本发明属于生物高分子合成领域，具体涉及一种模拟天然抗冻糖蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法，其特点是模拟天然抗冻糖蛋白的结构，结合R‑NCA开环聚合法和“点击化学”法，在聚类肽中同时接入亲水性糖侧链以及疏水性烷基侧链，从而使得聚类肽具备抗冻性能并保持类肽本身的生物相容性、易加工性等优良特性。本发明通过控制聚类肽分子链上烷基链的含量和位置以及糖的种类和含量，来实现减缓冰晶生长并抑制冰重结晶的目的。
1.一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽，其特征在于，包括无规或嵌段含糖聚类肽，其中，所述无规含糖聚类肽，如式(I)所示：
Ⅰ式中，X为伯胺基，R'为甲基、乙基、丙基或者异丙基链段，R为乙酰氨基或者羟基，n取值于10‑200之间，m取值于10‑200之间，三唑环与糖之间有0‑6个亚甲基；
Ⅱ式中，X为伯胺基，R'为甲基、乙基、丙基或者异丙基链段，R为乙酰氨基或者羟基，n取值于10‑200之间，m取值于10‑200之间，三唑环与糖之间有0‑6个亚甲基。
2.如权利要求1所述的模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法，其特征在于，所述无规含糖聚类肽的制备步骤如下：(1)将乙胺、一水乙醛酸依次加入溶剂中反应，待反应完成后除去溶剂，加入盐酸加热回流过夜，反应结束后旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂，产物用甲醇/乙醚重结晶纯化，过滤后干燥获得2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐；
(2)向步骤(1)的产物中加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺，反应完成后经萃取、分离干燥得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸；
(3)向步骤(2)产物中加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑乙基‑NCA；
(4)将步骤(1)中乙胺替换为丙胺、异丙胺或者炔丙胺，依次进行步骤(1)、(2)和(3)，分别得到N‑丙基‑NCA、N‑异丙基‑NCA和或N‑炔丙基‑NCA；
(5)将N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸和碘甲烷加入溶剂中，在0℃下缓慢加入氢化钠，室温搅拌过夜再加入碘甲烷和氢化钠，反应过夜后经后处理得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑甲基‑NCA；
(6)N‑炔丙基‑NCA与N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA依设计比例投料，再按设计聚合度比例加入伯胺引发开环聚合，合成无规聚类肽；
(7)将叠氮糖、五甲基二乙烯三胺PMDETA、溴化亚铜CuBr加入步骤(6)得到的无规聚类肽中，通过点击化学反应、脱乙酰基反应、透析和冷冻干燥后得到具有抗冻特性的无规含糖聚类肽。
步骤(1)中，在室温下选二氯甲烷作溶剂进行反应，搅拌反应24小时；所述乙胺与一水乙醛酸物质的量之比是1：2‑2.5；所加盐酸浓度为1mol/L，其中盐酸与乙胺物质的量之比是
5：1；加热回流的温度为120℃，时间为24h，用甲醇/乙醚重结晶过夜；
步骤(2)中，所述2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐、二碳酸二叔丁酯、三乙胺的投料比是1：
1.5‑2.5：5；具体为：在水中搅拌过夜；用正己烷洗涤反应混合物两次，加1mol/L盐酸改变pH至2以下，用乙酸乙酯萃取混合物3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
步骤(3)中，以无水二氯甲烷为反应溶剂，三氯化磷与步骤(2)产物的物质的量之比是
1‑1.5：1；具体为：在0℃及氮气环境中反应，搅拌2‑3h；在减压条件下除去挥发性物质，加无水二氯甲烷萃取N‑乙基‑NCA；除去二氯甲烷后用无水四氢呋喃/无水正己烷进行沉降纯化三次；
