水蛭肽及其应用和产品

摘要

本发明提供了一种水蛭肽及其应用和产品，涉及生物技术领域。本发明提供的水蛭肽，其氨基酸序列为EEKYDEEEKLGTPK，经发明人研究发现，该水蛭肽对于内皮细胞无明显毒性，能够促进内皮功能紊乱模型中内皮型一氧化氮合酶的表达水平，显著提升NO释放能力，改善内皮细胞功能损伤；抑制内皮功能紊乱模型中包括细胞间黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1在内的内皮细胞功能紊乱相关因子的表达，抑制内皮细胞功能紊乱；降低内皮细胞粘附能力。

权利要求

1.一种水蛭肽，其特征在于，所述水蛭肽的氨基酸序列为EEKYDEEEKLGTPK。

2.一种抑制TNF‑α介导的内皮细胞功能紊乱相关因子表达的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的水蛭肽；

所述内皮细胞功能紊乱相关因子包括细胞间黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1。

3.一种抑制TNF‑α介导的内皮细胞功能紊乱的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的水蛭肽。

4.一种降低TNF‑α介导的内皮细胞黏附能力的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的水蛭肽。

说明书

水蛭肽及其应用和产品

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种水蛭肽及其应用和产品。

背景技术

[0002] 随着中国经济的发展，人民生活水平的提高，人们的生活习惯也悄然发生了改变。心血管疾病已经成为人类健康的头号杀手，有数据显示中国大约有2000万动脉粥样硬化
（Atherosclerosis AS）患者，由于饮食等结构的改变，每年都会递增60万人左右。动脉粥样
硬化是人心血管疾病中发病率较高的一类疾病，相关损伤主要发生在大中型动脉中，导致
了心脏、脑或者四肢局部缺血，从而引起梗塞。

[0003] 病理生理观察表明，动脉粥样硬化起始的第一步是内皮功能紊乱。造成内皮功能紊乱的原因包括增高的氧化低密度脂蛋白，吸烟引起的自由基，高血压，糖尿病，基因的改
变，增高的同型半胱氨酸的血浆浓度以及微生物感染比如孢疹病毒或者衣原体肺炎等。血
管内皮损伤使得内皮对白细胞或者血小板的粘附和渗透率增加，诱导形成一些血管活性分
子、细胞因子和生长因子。在整合素，P‑选择素等活性分子作用下，平滑肌细胞迁入内膜，连
同巨噬细胞形成脂肪斑块。随着脂肪斑块进展到中度和进展期病灶，会倾向于形成纤维帽
状结构将病灶与管腔隔离，并最终被持续的巨噬细胞激活所引起基质金属蛋白酶等降解而
导致血管出血或动脉管腔出血，导致血栓形成和动脉管腔阻塞。

[0004] 水蛭，属于环节动物门(Annelida)，蛭纲(Hirudinea)，是一味传统活血化瘀中药，具有破血、逐瘀、通经之功能。我国在中医临床应用研究，证明其在多种因瘀血所致的疾病
中疗效确切。有研究表明，水蛭具有抗凝、抗血栓、降血脂、抗炎、抗肿瘤和保护细胞的作用。

[0005] 按照现代医学的观点以及文献报道，内皮功能紊乱是动脉粥样硬化中发病中的一个重要的早期过程，通过保护内皮功能紊乱来防治动脉粥样硬化的是一个很重要的靶点。
水蛭作为一味传统活血化瘀中药，在动脉粥样硬化的治疗中起着积极地作用。研究水蛭对
内皮功能紊乱的保护作用不仅有助于心血管疾病的防治，对相关行业的健康发展也具有重
要的意义。

[0006] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0007] 本发明的第一目的在于提供一种水蛭肽。

[0008] 本发明的第二目的在于提供上述水蛭肽在制备用于提高内皮型一氧化氮合酶表达的药物中的应用。

[0009] 本发明的第三目的在于提供一种提高内皮型一氧化氮合酶表达的药物。

[0010] 本发明的第四目的在于提供上述水蛭肽在制备用于抑制内皮细胞功能紊乱相关因子表达的药物中的应用。

[0011] 本发明的第五目的在于提供一种抑制内皮细胞功能紊乱相关因子表达的药物。

[0012] 本发明的第六目的在于提供上述水蛭肽在制备用于抑制内皮细胞功能紊乱的药物中的应用。

[0013] 本发明的第七目的在于提供一种抑制内皮细胞功能紊乱的药物。

[0014] 本发明的第八目的在于提供上述水蛭肽在制备用于降低内皮细胞黏附能力的药物中的应用。

[0015] 本发明的第九目的在于提供一种降低内皮细胞黏附能力的药物。

[0016] 第一方面，本发明提供了一种水蛭肽，所述水蛭肽的氨基酸序列为EEKYDEEEKLGTPK。

[0017] 第二方面，本发明提供了一种水蛭肽在制备用于提高内皮型一氧化氮合酶表达的药物中的应用。

[0018] 第三方面，本发明提供了一种提高内皮型一氧化氮合酶表达的药物，包括水蛭肽。

[0019] 第四方面，本发明提供了一种水蛭肽在制备用于抑制内皮细胞功能紊乱相关因子表达的药物中的应用；

[0020] 所述内皮细胞功能紊乱相关因子包括细胞间黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1。

