一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用转让专利
申请号 : CN202110865705.X
文献号 : CN113583117B
文献日 : 2022-04-15
发明人 : 严景华 , 高福 , 李燕 , 马素芳 , 仵丽丽
申请人 : 中国科学院微生物研究所
摘要 :
本发明公开了一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明以大肠杆菌表达的黄热病毒E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期患者的PBMCs中筛选到可以特异结合黄热病毒E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR及PCR扩增，获得抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。本发明获得的6株人源抗体均有很强的YFV中和活性，IC50值达0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的YFVChina的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。
权利要求 :
1.一种抗黄热病毒E蛋白单克隆抗体，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区；所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1 3任一项所述的抗~
体。
5.权利要求1 3任一项所述的抗体在制备治疗和/或预防黄热病毒的药物中的应用。
~
6.编码权利要求1 3任一项所述的抗体的DNA。
~
7.根据权利要求6所述的DNA，其特征在于，编码抗体的重链的核苷酸序列包括CMV 启动子序列、前导序列、编码重链可变区的序列和编码重链恒定区的序列；编码抗体的轻链的序列包括CMV 启动子序列、前导序列、编码轻链可变区的序列和编码轻链恒定区的序列。
8.含有权利要求6或7所述DNA的载体。
9.含有权利要求8所述载体的宿主细胞。
说明书 :
一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用
[0001] 本申请是原申请号为CN201810302091.2，原申请日为2018年04月04日，发明名称为一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
[0003] 黄热病毒（yellow fever virus，YFV），单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种蚊媒传播的可引起人类致病的病原体，同一科病毒还包括寨卡病毒（zika
virus，ZIKV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、西尼罗病毒（west nile virus，WNV）等。YFV
是引起黄热病的重要病原，严重时会引起出血热伴随多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴结、
心、肾。
virus，ZIKV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、西尼罗病毒（west nile virus，WNV）等。YFV
是引起黄热病的重要病原，严重时会引起出血热伴随多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴结、
心、肾。
[0004] 在1996年时，科学家曾估计每年在非洲和南美洲黄热病毒可引起20万人感染，30万人死亡。近两年，巴西、安哥拉和刚果民主共和国等地发生了黄热病暴发，已造成数百人
死亡，死亡率达14%，中国在2016年有11例输入病例。目前，临床上已有减毒疫苗（YFV 17D），
但疫苗短缺和接种率不足导致疾病频繁爆发，非免疫个体仍处于危险之中。在YFV感染后，
临床上没有可用于治疗该疾病的有效的特异性药物。
死亡，死亡率达14%，中国在2016年有11例输入病例。目前，临床上已有减毒疫苗（YFV 17D），
但疫苗短缺和接种率不足导致疾病频繁爆发，非免疫个体仍处于危险之中。在YFV感染后，
临床上没有可用于治疗该疾病的有效的特异性药物。
[0005] 迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黄病毒等。黄病毒表面的E蛋白（Envelope）识别细胞表面的受体，
进而促进病毒膜与细胞膜发生膜融合，由三个不同的结构域（DI，DII和DIII）完成这些过
程。因此，E蛋白是机体免疫系统产生的中和抗体作用的重要表位。
进而促进病毒膜与细胞膜发生膜融合，由三个不同的结构域（DI，DII和DIII）完成这些过
程。因此，E蛋白是机体免疫系统产生的中和抗体作用的重要表位。
[0006] 已有研究发现有一些人源抗体具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黄热病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和 Central African Republic (CAR) 1986、Ethiopia
1961、Senegal1990、Nigeria1987、 Ghana 1927 (Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA 病毒
在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表
位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的
YFV中和抗体。
1961、Senegal1990、Nigeria1987、 Ghana 1927 (Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA 病毒