步骤(5)中，首次加N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸、碘甲烷和氢化钠物质的量之比是1:4:5，过夜后再加入2当量的碘甲烷和1.5当量的氢化钠；溶剂为无水四氢呋喃；反应完成后加入乙酸乙酯和蒸馏水溶解反应产物，旋蒸溶剂后，残留物再溶解在乙醚和蒸馏水中，醚相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，合并水相后用1M盐酸水溶液酸化至pH＝2，再用乙酸乙酯萃取，并用蒸馏水、Na2S2O3水溶液、饱和食盐水依次洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应条件与N‑乙基‑NCA的关环反应相同；
步骤(6)中，在手套箱中进行，无水四氢呋喃为溶剂，反应温度为50℃，反应时间36‑
72h；N‑甲基‑NCA、N‑炔丙基‑NCA以及伯胺引发剂的物质的量之比是n：m：1；N‑甲基‑NCA替换为N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA时物质的量比例相同；反应完成后，将正己烷加入到反应混合物中沉降，分离干燥后获得设计聚合度的无规聚类肽；
步骤(7)中，以DMF为溶剂，无规聚类肽所含炔丙基：叠氮糖：五甲基二乙烯三胺(PMDETA)：溴化亚铜(CuBr)的物质的量之比为100：120‑200：33：33；在50℃下搅拌反应24h；
反应完成后透析48h，冻干处理获得白色蓬松物质；蓬松物质加入到0.05M的甲醇/甲醇钠溶液，在0℃下搅拌反应2‑4h；透析48h，冻干处理获得具有抗冻效果的无规含糖聚类肽；
6.如权利要求1所述的模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法，其特征在于，所述嵌段含糖聚类肽的制备步骤为：(1)将乙胺、一水乙醛酸依次加入溶剂中反应，待反应完成后除去溶剂，加入盐酸加热回流过夜，反应结束后旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂，产物用甲醇/乙醚重结晶纯化，过滤后干燥获得2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐；
(2)向步骤(1)的产物中加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺，反应完成后经萃取、分离干燥后得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸；
(3)向步骤(2)产物中加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑乙基‑NCA；
(4)将步骤(1)中乙胺替换为丙胺、异丙胺或者炔丙胺，进行步骤(1)、(2)和(3)，分别得到N‑丙基‑NCA、N‑异丙基‑NCA和或N‑炔丙基‑NCA；
(5)把N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸和碘甲烷加入溶剂中，在0℃下缓慢加入氢化钠，室温搅拌过夜再加入碘甲烷和氢化钠，反应过夜后经后处理得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑甲基‑NCA；
(6)按设计聚合度比例先用伯胺引发N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA开环聚合，完全反应后加入N‑炔丙基‑NCA，合成嵌段聚类肽；
(7)将叠氮糖、五甲基二乙烯三胺(PMDETA)、溴化亚铜(CuBr)加入步骤(6)得到的嵌段聚类肽中，通过点击化学反应、脱乙酰基反应、透析和冷冻干燥后得到具有抗冻特性的嵌段含糖聚类肽。
步骤(1)中，在室温下选二氯甲烷作溶剂进行反应，搅拌反应24小时；所述乙胺与一水乙醛酸物质的量之比是1：2‑2.5；所加的盐酸浓度为1mol/L，其中盐酸与乙胺物质的量之比是5：1；加热回流的温度为120℃，时间为24h，用甲醇/乙醚重结晶；
步骤(2)中，所述2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐、二碳酸二叔丁酯、三乙胺的投料比是1：
1.5‑2.5：5；具体为：在水中搅拌过夜；用正己烷洗涤反应混合物两次，加1mol/L盐酸改变pH至2以下，用乙酸乙酯萃取混合物3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥，旋蒸挥发溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
步骤(3)中，以无水二氯甲烷为反应溶剂；三氯化磷与步骤(2)反应物的物质的量之比是1‑1.5：1；具体为：在0℃及氮气环境中反应，搅拌2‑3h；在减压条件下除去挥发性物质，加适量无水二氯甲烷萃取N‑乙基‑NCA；除去二氯甲烷后用无水四氢呋喃/无水正己烷进行沉降纯化三次；
