术监测多硫化氢在生物系统中的作用至关重要。传统的检测多硫化氢的方法是紫外‑可见分光光度法和质谱法。这些方法需要对样品进行预处理，使得在体内快速、准确地检测多硫化氢和实时成像具有挑战性。与传统分析方法相比，荧光探针具有灵敏度高、选择性好和非侵入性检测的优点。然而，大多数用于检测多硫化氢的荧光探针主要依靠单个波长荧光强度的变化，会受到探针浓度、温度、pH和仪器效率的干扰。此外，一些比率探针在体内被聚集诱导猝灭(ACQ)所困扰，导致大量弱荧光和自身荧光中断。因此，开发出荧光强度高、响应快、准确性高的比率型多硫化氢探针具有重要意义。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如式(I)所示。所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯所得。

[0005] 本发明提供一种比率型多硫化氢荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

[0006]

[0007] 其中，R为 中的任意一种。

[0008] 本发明还提供所述的比率型多硫化氢荧光探针的制备方法，所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与4‑(二乙氨基)水杨醛反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯所得。

[0009] 进一步的，包括如下步骤：

[0010] (1)将前体化合物、2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，得到中间化合物；

[0011] (2)将所述中间化合物与2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4‑二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；

[0012] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0013] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0014] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0015] 进一步的，所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇，所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。

[0016] 进一步的，所述步骤(1)反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时，优选为10～12小时。所述反应温度能够保证中间化合物产率达到85％。所述反应时间过短不能够实现所述荧光探针85％的产率，时间过长会生成副产物。

[0017] 进一步的，所述前体化合物、所述2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1‑2.5)：(1‑2)：(0.1‑0.5)，优选为1：2：1.5：0.2；所述中间化合物、所述2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。采用上述比例制备的所述荧光探针产率高，可达83％。

[0018] 进一步的，所述步骤(1)的Knoevenagel反应完成后，还包括将所得产物进行后处理的步骤，所述后处理包括以下步骤：

[0019] 将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；

[0020] 将所述浓缩物进行柱层析，得到所述中间化合物。

[0021] 本发明还提供所述的比率型多硫化氢荧光探针在生物体内多硫化氢的定性或定量检测中的应用。

[0022] 进一步的，包括如下步骤：将待测样品加入到比率型多硫化氢荧光探针溶液中，然后目测颜色变化和/或测试紫外吸收变化。

[0023] 进一步的，所述比率型多硫化氢荧光探针溶液为比率型多硫化氢荧光探针与水和有机溶剂的混合溶液。

[0024] 进一步的，所述水和所述有机溶剂的体积比为99.5：5～99：10。在上述测试条件的参数范围内，所述探针对多硫化氢有明显的检测识别效果，而在所述参数范围之外的测试条件下，所述探针对多硫化氢则无明显检测识别效果。

[0025] 进一步的，所述有机溶剂为二甲基亚砜。

[0026] 综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

[0027] (1)本发明的比率型多硫化氢荧光探针具有聚集诱导发光特性，在聚集态时能发出较强的荧光，避免了大量弱荧光和自身荧光中断。

[0028] (2)本发明的比率型多硫化氢荧光探针响应时间短、速度快，仅为2min。

[0029] (3)本发明的比率型多硫化氢荧光探针通过两个不同发射波长的荧光强度的比率变化进行自校正，可以有效避免传统荧光分子在高浓度下荧光猝灭或单一波长荧光强度易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点，有效提高了检测的准确性和分辨率。

[0030] (4)本发明的比率型多硫化氢荧光探针可以在一定浓度范围内对溶液中的多硫化氢实现比率型线性响应，能够定量检测细胞和活体内的多硫化氢。

[0031] (5)本发明的比率型多硫化氢荧光探针的制备合成原料易得，步骤简单，容易操作，荧光探针的产率可达到83％，适合工业化生产。

附图说明

[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0033] 图1为本发明的比率型多硫化氢荧光探针的工作原理图；

[0034] 图2为5μM的TCFPB‑H2Sn在不同浓度的多硫化氢存在条件下孵化不同时间后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图；

[0035] 图3为5μM的TCFPB‑H2Sn溶液中加入不同浓度多硫化氢孵化后荧光发射光谱的变化图；

[0036] 图4为5μM的TCFPB‑H2Sn溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值与多硫化氢浓度的线性曲线图；

[0037] 图5为5μM的TCFPB‑H2Sn溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随不同pH值变化图；

[0038] 图6为5μM的TCFPB‑H2Sn溶液中分别加入不同竞争分子后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图；