[0021] 第五方面，本发明提供了一种抑制内皮细胞功能紊乱相关因子表达的药物，包括水蛭肽；

[0022] 所述内皮细胞功能紊乱相关因子包括细胞间黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1。

[0023] 第六方面，本发明提供了一种水蛭肽在制备用于抑制内皮细胞功能紊乱的药物中的应用。

[0024] 第七方面，本发明提供了一种抑制内皮细胞功能紊乱的药物，包括水蛭肽。

[0025] 第八方面，本发明提供了一种水蛭肽在制备用于降低内皮细胞黏附能力的药物中的应用。

[0026] 第九方面，本发明提供了一种降低内皮细胞黏附能力的药物，包括水蛭肽。

[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0028] 本发明提供的水蛭肽，其氨基酸序列为EEKYDEEEKLGTPK，经发明人研究发现，该水蛭肽对于内皮细胞无明显毒性，能够促进内皮功能紊乱模型中内皮型一氧化氮合酶的表达
水平，显著提升NO释放能力，改善内皮细胞功能损伤；抑制内皮功能紊乱模型中包括细胞间
黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1在内的内皮细胞功能紊乱相关因子的表达，抑制内皮细
胞功能紊乱；降低内皮细胞粘附能力。

附图说明

[0029] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0030] 图1为本发明实施例2提供的TNF‑α浓度对eNOS mRNA的表达量的影响；

[0031] 图2为本发明实施例3提供的水蛭肽浓度对内皮细胞的影响；

[0032] 图3为本发明实施例4提供的水蛭肽浓度对内皮功能紊乱模型eNOS mRNA表达量的影响；

[0033] 图4为本发明实施例5提供的水蛭肽对Eahy926内皮细胞eNOS在mRNA水平的影响；

[0034] 图5为本发明实施例5提供的水蛭肽对Eahy926内皮细胞ICAM‑1在mRNA水平的影响；

[0035] 图6为本发明实施例5提供的水蛭肽对Eahy926内皮细胞MCP‑1在mRNA水平的影响；

[0036] 图7为本发明实施例6提供的水蛭肽对内皮细胞总NO表达量的影响；

[0037] 图8为本发明实施例7提供的水蛭肽对内皮细胞粘附能力的影响。

具体实施方式

[0038] 下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范
围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的
所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。

[0039] 本发明提供了一种水蛭肽，所述水蛭肽的氨基酸序列为EEKYDEEEKLGTPK（SEQ ID NO.1）。

[0040] 发明人研究发现，本发明提供的水蛭肽的浓度在50 800μg/mL范围内对于内皮细~
胞无明显毒性。

[0041] 构建内皮功能紊乱模型，研究发现，本发明提供的水蛭肽能够提高模型中一氧化氮合酶（eNOS）的表达，显著提高NO释放能力，改善内皮细胞功能损伤，因此，该水蛭肽能够
用于制备提高内皮型一氧化氮合酶表达的药物，同时，本发明也提供了一种提高内皮型一
氧化氮合酶表达的药物。

[0042] 发明人继续研究发现，本发明提供的水蛭肽能够抑制内皮功能紊乱模型中包括细胞间黏附分子‑1和单核细胞趋化蛋白‑1在内的内皮细胞功能紊乱相关因子的表达，进而实
现对内皮细胞功能紊乱的抑制，因此，该水蛭肽能够用于制备抑制内皮细胞功能紊乱相关
因子表达以及抑制内皮细胞功能紊乱的药物，同时本发明也提供了一种抑制内皮细胞功能
紊乱相关因子表达的药物、一种抑制内皮细胞功能紊乱的药物。

[0043] 发明人进一步研究发现，本发明提供的水蛭肽能够降低内皮细胞粘附能力，因此，该水蛭肽能够用于制备降低内皮细胞黏附能力的药物，同时本发明也提供了一种降低内皮
细胞黏附能力的药物。

[0044] 下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0045] 实施例1：Eahy926内皮细胞的培养和传代

[0046] 当Eahy926内皮细胞长至培养瓶80 90%时传代，移弃原培养基后加入2mL PBS清~
洗，加入2 mL 0.25%胰酶，37℃培养箱消化2 min，显微镜下观察，当细胞圆缩折光性增强时
移弃胰酶，加入含10%FBS的培养基，吹打细胞至均匀，根据细胞密度传至培养瓶中。