步骤(5)中，首次加N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸、碘甲烷和氢化钠物质的量之比是1:4:5，过夜后再加入2当量的碘甲烷和1.5当量的氢化钠；溶剂为无水四氢呋喃；反应完成后加入乙酸乙酯和蒸馏水溶解反应产物，旋蒸溶剂后，残留物再溶解在乙醚和蒸馏水中，醚相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，合并水相后用1M盐酸水溶液酸化至pH＝2；再用乙酸乙酯萃取，并用蒸馏水、Na2S2O3水溶液、饱和食盐水依次洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应条件与N‑乙基‑NCA的关环反应相同；
步骤(6)中，在手套箱中进行，无水四氢呋喃为溶剂，反应温度为50℃，反应时间96小时；N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA先被伯胺引发投料比为n：1，单体完全反应后加N‑炔丙基‑NCA与伯胺引发剂投料比是m：1；反应完成后，将正己烷加入到反应混合物中沉降，分离干燥后获得设计聚合度的嵌段聚类肽；
步骤(7)中，嵌段聚类肽中炔丙基：叠氮糖：五甲基二乙烯三胺PMDETA：溴化亚铜CuBr的物质的量之比为100：120‑200：33：33；以DMF为溶剂，在50℃下搅拌反应24h；反应完成后透析48h，冻干处理获得白色蓬松物质；蓬松物质加入到0.05M的甲醇/甲醇钠溶液，在0℃下搅拌反应2‑4h；透析48h，冻干处理获得具有抗冻效果的嵌段含糖聚类肽；
10.将权利要求1所述的模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽作为抗冻剂用于细胞、组织、器官或冷冻食品的低温冷冻保存。
一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物高分子合成领域，具体涉及一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法。
背景技术
[0002] 抗冻糖蛋白(AFGPs)是使生物体在严寒环境中生存必不可少的材料。鱼、细菌和其他生物产生的AFGPs具有调节冰成核和冰晶体生长的能力，可使其具有在零度以下生存的能力。AFGPs的这一独特特性因其潜在的医学和工业应用价值而引起了人们的极大兴趣。AFGPs能够降低溶液的冰点，通过与胚胎冰晶相互作用来阻止冰晶的进一步生长并具有抑制重结晶的能力。典型的AFGPs由重复的三肽单元丙氨酸‑丙氨酸‑苏氨酸(Ala‑Ala‑Thr)组成，每个苏氨酸残基上都附着一个β‑D‑半乳糖基‑(1→3)‑α‑D‑N‑乙酰基半乳糖胺，并且其结构和功能是多样性的。
[0003] 然而从自然界分离AFGPs极其困难，成本高昂，很难做到大规模生产应用。有部分研究报道了AFGPs相关化合物的合成，但是这些化合物并不具有理想的抗冻活性。迄今为止缺乏成功的主要原因是AFGPs的构建存在固有的困难，所述AFGPs具有相对大的分子质量并且包含高密度的糖残基。
[0004] 聚类肽是N取代的甘氨酸聚合物，于1990年代初被合成出来，是一种新型多肽类似物，可以克服多肽的许多缺点，特别是生物利用度差的缺点。聚类肽代表一类拟肽聚合物，其特征在于脂肪族聚酰胺主链上的氮原子含有取代基。与多肽相反，聚类肽在骨架上缺乏立体异构中心，并且由于N取代基而没有广泛的氢键相互作用，因此其构象主要受侧链的空间和电子特性控制，并且能够溶于许多溶剂中。已有研究证明，聚类肽具有可降解性、生物相容性和热加工性，因此在各种生物技术中具有潜在的应用价值。类肽低聚物常通过直接和模块化的固相亚单体合成法，从而制备带有不同侧链、序列和链长精确可控的聚类肽。另外，使用亲核引发剂如伯胺，N取代的N‑羧基酐(NNCA)可以与基于氨基酸的NCA单体相同的方式进行开环聚合，合成聚类肽。因其具有优异的性能，聚类肽被认为是一种在生物应用方面很有前景的聚合物材料。
[0005] 本发明从模拟天然抗冻蛋白结构出发，结合NNCA开环聚合法和“点击化学”法合成含糖聚类肽，在聚类肽中同时接入亲水性含糖侧链以及疏水性烷基侧链，设计开发出一种具有实用高效、环境友好、结构先进的理想防冰材料，从而为新型仿生防冰材料的进一步开发提供新材料和新思路。
发明内容
[0006] 本发明旨在改善现有抗冻剂活性低、有毒、成本高昂的缺点，目的在于制备一种与天然抗冻蛋白结构相似的两亲性无规或嵌段含糖聚类肽抗冻剂。
[0007] 一、所述化合物无规含糖聚类肽，如式(I)所示：
[0008]