[0039] 图7为5μM的TCFPB‑H2Sn与HeLa细胞37℃下孵化20min后的激光共聚焦显微成像照片；

[0040] 图8为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同多硫化氢浓度的变化图。

具体实施方式

[0041] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0042] 本发明提供一种比率型多硫化氢荧光探针，其结构式如式(I)所示。

[0043]

[0044] 其中，R为 中的任意一种。

[0045] 本发明还提供所述荧光探针的制备方法，所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯所得，亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯为多硫化氢识别单元。

[0046] 包括如下步骤：

[0047] (1)将前体化合物、2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，将所得产物进行后处理，将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到中间化合物。反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时，优选为10～12小时。所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇。所述前体化合物、所述2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1‑2.5)：(1‑2)：(0.1‑0.5)，优选为1：2：1.5：0.2。

[0048] (2)将所述中间化合物与2‑氟‑5‑硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4‑二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。所述中间化合物、所述2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑
2(5H)‑亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。

[0049] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0050] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0051] 所述前体化合物为 时，所述中间化合物为

[0052] 实施例1本发明的多硫化氢荧光探针(TCFPB‑H2Sn)的制备

[0053] 本实施例采用两步法制备，前体化合物为4‑(二乙氨基)水杨醛，按照如下路线进行制备：

[0054]

[0055] 具体工艺为：

[0056] (1)在氮气保护下，准确称取199mg的4‑(二乙氨基)水杨醛(前体化合物)和231mg的2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈溶于6mL无水乙醇，再往反应液中滴加28μL哌啶，在75℃回流搅拌过夜，当TLC监测反应已不再进行时停止反应，减压蒸馏除去溶剂，并经柱层析分离提纯，真空干燥后得到紫色固体318mg，即为中间化合物，产率为85％。

[0057] (2)在氮气保护下，先准确称取93mg的2‑氟‑5‑硝基苯甲酸和100mg中间化合物溶于6mL无水二氯甲烷中，接着再称取67mg的DCC和6mg DMAP加入反应液，室温搅拌5h。TLC监测反应完全后停止反应，减压蒸馏除去溶剂，并经柱层析分离提纯，真空干燥后得到紫色固体121mg，即为目标产物TCFPB‑H2Sn，产率为83％。

[0058] 实施例2中间化合物的鉴定

[0059] 对实施例1制备得到的紫色中间化合物进行核磁分析，核磁型号为Bruker AVANCE 400，测试条件为室温，核磁共振数据为：

[0060] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.87(s,1H),8.24(s,1H),7.70(d,J＝9.2Hz,1H),6.94(d,J＝15.2Hz,1H),6.45(dd,J＝9.3,2.4Hz,1H),6.15(d,J＝2.4Hz,1H),3.46(q,J＝
13
7.1Hz,4H),1.70(s,6H),1.16(t,J＝7.0Hz,6H). C NMR(101MHz,DMSO‑d6)δ177.97,
175.75,162.69,154.55,114.55,113.67,113.30,112.47,107.25,97.67,96.93,49.26,
45.04,26.43,13.14。

[0061] 对实施例1制备得到的紫色中间化合物进行质谱分析，质谱分析仪的设备型号为Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer，测试条件为室温，紫色中间化合物的高分+辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C22H22N4O2Na:[[MNa]＝397.16405；found:
397.16354。说明中间化合物成功制备。

[0062] 实施例3本发明的多硫化氢荧光探针的的鉴定

[0063] 对实施例1制备得到的紫色化合物TCFPB‑H2Sn进行核磁分析，紫色化合物TCFPB‑H2Sn即为本发明的多硫化氢荧光探针。核磁型号为Bruker AVANCE 400，测试条件为室温。通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧光探针的结1
构式为 核磁共振数据为：H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.87(dd,J＝5.9,
2.9Hz,1H),8.65(dd,J＝8.0,4.2Hz,1H),8.15‑8.07(m,2H),7.77(t,J＝9.5Hz,1H),6.97‑
13
6.83(m,3H),3.52(q,J＝7.0Hz,4H),1.67(s,6H),1.17(t,J＝7.0Hz,6H). C NMR(101MHz,DMSO‑d6)δ178.08,175.71,166.68,164.00,153.26,153.19,144.15,141.90,131.85,
131.65,128.56,119.98,119.73,114.21,113.82,112.89,111.35,109.87,105.89,98.86,
91.85,51.84,45.00,25.51,13.01.

