CAR-T细胞及其制法转让专利
申请号 : CN202111156273.1
文献号 : CN113583143B
文献日 : 2021-12-07
发明人 : 刘庆喜 , 许晓椿 , 肖海蓉 , 魏卿 , 赵梦莲
申请人 : 英科博雅基因科技(天津)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种嵌合抗原受体,其特征是,包括:a)作为第一信号的抗原结合结构域、b)跨膜结构域、
c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及d)表达IL‑7和CCL‑17细胞因子的第三信号域;
该嵌合抗原受体包含序列2所示的氨基酸序列。
2.一种重组质粒,其特征是,其具有如序列1所示的核苷酸序列。
3.一种CAR‑T细胞,其特征是,其能够分泌表达IL‑7、CCL17因子和/或PD‑1、GM‑CSF抗体,并且该CAR‑T细胞转染了表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列。
4.制备权利要求3所述CAR‑T细胞的方法,其特征是,其包括以下步骤:(1)质粒合成:
使用载体pLVX‑EF1a‑IRES‑PGK‑puro合成CAR‑19‑1质粒,该质粒具有序列1所示的核苷酸序列,并且该质粒序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4‑1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL‑7、CCL17序列构成;
使用载体pLVX‑EF1a‑IRES‑PGK‑puro合成CAR‑19‑2质粒,该质粒具有序列3所示的核苷酸序列,并且该质粒序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4‑1BB信号、CD3ζ的包浆信号序列构成;
使用载体pLVX‑mCherry‑C1合成CAR‑19‑3质粒,该质粒具有序列5所示的核苷酸序列,并且该质粒序列是由anti‑PD‑1scFv单链可变区、anti‑GM‑CSF scFv单链可变区序列构成;
(2)病毒包装:
使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装,293T培养基为添加10% FBS 的DMEM‑H培养基,慢病毒包装培养基为添加1% GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5% FBS的Opti‑MEMI培养基;
6
将293T细胞以7x10个细胞/孔的密度接种于含12 mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中,置于37℃、5% CO2条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95%;
将孵育过夜的培养皿每皿去除6 mL的慢病毒包装培养基,接着向每个皿中加入6mL 的A液‑B液混合液,轻混使其分布均匀后置于37℃、5% CO2条件下孵育进行转染;转染6小时后更换293T培养基继续孵育;
至转染24小时后,收集12mL细胞上清液,并加入提前预热的12mL的293T培养基,继续于
37℃、5% CO2条件下孵育进行转染;
至转染54小时后第二次收集细胞上清液,与首次收集上清液混合,得细胞上清液;
在室温下,将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟,去除细胞碎片沉淀物,再使用0.45μm滤器过滤上清,得病毒上清液;
按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合,4℃孵育2h,然后于4℃处离心至离心管底有米白色沉淀;
小心移去上清,加入适量体积的DMEM重悬沉淀,得到慢病毒浓缩液,测定其病毒滴度;
(3)T细胞制备:
向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体,室温混合30分钟;
再向上述1mL全血内添加150μL微泡,室温混合20分钟,将微泡和被抗体标记的细胞结合,离心;
用200µL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内,用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡,并入EP管内,室温下孵育30min;上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA;
+
用超声波破泡,离心,收集细胞沉淀,制得T细胞为CD8 T细胞,对其进行流式细胞仪鉴定;
(4)T细胞激活、转导与扩增:
+ 5
将收集的CD8 T细胞以5x10 个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中,使用激活培养基刺激
24‑48小时,接着加入MOI=10的慢病毒浓缩液以及转导培养基进行病毒转导,24‑48小时后换成维持培养基;扩增至6‑8天时,收获CAR‑T细胞;
其中,所述A液‑B液混合液是将A液与B液混匀后置室温孵育15min得到的;A液配置方法为:将Opti‑MEMI减血清培养基恢复至室温,使用1.5ml的Opti‑MEMI与41µL的Lip3000在
10cm皿中混匀,得A液;B液配置方法为:将1.5ml的Opti‑MEMI、35µL的P3000Enhancer、12µg质粒混合物混合,得B液;其中,质粒混合物的质粒比为,PMD2.G:pSPAX2:CAR‑19‑1=1:3:4。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征是,其中:微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA、酒石酸钠25mg/L、脯氨酸120mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述激活培养基是包含30ng/mL anti‑CD3和
20ng/mL CD28的X‑VIVOTM15 Medium。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述转导培养基是包含200U/mL IL‑2和5µg/mL Polybrene的X‑VIVOTM15 Medium。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述维持培养基是包含200U/mL IL‑2 的X‑VIVOTM15 Medium。
说明书 :
CAR‑T细胞及其制法
技术领域
CAR‑T细胞的制备方法及其用途。
背景技术
是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法,即嵌合抗原受体T(CAR‑T)免疫疗法。CAR‑T免疫疗
法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案,通过体外基因转导技术,将编码
嵌合抗原受体CAR‑T 基因序列导入T细胞中,生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。最
常见的CARs包括了一段抗原识别区,比如单克隆抗体(mAb)的单链可变区段(scFv),和激活
T细胞胞内信号域的TCRζ链。