[0009] Ⅰ式中，X为伯胺基，R'为甲基、乙基、丙基或者异丙基链段，R为乙酰氨基或者羟基，n取值于10‑200之间，m取值于10‑200之间，三唑环与糖之间有0‑6个亚甲基。
[0010] 所述无规含糖聚类肽的制备方法，步骤如下：
[0011] (1)将乙胺、一水乙醛酸依次加入溶剂中反应，待反应完成后除去溶剂，加入盐酸加热回流过夜，反应结束后旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂，产物用甲醇/乙醚重结晶纯化，过滤后干燥获得2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐。
[0012] (2)向步骤(1)的产物中加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺，反应完成后经萃取、分离干燥得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
[0013] (3)向步骤(2)产物中加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑乙基‑NCA。
[0014] (4)将步骤(1)中乙胺替换为丙胺、异丙胺或者炔丙胺，依次进行步骤(1)、(2)和(3)，分别得到N‑丙基‑NCA、N‑异丙基‑NCA或N‑炔丙基‑NCA。
[0015] (5)将N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸和碘甲烷加入溶剂中，在0℃下缓慢加入氢化钠，室温搅拌过夜再加入碘甲烷和氢化钠，反应过夜后经后处理得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑甲基‑NCA。
[0016] (6)N‑炔丙基‑NCA与N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA依设计比例投料，再按设计聚合度比例加入伯胺引发开环聚合，合成无规聚类肽。
[0017] (7)将叠氮糖、五甲基二乙烯三胺(PMDETA)、溴化亚铜(CuBr)加入步骤(6)得到的无规聚类肽中，通过点击化学反应、脱乙酰基反应、透析和冷冻干燥后得到具有抗冻特性的无规含糖聚类肽。
[0018] 所述叠氮糖的结构式为：
[0019]
[0020] 其中，R为乙酰氨基或者羟基；
[0021] 步骤(1)中，在室温下选二氯甲烷作溶剂进行反应，搅拌反应24小时；所述乙胺与一水乙醛酸物质的量之比是1：2‑2.5；所加盐酸浓度为1mol/L，其中盐酸与乙胺物质的量之比是5：1；加热回流的温度为120℃，时间为24h，用甲醇/乙醚重结晶过夜。
[0022] 步骤(2)中，所述2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐、二碳酸二叔丁酯、三乙胺的投料比是1：1.5‑2.5：5；具体为：在水中搅拌过夜；用正己烷洗涤反应混合物两次，加1mol/L盐酸改变pH至2以下，用乙酸乙酯萃取混合物3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
[0023] 步骤(3)中，以无水二氯甲烷为反应溶剂，三氯化磷与步骤(2)产物的物质的量之比是1‑1.5：1；具体为：在0℃及氮气环境中反应，搅拌2‑3h；在减压条件下除去挥发性物质，加无水二氯甲烷萃取N‑乙基‑NCA；除去二氯甲烷后用无水四氢呋喃/无水正己烷进行沉降纯化三次。
[0024] 步骤(5)中，首次加N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸、碘甲烷和氢化钠物质的量之比是1:4:5，过夜后再加入2当量的碘甲烷和1.5当量的氢化钠；溶剂为无水四氢呋喃；反应完成后加入乙酸乙酯和蒸馏水溶解反应产物，旋蒸溶剂后，残留物再溶解在乙醚和蒸馏水中。醚相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，合并水相后用1M盐酸水溶液酸化至pH＝2。再用乙酸乙酯萃取，并用蒸馏水、Na2S2O3水溶液(5wt％)、饱和食盐水依次洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸。加入三氯化磷进行关环反应条件与N‑乙基‑NCA的关环反应相同。
[0025] 步骤(6)中，在手套箱中进行，无水四氢呋喃为溶剂，反应温度为50℃，反应时间36‑72h；N‑甲基‑NCA、N‑炔丙基‑NCA以及伯胺引发剂的物质的量之比是n：m：1；N‑甲基‑NCA替换为N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA时物质的量比例相同；反应完成后，将正己烷加入到反应混合物中沉降，分离干燥后获得设计聚合度的无规聚类肽。