[0064] 对实施例1制备得到的紫色化合物TCFPB‑H2Sn进行质谱分析，质谱分析仪的设备型号为Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer，测试条件为室温，紫色化合物TCFPB‑+H2Sn的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C29H24N5O5FNa:[M Na]＝
564.16592；found:564.16553。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。

[0065] 实施例4本发明的多硫化氢荧光探针的制备和鉴定

[0066] 其他条件和实施例1相同，仅将前体化合物替换为 可得到中间化合物1
所述中间化合物的核磁共振数据为：H NMR(400MHz,CDCl3‑d)δ7.78‑7.70
(m,4H),6.92(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.85(d,J＝2.0Hz,2H),6.70(s,1H),2.89(s,9H),
13
1.48(s,9H)；C NMR(101MHz,CDCl3‑d)δ156.21,149.45,142.05,135.31,135.23,132.41,
129.16,128.84,126.02,116.15,115.61,114.73,102.89,101.50,78.77,40.35,27.22。所+
述中间化合物的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C20H18N4O2Na:[[MNa]＝369.13275；found:369.13254。以上结果表明中间化合物成功制备。

[0067] 通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧1
光探针的结构式为 所述荧光探针的核磁共振数据为：H NMR(400MHz,
CDCl3‑d)δ8.66(d,J＝2.0Hz,2H),8.24(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),7.56(dd,J＝7.5,1.1Hz,
2H),7.43‑7.36(m,4H),7.24(d,J＝2.0Hz,2H),7.18(s,1H),6.96(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),
13
2.93(s,9H),1.49(s,9H).；C NMR(101MHz,CDCl3‑d)δ164.96,159.74,156.78,143.93,
141.65,141.37,137.21,135.85,129.04,127.64,127.03,126.58,125.72,124.53,118.25,
115.62,114.97,114.95,114.13,103.96,88.49,81.67,40.52,27.64。所述荧光探针的高分+
辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C27H20FN5O5Na:[[M Na]＝536.13462；
found:536.13496。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。

[0068] 实施例5本发明的多硫化氢荧光探针的制备和鉴定

[0069] 其他条件和实施例1相同，仅将前体化合物替换为 可得到中间化合物1
所述中间化合物的核磁共振数据为H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.79(s,1H),
8.44(s,1H),7.46(s,1H),6.72(d,J＝14.2Hz,1H),3.41‑3.34(m,4H),2.66(t,J＝6.2Hz,
13
2H),2.58(d,J＝12.8Hz,2H),1.84(p,J＝6.1Hz,4H),1.66(s,6H)；C NMR(101MHz,DMSO‑d6)δ177.98,173.70,157.58,151.49,118.01,115.12,114.22,114.12,113.99,106.62,
97.01,50.76,49.96,47.28,27.08,26.53,21.43,21.02,20.40。所述中间化合物的高分辨+ +
质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C24H23N4O2:[[MH] ＝399.18155；found:
399.18167。以上结果表明中间化合物成功制备。

[0070] 通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧1
光探针的结构式为 所述荧光探针的核磁共振数据为 H NMR(400MHz,
DMSO‑d6)δ8.86(dd,J＝6.1,3.0Hz,1H),8.70‑8.61(m,1H),8.13(d,J＝15.5Hz,1H),7.83‑
7.73(m,2H),6.85(d,J＝15.6Hz,1H),3.43(s,4H),2.79(t,J＝6.2Hz,4H),1.96‑1.83(m,
13
4H),1.63(s,6H). C NMR(101MHz,DMSO‑d6)δ178.22,174.96,149.57,148.59,141.93,
132.21,127.50,121.21,114.18,113.91,113.35,113.21,108.53,98.47,89.17,50.58,
50.37,49.72,25.56,21.27,20.89,20.03。高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated +
for C31H24FN5O5Na:[[MNa]＝588.16592；found:588.16570。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。

[0071] 实施例6本发明的比率型多硫化氢探针(TCFPB‑H2Sn)的性能测试

[0072] 以实施例1制备的荧光探针为测试对象，具体步骤如下：

[0073] (1)比率型多硫化氢探针的响应时间测定：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μLTCFPB‑H2Sn的DMSO溶液(1mM)得到5μM的TCFPB‑H2Sn溶液，然后分别加入5μM、10μM和20μM的多硫化钠溶液，所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(30s、60s、90s、
120s、180s、210s、140s、270s、300s)，测定所述混合溶液的619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随孵化时间的变化情况。

[0074] 图2为TCFPB‑H2Sn在不同浓度的多硫化氢存在条件下在95％PBS/DMSO混合溶液中孵化不同时间后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图2可知，在37℃下孵化2min后，荧光强度基本达到饱和，这说明多硫化氢探针响应较快，仅为2min。

[0075] (2)多硫化氢探针的荧光滴定测试：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL TCFPB‑H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的TCFPB‑H2Sn溶液，然后分别加入不同浓度的多硫化钠溶液(浓度范围为0～250μM)，在37℃下孵化5min后，测定加入不同浓度多硫化氢后所得溶液的荧光发射光谱(Ex＝575nm)，并以619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值为纵坐标、多硫化氢的浓度为横坐标建立TCFPB‑H2Sn对多硫化氢检测的线性曲线。