在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表
位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的
YFV中和抗体。
发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本发明首先以大肠杆菌表达的YFV‑E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期YFV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合YFV‑E蛋白的记忆B细胞，然后
对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR和PCR扩增，获得6株抗体的可变区片段，并进一步与恒定区
连接至表达载体中。测序正确后，经哺乳动物细胞表达、纯化，进行一系列的功能检测，包括
与YFV‑E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测。
对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR和PCR扩增，获得6株抗体的可变区片段，并进一步与恒定区
连接至表达载体中。测序正确后，经哺乳动物细胞表达、纯化，进行一系列的功能检测，包括
与YFV‑E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种抗体，如（1）（6）任一所示：~
[0009] （1）抗体命名为YD2，其重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0010] （2）抗体命名为YD25，其重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
[0011] （3）抗体命名为YD62，其重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
[0012] （4）抗体命名为YD86，其重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
[0013] （5）抗体命名为YD97‑1，其重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
[0014] （6）抗体命名为YD97‑2，其重链可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25，核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26，核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，YD2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2；YD25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3且轻
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:4；YD62的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6；YD86的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7且轻
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；YD97‑1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9且
轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10；YD97‑2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:
11且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:4；YD62的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6；YD86的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7且轻
链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；YD97‑1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9且
轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10；YD97‑2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:
11且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述YD2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:13、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:14。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述YD25的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:16。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述YD62的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:17、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述YD86的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:19、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述YD97‑1的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:21、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:22。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述YD97‑2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:23、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:24。
