抗PR蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202111037447.2
文献号 : CN113583132B
文献日 : 2023-03-07
发明人 : 陈惠玲 , 杨清海 , 王小亚 , 周洪辉 , 高惠然 , 吴楠楠
申请人 : 福州迈新生物技术开发有限公司
摘要 :
本发明涉及一种可以识别人PR抗原的单克隆抗体，其制备方法以及其在免疫检测中的用途。本发明提供一种抗PR蛋白兔单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。该抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PR蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
权利要求 :
1.一种抗PR蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别PR蛋白。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。
5.一种PR蛋白免疫组化检测试剂，其特征在于，所述免疫组化检测试剂含有权利要求
1‑4任一所述的抗PR蛋白单克隆抗体为其有效成分。
说明书 :
抗PR蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗PR蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] PR(Progesterone receptor，孕激素受体)是一种蛋白质分子,是属于甾类激素超家族的细胞内核受体，可与相应的激素结合而发生特异性的反应进而形成激素‑受体复合物，使激素发挥其生物学效应。孕激素受体有两种异构体即PR‑A和PR‑B，它们由三种结构域构成：C‑端结构域主要与孕激素结合，中央结构域是与DNA结合区域，N‑端结构域目前此区域结构不明，可能参与多种反应。
[0003] PR是一个具有双重功能的蛋白，既能以配体依赖的方式作为转录因子直接与核内DNA作用调节转录，又能作为非转录因子调节核外的信号通路。在介导与调节卵巢、子宫和乳腺的功能及生殖活动中起着关键的作用。表达于正常及良恶性子宫内膜和乳腺上皮细胞。
[0004] 研究已经证实ER、PR的表达水平与乳腺癌患者的总生存率、无瘤生存率、无复发生存率、无进展生存率及临床有效率密切相关。研究显示PR状态是独立于ER状态的预测指标，特别是对于绝经前的乳腺癌患者。PR常与ER和HER‑2一起作为乳腺癌患者的常规免疫组化检测项目。
发明内容
[0005] 发明人提供了一种抗PR蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0006] 进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0007] 进一步地，所述单克隆抗体特异性识别PR蛋白。
[0008] 进一步地，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。
[0009] 发明人又提供了一种抗PR蛋白单克隆抗体的制备方法，用于免疫兔的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达；选择306‑455位点的蛋白片段，其为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；优化成适合在大肠杆菌表达的基因片段,其为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；并将该基因片段克隆至pGEX‑4T‑AB1载体上。
[0010] 进一步的，所述重组蛋白包含GST蛋白标签和组氨酸蛋白标签。
[0011] 发明人还提供了上述单克隆抗体在PR蛋白免疫检测中的用途。
[0012] 进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
[0013] 发明人最后提供了一种PR蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有上述单克隆抗体为其有效成分。
[0014] 区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案提供一种抗PR蛋白兔单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。该抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PR蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
[0015] 图1为实施例1融合组氨酸标签的PR重组肽段纯化结果胶图。
[0016] 图2为乳腺癌免疫组化染色结果对比图；其中左为兔单抗PR(14B3)，右为市售PR。
[0017] 图3为子宫内膜免疫组化染色结果对比图；其中左为兔单抗PR(14B3)，右为市售PR。
具体实施方式
[0018] 为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
[0019] 实施例1重组PR蛋白片段的制备
[0020] 一、基因优化与合成
[0021] PR按照Uniprot数据库中登录号为P06401的蛋白质序列，选择306‑455位点的蛋白片段，为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；优化成适合在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)表达的基因片段,为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；并将该基因片段克隆至pGEX‑4T‑AB1载体上。
[0022] 用表达载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli Rosetta(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。