[0076] 图3为在5μM的TCFPB‑H2Sn溶液中加入不同浓度多硫化氢孵化后荧光发射光谱的变化图；根据图3可以看出，随着多硫化氢浓度的增大，619nm处荧光强度逐渐增强，而751nm处荧光强度逐渐下降。

[0077] 图4为TCFPB‑H2Sn溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值与多硫化氢浓度的线性曲线图，所述线性曲线具体为Y＝0.04682X+0.36183，荧光强度对于一氧化碳的2
浓度的线性响应在1～30μM(R ＝99.3％)之间。由图4可以看出，荧光探针TCFPB‑H2Sn可以在一定浓度范围内对溶液中的多硫化氢实现比率型线性响应。

[0078] (3)一多硫化氢探针对pH的敏感性测定：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)中加入10μL TCFPB‑H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μL TCFPB‑H2Sn溶液，然后加入50μM的多硫化钠溶液，所得混合溶液在37℃下孵化5min后，测定所述混合溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随PBS缓冲溶液pH值的变化情况。

[0079] 图5为TCFPB‑H2Sn在不同pH值的PBS/DMSO混合溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图5可知，探针TCFPB‑H2Sn本身具有很好的pH稳定性，对pH值不敏感，探针TCFPB‑H2Sn对多硫化氢的响应在pH值为6.0～10.0范围内具有很好的响应能力。

[0080] 多硫化氢探针的选择性测试：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL TCFPB‑H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的TCFPB‑H2Sn溶液，分别加入250μM的其他离
2‑ ‑ 2+ + 3+ 3‑
子，其中a:S2O5 ；b:ClO‑；c:H2O2；d:MnO4 ；e:Mg ；f:K ；g:Cys；h:Fe ；i:H2S；j:HSO ；k:
2‑ ‑ 2‑ ‑
SO4 ；l:HCy；m:I ；n:OH；o:ATP；p:S2O8 ；q:GSH；r:NO3；s:blank；t:Na2S4。所得混合溶液分别在37℃下孵化5min，然后测定混合溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值的变化。

[0081] 图6为TCFPB‑H2Sn溶液中分别加入不同竞争分子后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图6可知，除H2Sn外的其它生物分子与TCFPB‑H2Sn反应前后的荧光强度比值均没有明显变化，说明TCFPB‑H2Sn可以选择性的识别H2Sn，不易受其他离子的干扰，特异型强。

[0082] 实施例7本发明的多硫化氢荧光探针定性和定量检测细胞内的多硫化氢

[0083] 对人宫颈癌细胞(HeLa)内多硫化氢荧光成像情况进行测试，使用实施例1制备的荧光探针，具体步骤如下：

[0084] HeLa细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养，然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。

[0085] 将培养后的HeLa细胞浸入含5μM TCFPB‑H2Sn(实施例1制备得到)的培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养20min后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍；加入2mL PBS溶液，实验组分别加入10μM、20μM、50μM的多硫化钠，在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并用561nm作为激发光源，对其进行明场和暗场下拍照。

[0086] 图7为TCFPB‑H2Sn与HeLa细胞37℃下孵化5min后的激光共聚焦显微成像照片，由图7可知，TCFPB‑H2Sn在HeLa细胞中，不管是红光通道还是绿光通道都呈现弱的荧光信号，而在加入了多硫化氢的HeLa细胞中，红光通道荧光信号基本逐渐减弱，而绿光通道的荧光信号明显增强。

[0087] 图8为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同多硫化氢浓度的变化图，可见TCFPB‑H2Sn对细胞内多硫化氢的成像呈现浓度依赖关系，说明TCFPB‑H2Sn可以对细胞内多硫化氢进行比率型荧光成像。本发明的多硫化氢荧光探针不仅能对细胞和活体内的多硫化氢进行定性检测，还可以实现定量的检测。

[0088] 按照实施例6～7的方法对实施例4和实施例5所得比率型多硫化氢荧光探针进行响应时间、荧光滴定、pH敏感性、选择性和人宫颈癌细胞内成像情况进行测试，所得结果和实施例6～7相似。

[0089] 综合以上实施例，本发明提供的比率型多硫化氢荧光探针具有聚集诱导发光特性和比率型响应特性，且响应时间短，对pH值不敏感，能够定性和定量检测细胞内的多硫化氢，且能够通过两个不同发射波长的荧光强度比率进行响应和细胞成像，可有效避免单一波长易受温度、pH、浓度及仪器等外界因素的干扰，获得更高的成像分辨率，且制备原料易得，步骤简单，容易操作，产率高，适合工业化生产，具有广阔的应用前景。

[0090] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。