[0047] 实施例2：内皮功能紊乱模型的建立

[0048] 取生长状态良好的Eahy926内皮细胞铺6孔板，细胞密度为30万/孔，培养24h后加入TNF‑α诱导，浓度分别为0，1，5，10，20ng/mL，对照组加入相同体积的DMEM培养基，每组设
三个复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养，6h后进行RT‑PCR实验，检测指标为eNOS，检测结果
如图1所示。

[0049] 结果表明，在TNF‑α浓度为0‑10ng/mL范围内，eNOS mRNA的表达量随着TNF‑α浓度的增加逐渐下降，而在TNF‑α浓度为20ng/mL时，eNOS mRNA的表达量与TNF‑α浓度为10ng/mL
时表达量有所上升。故选定建立内皮损伤模型的TNF‑α为10ng/mL。

[0050] 实施例3：MTT法测水蛭肽对内皮细胞活性的影响

[0051] 取生长状态良好的细胞铺96孔板，细胞密度为8×103/孔，培养24h后加药（水蛭肽），药物浓度分别为0，50，100，200，400和800μg/mL，每组设三个复孔，药物作用24h后，每
孔加入20μL MTT，37℃培养箱内放置4h后吸取弃掉溶液；加入150 μL DMSO/孔，于570 nm波
长下用酶标仪处测定各孔的吸光度值，采用每组的吸光度平均值后来计算各组的细胞存活
率，结果如图2所示。

[0052] 细胞存活率（%）=OD实验组/OD对照组×100。

[0053] 结果表明，在50 800μg/m L范围内，水蛭肽EEKYDEEEKLGTPK对内皮细胞无明显毒~
性。

[0054] 实施例4：水蛭肽最佳作用浓度的筛选

[0055] 检测在最佳TNF‑α浓度10ng/mL诱导下，不同水蛭肽浓度（0‑800μg/mL）下eNOS的表达量，结果如图3所示。

[0056] 结果表明，当水蛭肽EEKYDEEEKLGTPK浓度为200μg/mL，内皮细胞功能障碍程度最低，故以此为最佳药物作用浓度。

[0057] 实施例5：水蛭肽对Eahy926内皮细胞eNOS，ICAM‑1，MCP‑1在mRNA水平的影响

[0058] 选取生长状态良好的细胞铺6孔板，细胞密度为30万/孔。实验分为四组：空白对照组，TNF‑α诱导组（TNF‑α诱导6h），200μg/mL水蛭肽+TNF‑α组（水蛭肽作用24h后TNF‑α诱导
6h）和200μg/mL水蛭肽组（水蛭肽作用24h），每组设3个复孔，提取RNA检测细胞eNOS，ICAM‑
1，MCP‑1的mRNA水平，结果如图4、图5和图6所示。

[0059] 结果表明，水蛭肽EEKYDEEEKLGTPK可以显著减轻内皮细胞功能紊乱相关因子的表达。

[0060] 实施例6：水蛭肽对内皮细胞总NO表达量的影响

[0061] 选取生长状态良好的细胞铺96孔板，每孔8×103个细胞用于实验。实验分为四个组：空白对照组，TNF‑α诱导组（TNF‑α诱导6h），200μg/mL水蛭肽+TNF‑α组（水蛭肽作用24h后
TNF‑α诱导6h）和200μg/mL水蛭肽组（水蛭肽作用24h），组设3个复孔，取上清，离心，用NO检
测试剂盒检测NO表达情况，结果如图7所示。

[0062] 结果表明，水蛭肽EEKYDEEEKLGTPK可以显著提升NO释放能力，改善内皮细胞功能损伤。

[0063] 实施例7：水蛭肽对内皮细胞粘附能力的影响

[0064] 选取生长状态良好的内皮细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞用于实验。实验分为四个组：空白对照组，TNF‑α诱导组（TNF‑α诱导6h），200μg/mL水蛭肽+TNF‑α组（水蛭肽作用24h
后TNF‑α诱导6h）和200μg/mL水蛭肽组（水蛭肽作用24h），每组设置3个复孔，水蛭肽作用24h
后再用TNF‑α诱导6h，弃去培养基，PBS冲洗一次，加入37℃预温10min的THP‑1细胞悬液
6
（2.5*10/mL），置于37℃培养箱中孵育30min，轻轻吹打上清液，加0.1 MEDTA防止细胞凝
集，最后用PBS轻轻冲洗两遍，计数板计数，结果如图8所示。

[0065] 粘附率%=（1‑未粘附细胞计数值/加入的总细胞计数值）×100。

[0066] 结果表明，水蛭肽EEKYDEEEKLGTPK可以显著降低单核细胞对内皮细胞的粘附率，改善内皮功能。具备良好的推广应用潜力和科研价值。

[0067] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。