[0026] 步骤(7)中，以DMF为溶剂，无规聚类肽所含炔丙基：叠氮糖：五甲基二乙烯三胺(PMDETA)：溴化亚铜(CuBr)的物质的量之比为100：120‑200：33：33；在50℃下搅拌反应24h；反应完成后透析48h，冻干处理获得白色蓬松物质；蓬松物质加入到0.05M的甲醇/甲醇钠溶液，在0℃下搅拌反应2‑4h；透析48h，冻干处理获得具有抗冻效果的无规含糖聚类肽。
[0027] 二、所述嵌段含糖聚类肽，化合物如式(Ⅱ)所示：
[0028]
[0029] Ⅱ式中，X为伯胺基，R'为甲基、乙基、丙基或者异丙基链段，R为乙酰氨基或者羟基，n取值于10‑200之间，m取值于10‑200之间，三唑环与糖之间有0‑6个亚甲基。
[0030] 所述嵌段含糖聚类肽的制备方法，步骤如下：
[0031] (1)将乙胺、一水乙醛酸依次加入溶剂中反应，待反应完成后除去溶剂，加入盐酸加热回流过夜，反应结束后旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂，产物用甲醇/乙醚重结晶纯化，过滤后干燥获得2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐。
[0032] (2)向步骤(1)的产物中加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺，反应完成后经萃取、分离干燥后得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
[0033] (3)向步骤(2)产物中加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑乙基‑NCA。
[0034] (4)将步骤(1)中乙胺替换为丙胺、异丙胺或者炔丙胺，进行步骤(1)、(2)和(3)，分别得到N‑丙基‑NCA、N‑异丙基‑NCA或N‑炔丙基‑NCA。
[0035] (5)把N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸和碘甲烷加入溶剂中，在0℃下缓慢加入氢化钠，室温搅拌过夜再加入碘甲烷和氢化钠，反应过夜后经后处理得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸，加入三氯化磷进行关环反应，得到N‑甲基‑NCA。
[0036] (6)按设计聚合度比例先用伯胺引发N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA开环聚合，完全反应后加入N‑炔丙基‑NCA，合成嵌段聚类肽。
[0037] (7)将叠氮糖、五甲基二乙烯三胺(PMDETA)、溴化亚铜(CuBr)加入步骤(6)得到的嵌段聚类肽中，通过点击化学反应、脱乙酰基反应、透析和冷冻干燥后得到具有抗冻特性的嵌段含糖聚类肽。
[0038] 所述叠氮糖的结构式为：
[0039]
[0040] 其中，R为乙酰氨基或者羟基；
[0041] 步骤(1)中，在室温下选二氯甲烷作溶剂进行反应，搅拌反应24小时；所述乙胺与一水乙醛酸物质的量之比是1：2‑2.5；所加的盐酸浓度为1mol/L，其中盐酸与乙胺物质的量之比是5：1；加热回流的温度为120℃，时间为24h，用甲醇/乙醚重结晶。
[0042] 步骤(2)中，所述2‑(N‑乙基氨基)乙酸盐酸盐、二碳酸二叔丁酯、三乙胺的投料比是1：1.5‑2.5：5；具体为：在水中搅拌过夜；用正己烷洗涤反应混合物两次，加1mol/L盐酸改变pH至2以下，用乙酸乙酯萃取混合物3次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥，旋蒸挥发溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
[0043] 步骤(3)中，以无水二氯甲烷为反应溶剂；三氯化磷与步骤(2)反应物的物质的量之比是1‑1.5：1；具体为：在0℃及氮气环境中反应，搅拌2‑3h；在减压条件下除去挥发性物质，加适量无水二氯甲烷萃取N‑乙基‑NCA；除去二氯甲烷后用无水四氢呋喃/无水正己烷进行沉降纯化三次。