[0023] 选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。PR分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择PR的306‑455位点的基因序列进行密码子优化，分子量约为50kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得PR重组肽段。而重组免疫原由具有抗原性的PR重组肽段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为GST和HIS。
[0024] 二、蛋白表达和纯化
[0025] 按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为100μg/mL的氨苄，37℃振荡培养至OD600为0.6‑0.8，加入0.8mmol/L的IPTG，16℃震荡培养4h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用150mmol/L咪唑进行洗脱，SDS PAGE分离检测。
[0026] 图1为融合组氨酸标签的重组PR蛋白纯化结果胶图。最终纯化蛋白浓度为3mg/mL，纯度80％，可用于动物免疫和抗体筛选与鉴定的要求。
[0027] 实施例2产兔抗人PR单克隆抗体的单一B细胞分选
[0028] 一、免疫和ELISA检测
[0029] 将实施例1中的重组PR蛋白用弗氏完全佐剂乳化，选择6只兔子进行免疫，剂量为300μg/只。分别在第7、21、42、63天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂乳化，剂量为
150μg/只。第95天进行冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为300μg/只。在第三、四、五次免疫后进行血清ELISA效价检测，其中4只兔子第四次免疫的血清进行IHC检测，根据结果(即用与抗体相对应的阳性对照片进行检测，阳性对照片中相应的检测位点上可观察到免疫组化染色)，选择其中1只兔子进行后续单抗筛选。
150μg/只。第95天进行冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为300μg/只。在第三、四、五次免疫后进行血清ELISA效价检测，其中4只兔子第四次免疫的血清进行IHC检测，根据结果(即用与抗体相对应的阳性对照片进行检测，阳性对照片中相应的检测位点上可观察到免疫组化染色)，选择其中1只兔子进行后续单抗筛选。
[0030] 二、脾脏细胞分离和B淋巴细胞分选
[0031] 对选定兔子进行单抗制备。冲击免疫3天后取脾脏，兔子脾脏置于含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RMPI基础培养基中，用手术刀片切为碎块后转移到100μm的细胞筛网中研磨。将所得细胞悬浊液滤去大的细胞团块和组织包膜，在400g下离心5分钟后去上清后保留脾脏细胞团。脾脏细胞团用低渗溶液重悬并裂解红细胞后再次于400g下离心5分钟，保留脾脏细胞。脾脏细胞用100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RMPI基础培养基重悬，400g下离心5分钟，所得脾脏细胞用完全培养基(含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RMPI基础培养基)重悬备用。
[0032] B淋巴细胞分选具体步骤参见中国专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》。
[0033] 分选和培养2000个左右单一B细胞克隆，通过ELISA初筛出特异识别实施例1中的重组PR蛋白的阳性克隆，根据ELISA数据，选择从高到低的50个上清做IHC验证。
[0034] 三、B细胞培养阳性克隆检测
[0035] 使用包含PR阳性和阴性的多肿瘤组织芯片和正常组织芯片对单一B细胞培养上清进行IHC验证，其中13个克隆培养上清的IHC结果较好制备LEM上清，进行IHC验证，确定敏感性和特异性均优良的克隆(14B3)。
[0036] 敏感性和特异性筛选标准为：用与抗体相对应的阳性对照片进行检测，阳性对照片中相应的检测位点上可观察到免疫组化染色，而非检测位点上未观察到任何免疫组化染色。与对照抗体比较，染色强度达到甚至高于对照抗体。
[0037] 四、亲和常数测定
[0038] 包被PR抗原多肽，包被浓度为2μg/ml,100μL/孔，4℃包被过夜，PBS‑T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS‑T洗3次。将纯化的(14B3)单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS‑T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBS‑T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸‑磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍
10
数A。利用下列公式计算出亲和常数为1.82×10 。
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数A。利用下列公式计算出亲和常数为1.82×10 。
[0039]
[0040] 五、编码兔单克隆抗体基因的克隆(14B3)和兔单克隆抗体表达质粒构建
[0041] 阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。
[0042] 用上述确定的天然配对的兔单克隆抗体轻和重链可变区基因序列分别构建兔单克隆抗体表达载体质粒。
[0043] 实施例2由福州迈新生物技术开发有限公司委托武汉爱博泰克生物科技有限公司完成，其中由福州迈新生物技术开发有限有公司进行免疫组化筛选。
[0044] 实施例3 PR兔单克隆抗体表达
[0045] 一、质粒扩增和提取