[0024] 本发明的6个抗体，来源于同一病患者，并且均靶向黄热病毒特有的囊膜蛋白 E蛋白，通过抑制E蛋白介导的受体结合和/或膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。
[0025] 本发明的第二个目的是提供所述抗体在制备药物方面的应用。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述药物是用于治疗和/或预防黄热病毒的药物。
[0027] 本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1或YD97‑2。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1、YD97‑2中的至少2种。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物还含有医学上可接受的载体。
[0030] 本发明的第四个目的是提供一种用于免疫诊断或检测的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1、YD97‑2中任一抗体的抗原，或者编
码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。
码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。
[0031] 本发明的第五个目的是提供编码所述人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1和YD97‑2的基因序列。
[0032] 在本发明的一种实施方式中，所述抗体的重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
[0033] 在本发明的一种实施方式中，所述抗体的轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
[0034] 在本发明的一种实施方式中，编码所述抗体的重链的序列，依次包括CMV 启动子序列、EcoR I酶切位点序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、
Xho I酶切位点序列。
Xho I酶切位点序列。
[0035] 在本发明的一种实施方式中，编码所述抗体的轻链的序列，依次包括CMV 启动子序列、Sac I酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、酶
切位点序列Xho I。
切位点序列Xho I。
[0036] 在本发明的一种实施方式中，所述第一酶切位点序列或第二酶切位点序列包括但不限于EcoR I、Xho I 、Sac I或Xho I的酶切位点序列。
[0037] 在本发明的一种实施方式中，所述前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，编码该前导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
[0038] 本发明的第六个目的是提供含有所述抗体基因序列的载体或者表达所述抗体的细胞。
[0039] 本发明的有益效果：
[0040] 本发明获得了6株人源高中和活性的YFV抗体：YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1和YD97‑2。这6株抗体与已经报道的YFV抗体序列完全不同，是6株新发现的抗体。6株人源抗体
均有很强的YFV中和活性IC 50值达0.03～3.5 ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死
剂量的YFV China的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。
均有很强的YFV中和活性IC 50值达0.03～3.5 ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死
剂量的YFV China的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。
附图说明
[0041] 图1：YFV China‑E蛋白纯化分子筛与SDS‑PAGE结果；
[0042] 图2：Protein A纯化后，抗体SDS‑PAGE结果；
[0043] 图3：抗体与YFV China‑E的动力学曲线结果；
[0044] 图4：抗体对YFV China的中和曲线结果；
[0045] 图5：抗体对感染YFV China‑E小鼠的保护效果；A为存活小鼠体重变化，B为小鼠存活率。
具体实施方式
[0046] 实施例1：黄热病毒E蛋白的表达与纯化
[0047] YFV CNYF01/2016(YFV‑China)病毒株膜蛋白E蛋白‑（氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示）胞外区DNA片段通过NdeI和XhoI酶切后，连接到
pET21a载体上。其中YFV E蛋白编码区的3’ 端连上6个组氨酸标签(hexa‑His‑tag)的编码
序列及翻译终止密码子。再将连接产物转化到BL21大肠杆菌感受态细胞。单克隆接种到40
o