[0044] 步骤(5)中，首次加N‑(叔丁氧羰基)甘氨酸、碘甲烷和氢化钠物质的量之比是1:4:5，过夜后再加入2当量的碘甲烷和1.5当量的氢化钠；溶剂为无水四氢呋喃；反应完成后加入乙酸乙酯和蒸馏水溶解反应产物，旋蒸溶剂后，残留物再溶解在乙醚和蒸馏水中。醚相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，合并水相后用1M盐酸水溶液酸化至pH＝2。再用乙酸乙酯萃取，并用蒸馏水、Na2S2O3水溶液(5wt％)、饱和食盐水依次洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，旋蒸溶剂后获得BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑甲基氨基)乙酸。加入三氯化磷进行关环反应条件与N‑乙基‑NCA的关环反应相同。
[0045] 步骤(6)中，在手套箱中进行，无水四氢呋喃为溶剂，反应温度为50℃，反应时间96小时；N‑甲基‑NCA、N‑乙基‑NCA、N‑丙基‑NCA或N‑异丙基‑NCA先被伯胺引发投料比为n：1，单体完全反应后加N‑炔丙基‑NCA与伯胺引发剂投料比是m：1；反应完成后，将正己烷加入到反应混合物中沉降，分离干燥后获得设计聚合度的嵌段聚类肽。
[0046] 步骤(7)中，嵌段聚类肽中炔丙基：叠氮糖：五甲基二乙烯三胺(PMDETA)：溴化亚铜(CuBr)的物质的量之比为100：120‑200：33：33；以DMF为溶剂，在50℃下搅拌反应24h；反应完成后透析48h，冻干处理获得白色蓬松物质；蓬松物质加入到0.05M的甲醇/甲醇钠溶液，在0℃下搅拌反应2‑4h；透析48h，冻干处理获得具有抗冻效果的嵌段含糖聚类肽。将本发明制备的含糖聚类肽作为抗冻剂用于细胞、组织、器官或冷冻食品的低温冷冻保存。
[0047] 本发明有益效果
[0048] 本发明报道了一系列用NNCA开环聚合以及炔‑叠氮“点击化学”修饰方法制备的含糖聚类肽高分子，最终使得侧基带有疏水烷基链以及亲水性糖基团并兼具天然抗冻糖蛋白的抗冻性以及聚类肽良好的生物相容性和溶解性优点。含糖聚类肽的抑制冰生长及重结晶性能可由烷基链段在类肽分子链上的含量以及糖基链段在类肽分子链上的含量控制。冰重结晶抑制(IRI)实验显示，含糖聚类肽的PBS溶液中冰晶尺寸都明显小于纯PBS溶液中的冰晶尺寸大小，表明含糖聚类肽能够与冰晶表面结合，从而有效控制重结晶过程。
附图说明
[0049] 图1为N‑乙基‑NCA的1H NMR谱图。
[0050] 图2为N‑炔丙基‑NCA的1H NMR谱图。
[0051] 图3为iBu‑PNEG25‑r‑PNPG25聚类肽的1H NMR谱图。
[0052] 图4为无规含糖聚类肽(III)的1H NMR谱图。
[0053] 图5为iBu‑PNEG25‑b‑PNPG25聚类肽的1H NMR谱图。
[0054] 图6为iBu‑PNEG25与iBu‑PNEG25‑b‑PNPG25嵌段聚类肽的GPC图。
[0055] 图7为嵌段含糖聚类肽(Ⅳ)的1H NMR谱图。
[0056] 图8为不同含糖聚类肽在PBS(10mM,pH＝7.4)中生长冰晶的典型显微图像；a‑PBS，b‑无规含糖聚类肽，c‑嵌段含糖聚类肽。
具体实施方式
[0057] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0058] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。NNCA纯度、聚类肽通过核磁氢谱测定，Bruker 500MHz，CDCl3为溶剂，含糖聚类肽通过核磁氢谱测定，Bruker 500MHz，D2O为溶剂，聚合物数均分子量通过凝胶渗透色谱法测定。
[0059] 实施例1
[0060] 式(III)所示无规聚类肽的制备
[0061]
[0062] (1)选用500mL圆底烧瓶，加入32.2g(350mmol)一水乙醛酸与350mL二氯甲烷，然后向烧瓶中逐滴滴入9mL(140mmol)炔丙胺，室温下于磁力搅拌器上搅拌24小时。过夜后先旋蒸除去二氯甲烷，再加入224mL1 M HCl水溶液，120℃回流搅拌24小时。待反应结束旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂。然后加入甲醇使旋蒸后的产物充分溶解，过滤后浓缩，再加入甲醇体积2‑3倍的乙醚，在冰箱中重结晶24h，经过抽滤干燥后得到红棕色的N‑炔丙基取代甘氨酸盐酸盐，核磁图见说明书附图2(a)。
[0063] (2)用336mL蒸馏水充分溶解15.1g(100.1mmol)N‑炔丙基取代甘氨酸盐酸盐，先后加入33g(150.2mmol)二碳酸二叔丁酯、70mL(500.5mmol)三乙胺，其目的分别是引入保护基团BOC以及使反应溶液成碱性，在室温下搅拌过夜。等反应结束后转移到分液漏斗中，先用2×390mL正己烷除去多余的二碳酸二叔丁酯，再加入98mL 4M盐酸调节pH值至2附近。然后用3×98mL乙酸乙酯萃取产物，收集萃取液然后用390mL饱和食盐水清洗，再用无水硫酸镁干燥30min，旋蒸后得到BOC保护的红棕色的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑炔丙基氨基)乙酸，核磁图见说明书附图2(b)。