[0046] 取出一管(100μl)感受态菌(DH5α)，插入冰上，冰浴5‑10min；加入5μl质粒轻轻震荡后放置冰上30min；轻轻摇匀后放入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5min；在超净工作台中向上述中分别加入800μl LB培养基(注：不含抗生素)，轻轻混匀，固定在摇床上37℃震荡1h；在超净工作台中取上述转化混合液50‑100μl，分别滴加至已标记好的含Amp的固体LB平板培养皿中，用玻璃涂布棒(灭菌)涂布均匀；先在37℃培养箱中正置
30min，令表面的菌液完全渗透至培养基中，再倒置放入37℃培养箱中过夜培养。用枪头挑取单菌落打入4ml LB培养基中(含2uL 200mg/mlAmp)，37℃摇床培养16h，37℃，220rpm。
30min，令表面的菌液完全渗透至培养基中，再倒置放入37℃培养箱中过夜培养。用枪头挑取单菌落打入4ml LB培养基中(含2uL 200mg/mlAmp)，37℃摇床培养16h，37℃，220rpm。
[0047] 加1ml菌液至100ml LB培养基中(含50μl 200mg/ml Amp)，37℃摇床培养16h；使用SanPrep去内毒素质料DNA小量抽提试剂盒(生工)，根据说明书进行质粒提取。
[0048] 二、转染
[0049] 用Expi293FTM Expression Medium将293F细胞浓度调整浓度至2.5‑3×106 viable cells/ml，并过夜培养。
[0050] 1)用血球计数板计数，活细胞浓度约为4.5‑5.5×106 viable cells/ml，且活细胞数需达到表达体系的要求；
[0051] 2)用Expi293FTM Expression Medium稀释细胞浓度至3×106 viable cells/ml；
[0052] 3)将质粒DNA加入Opti‑MENTM I Ruduced Serum Medium中，轻轻吹打，颠倒混匀；
[0053] 4)轻轻颠倒ExpiFectamineTM 293 Reagent 4‑5次，将ExpiFectamineTM 293 Reagent和Opti‑MENTM I Ruduced Serum Medium混合，温和吹打和颠倒2‑3次，室温下放置5min；
[0054] 5)将步骤3)和4)的溶液混合，温和吹打和颠倒2‑3次，混匀；
[0055] 6)将步骤5)溶液放置于室温10‑20min；
[0056] 7)缓慢得将混合液吸至细胞培养液中，并温和摇晃三角瓶；
[0057] 8)8％CO2，37℃摇床培养5‑7天；
[0058] 9)18‑22小时后，加入ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer1和ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer2(注：使用前提前混合)，并温和摇晃混匀，继续培养。
[0059] 三、单克隆抗体的纯化
[0060] 用HiTrap rProtein A FF亲和层析法按说明书从上清中纯化抗体。SDS‑PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于‑20℃。
[0061] 实施例4.免疫组化组织芯片染色和鉴定
[0062] 一.芯片制备过程
[0063] 对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体蜡块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入‑20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入‑4℃冰箱保存。
[0064] 二.IHC染色及分析
[0065] 常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H2O2孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15‑30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3‑10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)‑95％(3分钟)‑100％(3分钟)‑100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
[0066] 免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
[0067] 1、样本为弱阳性；标记为“+”；
[0068] 2、样本为中度阳性；标记为“++”；
[0069] 3、样本为高度阳性；标记为“+++”。
[0070] 4、样本为阴性，标记为“‑”。
[0071] 三.数据统计
[0072] 1、肿瘤组织芯片检测结果：
[0073] 将本抗体PR(14B3)和市售抗体PR(1E2)在17例乳腺癌肿瘤集的进行同步检测并比较检测结果。
[0074] PR的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：
[0075]
[0076] 结果显示:兔单抗PR(14B3)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率与市售抗体相当，但阳性强度高于市售抗体。有1例乳腺癌的对照PR抗体出现明显背景染色，而本发明的PR抗体则背景清晰，无非特异性染色出现。说明其特异性更高，有效避免假阳性结果。
[0077] 图2为乳腺癌免疫组化染色结果对比图(左为本发明兔单抗PR，右为市售1E2)。
[0078] 2、正常组织芯片检测结果：
[0079] 正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。
[0080] 将本兔单抗PR(25C4)和市售PR抗体(市售1E2)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。
[0081] 图3为子宫内膜免疫组合染色结果对比图(左为兔单抗PR，右为市售PR)。
[0082] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
[0083] 需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。