细胞在体内存活时间及抗肿瘤效果;CCL‑17也被称作胸腺和活化调节趋化因子,能够提高
内源性免疫细胞向肿瘤细胞的聚集能力,进一步增强免疫细胞的抗肿瘤效果。但该疗法却
受到其相关毒副作用的限制,如细胞因子释放综合症和神经毒性等。细胞因子综合症主要
指免疫细胞与肿瘤细胞作用的过程中,大量释放细胞因子以至于引起进一步的连锁反映,
如过度炎症引起的高热寒战、呼吸困难、凝血障碍等,神经毒性引起的头疼、意识模糊、认知
改变、语言障碍等症状,最终危及生命。近期,有研究表明单核细胞和巨噬细胞促进CAR‑T细
胞治疗后的CRS和神经毒性进展,中和巨细胞集落刺激因子(GM‑CSF)能够减缓CAR‑T细胞治
疗后的CRS及神经毒性,且不会抑制CAR‑T的功能(Sterner RM, Sakemura R, Cox MJ. GM‑
CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but
enhances CAR‑T cell function in xenografts. Blood. 2019 Feb 14;133(7):697‑
709. doi: 10.1182/blood‑2018‑10‑881722. Epub 2018 Nov 21.)。利用RNA干扰技术高
效率敲低CAR‑T细胞内GM‑CSF表达或分泌表达中和GM‑CSF的anti‑GM‑CSF scFv,预防或减
缓细胞因子释放综合症和神经毒性的发生发展,提高CAR‑T疗法的安全性。
键因素,而免疫细胞如T细胞会被肿瘤微环境中免疫检查点分子所抑制,如程序性死亡受体
(PD‑1),PD‑1在机体中可以下调免疫系统对人体细胞的反映,以及通过抑制T细胞炎症活动
来调节免疫系统并促进自身耐受,预防自身免疫性疾病产生,但也可以结合传导抑制性信
号,如结合PDL‑1配体诱导导致细胞死亡(AICD)产生,限制了体内免疫细胞或CAR‑T细胞在
体内的持续存在。所以通过PD‑1抗体来封闭PD‑1免疫检查点,进而修复CAR‑T细胞的功能。
T细胞。
发明内容
细胞。
进一步提高CAR‑T的肿瘤细胞杀伤能力。为了增强杀伤效果及降低CRS及神经毒性副作用,
同时构建分泌中和PD‑1、GM‑CSF的anti‑PD‑1、anti‑GM‑CSFscFv的质粒。
有序列1所述核苷酸序列;
核苷酸序列;
钠、5% FBS的Opti‑MEMI培养基;
小时后更换293T培养基继续孵育;
是包含如下组分的水溶液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷
酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA;
时后换成维持培养基;扩增至6‑8天时,收获CAR‑T细胞。
41µL的Lip3000在10cm皿中混匀,得A液;B液配置:将1.5ml的Opti‑MEMI、35µL的P3000
Enhancer、12µg质粒混合物混合,得B液;其中,质粒混合物的质粒比为,PMD2.G:pSPAX2:
CAR‑19‑1=1:3:4。
Medium;维持培养基是包含200U/mL IL‑2 的X‑VIVOTM15 Medium。
血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钠25mg/L、脯氨酸120mg/L。如本文所述的,出人意料的
+
发现,使用同时包含酒石酸钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得T细胞中CD8 T细胞占分
选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
具体实施方式
生物科技有限公司),lip3000转染试剂(内含P3000 Enhancer)、Opti‑MEM减血清培养基、丙
酮酸钠、DMEM‑H、calcein AM(ThermoFisher)、DiI细胞膜荧光探针(meilunbio),HIV‑1 P24
蛋白快速检测卡、慢病毒滴度(HIV P24)ELISA检测试剂(博奥龙),Polybrene(合生基因)、
BioGeek TM 慢病毒浓缩试剂盒(合生基因),Millipore一次性针头滤器0.45µm
(Millipore),96孔板、24孔板、6孔板、10CM、T25培养瓶、T75培养瓶、5ml移液管、10ml移液
管、25ml移液管(Corning‑Costar),X‑VIVOTM15 Medium(LONZA),Ultra‑LEAF Purified
anti‑mouse CD28、Ultra‑LEAF Purified anti‑mouse CD3ε(Biolegend),IL‑2
(Peprotech),BD Pharmingen™ Biotin Mouse Anti‑Human CD8、PerCP‑Cy™5.5 Mouse
Anti‑Human CD8(BD),慢病毒载体(淼灵生物),序列合成(通用生物),GM‑CSF ELISA试剂盒
(Abcam)。其余常用试剂和材料均为市售可得。
(安徽)有限公司合成。
CCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGGCAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCT
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Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
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GCGGAGGCGGTAGCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCCACACTGTCCCTGTCCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTG
AGCTGCAGAGCCTCCAAGGGCGTGAGCACCTCCGGCTACAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGC
CCCCAGGCTGCTGATCTACCTGGCCTCCTACCTGGAGTCCGGCGTGCCCGCTAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCA
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CCTCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCGGCGCCACAAACTTTAGCCTGCTGAAGCAGGC
CGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGCCCACAGGTGCAGCTCGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCGCCA
GCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTACATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGA
CAGGGCCTGGAGTGGATGGGATGGATCAATCCTAACAGCGGCGGCACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGT
GACAATGACAAGGGATACCTCCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGGCTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGT
ACTACTGCGTGAGAAGAGATAGGTTTCCCTACTACTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCC
GGCGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGTAGCGGCGGAGGAGGATCTGAGATCGTGCTCACCCAGTCCCCCGCCACCCT
GTCCGTGTCCCCTGGAGAGAGGGCCACACTGAGCTGTAGAGCCTCCCAGAGCATCGGCTCCAATCTGGCCTGGTACC
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
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Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
PMD2.G:pSPAX2:(CAR‑19‑1/CAR‑19‑3)=1:3:(4/3),在转导类型为CAR‑2=(CAR‑19‑2)+
(CAR‑19‑3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G:pSPAX2:(CAR‑19‑2/CAR‑19‑3)=1:3:
(3.5/3),在转导类型为CAR‑3=(CAR‑19‑2)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G:
pSPAX2:CAR‑19‑2=1:3: 3.5,在转导类型为CAR‑4=(CAR‑19‑1)的情况下质粒混合物的质粒
比为PMD2.G:pSPAX2:CAR‑19‑1=1:3:4,PMD2.G、pSPAX2、pLVX‑EF1a‑IRES‑PGK‑puro和pLVX‑
mCherry‑C1均为淼灵生物公司产品)
染6小时后更换293T培养基继续孵育。
g/mL Polybrene、200nM丙酮酸钠。
基即稀释液加入96孔圆底培养板的16个孔中,采用4孔x4孔的模式。将15μL浓缩的慢病毒悬
液加至第一排的各孔中,总体积150μL,依次按照1:10稀释剩余三排细胞。
康男性志愿者(26 33岁,体重58 71kg),分别进行T细胞的制备。
~ ~
合。
液是包含如下组分的水溶液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水
磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA)。
围内。
氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白(HAS)、2mM
+
EDTA、酒石酸钠25mg/L、脯氨酸120mg/L,所得T细胞同法鉴定CD8T细胞。实施例3b:参照实
施例3之“1、T细胞制备”,不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶
液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人
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血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钠25mg/L,所得T细胞同法鉴定CD8 T细胞。实施例3c:
参照实施例3之“1、T细胞制备”,不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的
水溶液:氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、
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1%人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、脯氨酸120mg/L,所得T细胞同法鉴定CD8T细胞。由8名健
康男性志愿者全血使用上述实施例3及实施例3a 3c制得的T细胞经检测,结果如下:分选前
~
+ +
CD8 T细胞占外周血单个核细胞的比例(%)=6.38±1.31,实施例3分选后CD8 T细胞占分选
+
后总单个核细胞的比例(%)=61.47±9.24**,实施例3a分选后CD8 T细胞占分选后总单个
+
核细胞的比例(%)=86.35±10.51,实施例3b分选后CD8 T细胞占分选后总单个核细胞的比
+
例(%)=58.84±8.47**,实施例3c分选后CD8 T细胞占分选后总单个核细胞的比例(%)=
63.73±11.53**,其中**是与实施例3 a组比较p<0.01。由此结果可见,使用同时包含酒石
+
酸钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得T细胞中CD8 T细胞占分选后总单个核细胞的比例
显著高于不加二种试剂的情形。
enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo[J]
.Mol Ther, 2009, 17(8): 1453‑64; Lamers CH, van Steenbergen‑Langeveld S, et
al. T cell receptor‑engineered T cells to treat solid tumors: T cell
processing toward optimal T cell fitness. Hum Gene Ther Methods. 2014 Dec;25
(6):345‑57. doi: 10.1089/hgtb.2014.051.)进行。简述如下:
实施例2所得慢病毒浓缩液(MOI=10)以及转导培养基(X‑VIVOTM15 Medium,内含200U/mL
IL‑2和5µg/mL Polybrene)进行病毒转导,24‑48小时后换成维持培养基(X‑VIVOTM15
Medium,内含200U/mL IL‑2);扩增至6‑8天时,收获CAR‑T细胞。
6
小时内检测可放入2‑8℃储存),避免反复冻融,细胞沉淀调整(2‑4)x10 cells每管,每管样
本使用1mL的Trizol裂解液10min(4℃)后放入‑80保存备用。
人源的PD‑1重组蛋白包被酶标板,带HRP标记的山羊抗人IgG(H&L)的二抗检测,以商品化
的PD‑1抗体作为标准品,待测样本5倍稀释后定量检测基因修饰后的T细胞分泌PD‑1抗体的
表达量)。
心(1000rpm/min,5min),检测;设置最大释放孔加入裂解液(2.5% TritonX‑100),自发释放
孔加入PBS,处理后置于酶标仪扫描读取荧光值。根据以下公示计算各组效应细胞的细胞毒
性:
明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式
的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。