mL LB培养基中，培养6‑8小时。接种到4L的LB培养基中，37 C培养至OD600=0.4‑0.6，加入
o
IPTG至终浓度1mM，37C继续培养4‑6小时。收获包涵体，通过稀释法复性包涵体。复性液浓
缩后换成20 mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0缓冲液,10%甘油。将浓缩后的蛋白溶液进一步以
分子排阻层析纯化，使用AKTA‑purifier(GE)和superdex200 Hiload 16/60柱 (GE)，使用
缓冲液A(20 mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0，10%甘油)，同时监测280 nm的紫外吸收值，收取
目的蛋白，并通过SDS‑PAGE鉴定蛋白纯度。经鉴定，可获得高纯度E单体蛋白，大小为43kDa。
结果如图1。
pET21a载体上。其中YFV E蛋白编码区的3’ 端连上6个组氨酸标签(hexa‑His‑tag)的编码
序列及翻译终止密码子。再将连接产物转化到BL21大肠杆菌感受态细胞。单克隆接种到40
o
mL LB培养基中，培养6‑8小时。接种到4L的LB培养基中，37 C培养至OD600=0.4‑0.6，加入
o
IPTG至终浓度1mM，37C继续培养4‑6小时。收获包涵体，通过稀释法复性包涵体。复性液浓
缩后换成20 mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0缓冲液,10%甘油。将浓缩后的蛋白溶液进一步以
分子排阻层析纯化，使用AKTA‑purifier(GE)和superdex200 Hiload 16/60柱 (GE)，使用
缓冲液A(20 mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0，10%甘油)，同时监测280 nm的紫外吸收值，收取
目的蛋白，并通过SDS‑PAGE鉴定蛋白纯度。经鉴定，可获得高纯度E单体蛋白，大小为43kDa。
结果如图1。
[0048] 实施例2：与YFV China ‑E蛋白结合的特异性记忆B细胞的分离
[0049] 在病人的知情同意下，采集20mL 的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以107/mL的密度与终浓度400nM 的YFV‑E蛋白冰上孵育结合半小时，然后用PBS洗2次，再与下列抗体孵
育：anti‑human CD3/PE‑Cy5，anti‑human CD16/PE‑Cy5，anti‑human CD235a/PE‑Cy5，
anti‑human CD19/APC‑Cy7，anti‑human CD27/Pacific Blue，anti‑human CD38/APC，
anti‑human IgG/FITC，以及anti‑His/PE。抗体冰上孵育半小时后，用PBS洗2次。经
‑ ‑ + + + +
FACSAria III分选收集PE‑Cy5 APC APC‑Cy7 Pacific Blue FITC PE的细胞，直接收
集到96孔板内，1细胞/孔。
育：anti‑human CD3/PE‑Cy5，anti‑human CD16/PE‑Cy5，anti‑human CD235a/PE‑Cy5，
anti‑human CD19/APC‑Cy7，anti‑human CD27/Pacific Blue，anti‑human CD38/APC，
anti‑human IgG/FITC，以及anti‑His/PE。抗体冰上孵育半小时后，用PBS洗2次。经
‑ ‑ + + + +
FACSAria III分选收集PE‑Cy5 APC APC‑Cy7 Pacific Blue FITC PE的细胞，直接收
集到96孔板内，1细胞/孔。
[0050] 实施例3：单一B细胞PCR、序列分析及人源抗体设计
[0051] 将实施例2获得的B细胞通过Superscript III reverse transcriptase（Invitrogen）逆转录，逆转录引物如表1（序列如SED ID NO. 33 至SED ID NO. 40所示），
55℃反应60 min。
55℃反应60 min。
[0052] 表1. 逆转录反应引物
[0053] 引物 5′‑3′ 序列IgM‑RT ATG GAG TCG GGA AGG AAG TC
IgD‑RT TCA CGG ACG TTG GGT GGT A
IgE‑RT TCA CGG AGG TGG CAT TGG A
IgA1‑RT CAG GCG ATG ACC ACG TTC C
IgA2‑RT CAT GCG ACG ACC ACG TTC C
IgG‑RT AGG TGT GCA CGC CGC TGG TC
Cκ‑new RT GCA GGC ACA CAA CAG AGG CA
Cλ‑new‑ext AGG CCA CTG TCA CAG CT
IgD‑RT TCA CGG ACG TTG GGT GGT A
IgE‑RT TCA CGG AGG TGG CAT TGG A
IgA1‑RT CAG GCG ATG ACC ACG TTC C
IgA2‑RT CAT GCG ACG ACC ACG TTC C
IgG‑RT AGG TGT GCA CGC CGC TGG TC
Cκ‑new RT GCA GGC ACA CAA CAG AGG CA
Cλ‑new‑ext AGG CCA CTG TCA CAG CT
[0054] 将此逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶（QIAgen）进行PCR，扩增抗体可变区序列（PCRa）。设计相应的引物，反应条件如下：95℃，5min；95℃ 30s，55℃（重链/κ链）/
50℃（λ链） 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃，7min。将此作为模板再进行第二轮PCR（PCRb），
条件如下：95℃，5min；95℃ 30s，58℃（重链）/60℃（κ链）/64℃（λ链） 30s，72℃ 90s，35个
循环；72℃，7min。