[0064] (3)在干燥的500mL圆底烧瓶中，先移入256mL无水二氯甲烷，充氮气后再加入16.4g(76.9mmol)的上步产物，防止NCA单体被水分子引发聚合，在0℃冰水浴中搅拌均匀后，向反应瓶中缓慢加入8.05mL(92.3mmol)三氯化磷。反应3小时后在真空条件下去除挥发性物质，转移至手套箱中先用二氯甲烷/正己烷重结晶1‑2次，然后用四氢呋喃/正己烷重结晶1‑2次，最终获得白色的N‑炔丙基‑NCA，核磁图见说明书附图2(c)。
[0065] (4)选用1000mL圆底烧瓶，加入22.5g(240mmol)一水乙醛酸与600mL二氯甲烷，然后向烧瓶中逐滴滴入5.4mL(120mmol)乙胺，室温下于磁力搅拌器上搅拌24小时。过夜后先旋蒸除去二氯甲烷，再加入480mL1 M HCl水溶液，120℃回流搅拌24小时。待反应结束旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂。然后加入甲醇使旋蒸后的产物充分溶解，过滤后浓缩，再加入甲醇体积2‑3倍的乙醚，在冰箱中重结晶24h，经过抽滤干燥后得到白色的N‑乙基取代甘氨酸盐酸盐，核磁图见说明书附图1(a)。
[0066] (5)用270mL蒸馏水充分溶解9.7g(69.5mmol)N‑乙基取代甘氨酸盐酸盐，先后加入23g(105mmol)二碳酸二叔丁酯、48.3mL(347.5mmol)三乙胺，在室温下搅拌过夜。等反应结束后转移到分液漏斗中，先用2×270mL正己烷除去多余的二碳酸二叔丁酯，再加入
67.5mL4M盐酸调节pH值至2附近。然后用3×80mL乙酸乙酯萃取产物，收集萃取液然后用
270mL饱和食盐水清洗，再用无水硫酸镁干燥30min、旋蒸除去溶剂后得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸，核磁图见说明书附图1(b)。
[0067] (6)在干燥的500mL圆底烧瓶中，先移入271mL无水二氯甲烷，充氮气后再加入11.6g(57mmol)的上步产物，在0℃冰水浴中搅拌均匀后，向反应混合物中缓慢加入6mL(69mmol)三氯化磷。反应3小时后在真空条件下去除挥发性物质，转移至手套箱中先用二氯甲烷/正己烷重结晶1‑2次，然后用四氢呋喃/正己烷重结晶1‑2次，最终获得白色的N‑乙基‑NCA，核磁图见说明书附图1(c)。
[0068] (7)293mg(2.1mmol)N‑炔丙基‑NCA、272.6mg(2.1mmol)N‑乙基‑NCA溶解于3.5mL无水四氢呋喃中，加异丁胺的THF溶液429μL(0.084mmol,197mM)，在50℃温度下搅拌反应60小时。将冷的正己烷加入到反应结束后的聚合物溶液中进行沉降，离心干燥后得到385mg白色i粉末状无规聚类肽Bu‑PNEG25‑r‑PNPG25，核磁图见说明书附图3。
[0069] (8)用20mL小瓶称取上一步产物101.5mg(0.022mmol,npy＝0.55mmol)，再加2‑乙酰氨基‑3，4，6‑三‑O‑乙酰基‑2‑脱氧‑β‑D‑吡喃葡萄糖酰基叠氮化物248mg(0.67mmol)，而后加入DMF 2.0mL，待其充分溶解后，先加PMDETA的DMF溶液731.5μL(0.18mmol，250mM)，再加CuBr的DMF溶液951.7μL(0.18mmol,190mM)，在50℃下搅拌反应24h，等反应结束后，经过透析、冻干得到白色蓬松物质，溶于0.05M甲醇/甲醇钠溶液中，置于0℃条件下搅拌3小时，把反应混合物转移到透析袋中透析2天，冻干后获得具有抗冻特性的150mg白色蓬松的无规含糖聚类肽，核磁图见说明书附图4。
[0070] 实施例2
[0071] 式(Ⅳ)所示嵌段聚类肽的制备
[0072]
[0073] (1)选用500mL圆底烧瓶，加入32.2g(350mmol)一水乙醛酸与350mL二氯甲烷，然后向烧瓶中逐滴滴入9mL(140mmol)炔丙胺，室温下于磁力搅拌器上搅拌24小时。过夜后先旋蒸除去二氯甲烷，再加入224mL1 M HCl水溶液，120℃回流搅拌24小时。待反应结束旋蒸除去剩余的盐酸以及反应体系中的其他溶剂。然后加入甲醇使旋蒸后的产物充分溶解，过滤后浓缩，再加入甲醇体积2‑3倍的乙醚，在冰箱中重结晶24h，经过抽滤干燥后得到红棕色的N‑炔丙基取代甘氨酸盐酸盐。。