50℃（λ链） 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃，7min。将此作为模板再进行第二轮PCR（PCRb），
条件如下：95℃，5min；95℃ 30s，58℃（重链）/60℃（κ链）/64℃（λ链） 30s，72℃ 90s，35个
循环；72℃，7min。
[0055] 1.2%的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。条带大小在400‑500bp的切胶回收后送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行分析。
[0056] 分析正确的可变区序列与相应的重链/κ链/λ链的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体pCAGGS中。其中重链与λ链以EcoRI和XhoI连接，κ链以SacI与XhoI连接。B细胞测
序及真核细胞表达质粒构建策略如下：
序及真核细胞表达质粒构建策略如下：
[0057] 人源抗体设计策略如下：
[0058] 重链：CMV promoter‑EcoR I‑Leader sequences‑重链可变区‑CH‑Xho I；
[0059] 轻链（κ）：CMV promoter‑Sac I‑Leader sequences‑轻链可变区‑CL(κ)‑Xho I；
[0060] 其中，Leader sequences的氨基酸序列如SEQ ID NO:29（核苷酸序列如SEQ ID NO:30）。
[0061] 实施例4：抗体的表达及纯化
[0062] 用含10%FBS的DMEM培养293T细胞。用实施例3中构建的，含有特定抗体轻、重链编码基因的质粒共转染293T。转染4‑6小时后换液成无血清的DMEM继续培养7天，收集上清。
[0063] 收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0)的缓冲液等体积混合，经过0.22 μm滤膜过滤后，与protein A预装柱结合（5mL，GE Healthcare）。以0.1M
甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS‑
PAGE确定，结果如图2，说明目标蛋白得到正常表达。
甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS‑
PAGE确定，结果如图2，说明目标蛋白得到正常表达。
[0064] 最终，得到了6个能与YFV China‑E蛋白结合且中和活性较强的抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1和YD97‑2。具体基因重排方式如下表2
[0065] 表2抗体基因重排
[0066]
[0067] 实施例5：人源抗体的性能检测
[0068] （1）表面等离子共振技术检测与YFV‑E的结合能力
[0069] 表面等离子共振分析利用Biacore T100（Biacore Inc.）进行。具体步骤如下：
[0070] 首先，将anti‑human IgG的抗体以氨基偶联的方式固定在CM5芯片的通道（flow cell, Fc）。固定量控制在10,000响应值（response units, RU）左右。以抗体捕获的方式结
合纯化的抗体，此时，液流速度控制在10 μL/min，进样1min，抗体捕获量在60 RU左右。再以
10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4溶液倍比稀释YFV China ‑E蛋白，流速调至30 μL/min，
依次通过各通道，从低浓度开始逐一上样YFV‑E蛋白。曲线组成图如图3所示的动力学曲线。
结果如表3所示。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software T100 (Biacore，
Inc.)软件进行。SPR的结果显示，6株抗体均可以与YFV‑E蛋白结合。
合纯化的抗体，此时，液流速度控制在10 μL/min，进样1min，抗体捕获量在60 RU左右。再以
10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4溶液倍比稀释YFV China ‑E蛋白，流速调至30 μL/min，
依次通过各通道，从低浓度开始逐一上样YFV‑E蛋白。曲线组成图如图3所示的动力学曲线。
结果如表3所示。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software T100 (Biacore，
Inc.)软件进行。SPR的结果显示，6株抗体均可以与YFV‑E蛋白结合。
[0071] 表3 抗体与YFV China‑E蛋白结合的动力学常数
[0072] Abs ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)YD2 4.85E+05 9.96E‑06 2.05E‑11
YD25 5.78E+10 4.21E+02 7.28E‑09
YD62 2.02E+05 3.66E‑04 1.81E‑09
YD86 2.57E+05 2.83E‑04 1.10E‑09
YD97‑1 1.08E+04 4.44E‑03 4.12E‑07
YD97‑2 5.92E+02 2.89E‑03 4.88E‑06
YD25 5.78E+10 4.21E+02 7.28E‑09
YD62 2.02E+05 3.66E‑04 1.81E‑09
YD86 2.57E+05 2.83E‑04 1.10E‑09
YD97‑1 1.08E+04 4.44E‑03 4.12E‑07
YD97‑2 5.92E+02 2.89E‑03 4.88E‑06
[0073] （2）中和试验
[0074] 将纯化的抗体3倍倍比稀释，与1:60稀释的YFV(C6/36扩增)混合，37oC共孵育60分o
钟。然后将混合液加入到已铺满Vero细胞的24孔板中，300 μL/孔。37 C孵育1小时后，每孔
补充培养基（DMEM，10% FBS）0.7mL，继续培养40小时后染色。收集细胞，用含4%多聚甲醛，
0.05%的soponin的PBS处理细胞，冰上避光静置30min。然后以solution溶液（PBS，1% BSA，
0.01% soponin）洗涤细胞2次，与2 μg/mL的Z6‑FITC抗体冰上孵育30min后，solution溶液
洗涤细胞2次，用FACSCanto检测细胞阳性比例。根据不同浓度下阳性比例，计算抗体对YFV
的中和能力，如图4所示，结果统计如表4。
钟。然后将混合液加入到已铺满Vero细胞的24孔板中，300 μL/孔。37 C孵育1小时后，每孔
补充培养基（DMEM，10% FBS）0.7mL，继续培养40小时后染色。收集细胞，用含4%多聚甲醛，
0.05%的soponin的PBS处理细胞，冰上避光静置30min。然后以solution溶液（PBS，1% BSA，
0.01% soponin）洗涤细胞2次，与2 μg/mL的Z6‑FITC抗体冰上孵育30min后，solution溶液
洗涤细胞2次，用FACSCanto检测细胞阳性比例。根据不同浓度下阳性比例，计算抗体对YFV
的中和能力，如图4所示，结果统计如表4。
[0075] 表4 抗体对YFV China中和效果
[0076]MAbs IC50 (ug/ml)
YD2 0.22
YD25 3.49
YD62 0.33
YD86 0.031
YD97‑1 0.07517
YD97‑2 0.06248
YD2 0.22
YD25 3.49
YD62 0.33
YD86 0.031
YD97‑1 0.07517
YD97‑2 0.06248
[0077] （3）动物保护试验
[0078] 3周龄雌性Balb/c 小鼠（维通利华公司），以4‑5只分组。每只小鼠颅内注射 80 PFU 病毒YFV China。感染24小时后单一剂量10mg/kg的抗体或等体积的PBS通过腹腔注射
给感染的小鼠。记录14天内小鼠的存活与体重变化。体重变化超过25%或是出现瘫痪症状的
小鼠处死。结果如图5显示。注射YD2抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为
66.7%，存活小鼠体重恢复。注射YD25抗体的小鼠在第10天开始死亡，至第16天的存活率为
66.7%。注射YD86抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为66.7%。注射YD97‑2抗
体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为80%。注射YD62与YD97‑1抗体的小鼠在第
11天开始死亡，至第16天的存活率为100%。注射对照抗体的的4只小鼠在感染后第8天开始
死亡，11天全部死亡（图5）这6株抗体保护率总结如表5。
给感染的小鼠。记录14天内小鼠的存活与体重变化。体重变化超过25%或是出现瘫痪症状的
小鼠处死。结果如图5显示。注射YD2抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为
66.7%，存活小鼠体重恢复。注射YD25抗体的小鼠在第10天开始死亡，至第16天的存活率为
66.7%。注射YD86抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为66.7%。注射YD97‑2抗
体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为80%。注射YD62与YD97‑1抗体的小鼠在第
11天开始死亡，至第16天的存活率为100%。注射对照抗体的的4只小鼠在感染后第8天开始
死亡，11天全部死亡（图5）这6株抗体保护率总结如表5。
[0079] 表5 抗体对感染YFV China小鼠的治疗效果
[0080]Abs 存活率
YD2 66.7%
YD25 66.7%
YD62 100%
YD86 66.7%
YD97‑1 100%
YD97‑2 80%
YD2 66.7%
YD25 66.7%
YD62 100%
YD86 66.7%
YD97‑1 100%
YD97‑2 80%
[0081] 目前，已发现的抗黄热病毒的人源抗体已有5A、7A、R3(27)、1A、2A、R3(9)，基因重排方式为：VH4‑59，VH3‑11，VK1‑12，VL1‑19(GenBank 中序列号分别为: AY661699，
AY661700，AY661701，AY661702，AY661703 和AY661704)：其中5A、7A、R3(27)可以中和2001
年前的部分毒株和疫苗株YFV 17D，中和活性IC50约1‑10ug/ml。无体内动物实验验证其功
能。本实验中6株人源抗体的IC50为3.5~0.03 μg/mL。并且，在动物保护实验中，本发明使用
的抗体剂量为10 mg/kg，其中YD97‑1可以完全保护致死剂量攻击的小鼠。YD2、YD25 、YD86
和YD97‑1对小鼠的保护率为60%以上。
AY661700，AY661701，AY661702，AY661703 和AY661704)：其中5A、7A、R3(27)可以中和2001
年前的部分毒株和疫苗株YFV 17D，中和活性IC50约1‑10ug/ml。无体内动物实验验证其功
能。本实验中6株人源抗体的IC50为3.5~0.03 μg/mL。并且，在动物保护实验中，本发明使用
的抗体剂量为10 mg/kg，其中YD97‑1可以完全保护致死剂量攻击的小鼠。YD2、YD25 、YD86
和YD97‑1对小鼠的保护率为60%以上。
[0082] 综上，本发明通过筛选康复病人的YFV China‑E特异结合的记忆B细胞，获得6株人源高中和活性的YFV抗体：YD2、YD25、YD62、YD86、YD97‑1和YD97‑2。这6株抗体与已经报道的
黄热抗体序列完全不同，是新发现的抗体，均有很强的中和黄热病毒活性。并且，可以完全
或部分保护小鼠免受致死剂量的黄热病毒的攻击。这提示，6株人源抗体有着临床治疗和预
防黄热病的应用价值。
黄热抗体序列完全不同，是新发现的抗体，均有很强的中和黄热病毒活性。并且，可以完全
或部分保护小鼠免受致死剂量的黄热病毒的攻击。这提示，6株人源抗体有着临床治疗和预
防黄热病的应用价值。
[0083] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。
围应该以权利要求书所界定的为准。