[0074] (2)用336mL蒸馏水充分溶解15.1g(100.1mmol)N‑炔丙基取代甘氨酸盐酸盐，先后加入33g(150.2mmol)二碳酸二叔丁酯、70mL(500.5mmol)三乙胺，在室温下搅拌过夜。等反应结束后转移到分液漏斗中，先用2×390mL正己烷除去多余的二碳酸二叔丁酯，再加入98mL 4M盐酸调节pH值至2附近。然后用3×98mL乙酸乙酯萃取产物，收集萃取液然后用
390mL饱和食盐水清洗，再用无水硫酸镁干燥30min，旋蒸后得到BOC保护的红棕色的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑炔丙基氨基)乙酸。
[0075] (3)在干燥的500mL圆底烧瓶中，先移入256mL无水二氯甲烷，充氮气后再加入16.4g(76.9mmol)的上步产物，在0℃冰水浴中搅拌均匀后，向反应瓶中缓慢加入8.05mL(92.3mmol)三氯化磷。反应3小时后在真空条件下去除挥发性物质，转移至手套箱中先用二氯甲烷/正己烷重结晶1‑2次，然后用四氢呋喃/正己烷重结晶1‑2次，最终获得白色的N‑炔丙基‑NCA。
[0076] (4)选用1000mL圆底烧瓶，加入22.5g(240mmol)一水乙醛酸与600mL二氯甲烷，然后向烧瓶中逐滴滴入5.4mL(120mmol)乙胺，室温下于磁力搅拌器上搅拌24小时。过夜后先旋蒸除去二氯甲烷，再加入480mL1 M HCl水溶液，120℃回流搅拌24小时。旋蒸除去过量的HCl和水后，用甲醇/乙醚重结晶，经过抽滤干燥后得到白色的N‑乙基取代甘氨酸盐酸盐。
[0077] (5)用270mL蒸馏水充分溶解9.7g(69.5mmol)N‑乙基取代甘氨酸盐酸盐，先后加入23g(105mmol)二碳酸二叔丁酯、48.3mL(347.5mmol)三乙胺，在室温下搅拌过夜。等反应结束后转移到分液漏斗中，先用2×270mL正己烷除去多余的二碳酸二叔丁酯，再加入67.5mL
4M盐酸调节pH值至2附近。然后用3×80mL乙酸乙酯萃取产物，收集萃取液然后用270mL饱和食盐水清洗，再用无水硫酸镁干燥30min、旋蒸后得到BOC保护的2‑(N，N，叔丁氧基羰基‑乙基氨基)乙酸。
[0078] (6)在干燥的500mL圆底烧瓶中，先移入271mL无水二氯甲烷，充氮气后再加入11.6g(57mmol)的上步产物，在0℃冰水浴中搅拌均匀后，向反应混合物中缓慢加入6mL(69mmol)三氯化磷。反应3小时后在真空条件下去除挥发性物质，转移至手套箱中先用二氯甲烷/正己烷重结晶1‑2次，然后用四氢呋喃/正己烷重结晶1‑2次，最终获得白色的N‑乙基‑NCA。
[0079] (7)212mg(1.64mmol)N‑乙基‑NCA溶解于3.8mL无水四氢呋喃中，加异丁胺的THF溶液333.2μL(0.066mmol,197mM)，在50℃温度下搅拌反应反应24‑36小时。反应结束后加入222.5mg(1.6mmol)N‑炔丙基‑NCA，置于50℃温度下继续搅拌反应48‑72小时，将冷的正己烷加入到反应结束后的聚合物溶液中进行沉降，离心干燥后得到294mg白色粉末状嵌段聚类i
肽Bu‑PNEG25‑b‑PNPG25，核磁图见说明书附图5，凝胶渗透色谱见说明书附图6。
[0080] (8)用20mL小瓶称取上一步产物82.4mg(0.019mmol,npy＝0.43mmol)，再加2‑叠氮乙基‑2,3,4,6‑四‑O‑乙酰‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷216mg(0.52mmol)，而后加入DMF为1.6mL，待其充分溶解后，先加PMDETA的DMF溶液575μL(0.14mmol，250mM)，再加CuBr的DMF溶液748μL(0.14mmol,190mM)，在50℃下搅拌反应24h，等反应结束后，经过透析、冻干得到白色蓬松物质，溶于0.05M甲醇/甲醇钠溶液中，置于0℃条件下搅拌3小时，把反应混合物转移到透析袋中透析2天，冻干后获得具有抗冻特性的68.4mg灰绿色蓬松的嵌段含糖聚类肽，核磁图见说明书附图7。
[0081] 实施例1、2所示含糖聚类肽的抗冻性能表征
[0082] 1.冰重结晶抑制(IRI)实验
[0083] 溶解在PBS缓冲液中的含糖聚类肽液滴从1.5m高度滴到预冷至‑60℃的低温冷台上，形成一层薄薄的固体冰膜，随后以10℃/min的速率将温度升高至‑8℃，然后将冷冻样品在‑8℃保持30‑60分钟，期间使用数码相机(尼康Y‑TV55，日本)记录样品的显微照片。在观察场中，使用Image J软件对选取的10张照片冰晶粒度进行测量，每张测10个最大粒度的冰晶尺寸平均值，以定量评价冰重结晶活性。对于每个样本，相应的程序至少重复三次。结果显示含糖聚类肽能明显抑制冰重结晶，冰晶图片见说明书附图8。
