一种噬菌体组合物及其应用

摘要

本发明公开了一种噬菌体组合物，属于生物工程技术领域。本发明所述噬菌体组合物，包括大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20098、大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20110和大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20123；本发明的噬菌体组合物对大肠杆菌具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除大肠杆菌，通过抑制大肠杆菌的过度生长，有效防控禽类动物相关疾病的发生，为防控禽类因大肠杆菌引发的疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体抑菌产品来源。

权利要求

1.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物包括：大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20098，保藏编号为：CGMCC No.22484、大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20110，保藏编号为：CGMCC No.22485和大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20123，保藏编号为：CGMCC No.22486。

2.根据权利要求1所述的噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物中各噬菌体的

7 8

效价分别单独为10‑10pfu/ml。

3.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包括权利要求1所述噬菌体组合物和/或权利要求1所述噬菌体组合物的培养物；

所述噬菌体组合物的培养物按照如下步骤制备所得：将权利要求1所述噬菌体分别与大肠杆菌对应单独培养，获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得。

4.根据权利要求3所述抑菌剂，其特征在于，所述大肠杆菌的浓度分别单独地为1×8

10cfu/ml。

5.根据权利要求3～4任意一项所述抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂还包括药学上可接受的辅料。

6.权利要求1～2任意一项所述噬菌体组合物和/或权利要求3～5任意一项所述抑菌剂在制备抑制和/或清除大肠杆菌的制剂中的应用。

7.权利要求1～2任意一项所述噬菌体组合物和/或权利要求3～5任意一项所述抑菌剂在制备防治禽类大肠杆菌感染的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述禽类动物包括鸡、鸭。

说明书

一种噬菌体组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一噬菌体组合物及其应用。

背景技术

[0002] 在家禽饲养的过程中大肠杆菌病是常发的细菌病，严重影响家禽养殖户的生产效益。随着家禽养殖行业发展的不断推进，大大增加了鸡的饲养量，也逐渐壮大了其养殖规模。但从实际养殖情况来看，因养殖者在饲养过程中的管理能力不强，同时也没有科学合理的养殖方式等因素导致在养殖过程中频发一些疾病，而近年来针对这两种病菌混合感染的趋势较为严峻。

[0003] 而目前多使用抗生素进行预防和治疗禽源大肠杆菌病等细菌病，导致制病细菌耐药性湿著上升。耐药菌的产生不仅对畜牧业造成的损失巨大，而且还通过食物链等手段向人类传播，从而对人体健康，食品安全也构成严重威胁。细菌耐药性愈发严重，但是新型抗生素的研发速度远落后于细菌耐药性増长的速度，因此需要寻找新的抗生素替代物来预防和治疗耐药性感染，并进一步减少抗生素的使用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种能够有效防控禽类细菌疾病发生的噬菌体组合物、包括噬菌体组合物的抑菌剂。本发明提供的噬菌体组合物对大肠杆菌均具有强裂解作用，能够抑制大肠杆菌的过度生长，有效防控禽类细菌疾病的发生。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种噬菌体组合物，包括：大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20098，保藏编号为：CGMCC No.22484、大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20110，保藏编号为：CGMCC No.22485、大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20123，保藏编号为：CGMCC No.22486。

[0007] 优选的，上述噬菌体组合物中各噬菌体的效价分别单独为107‑108pfu/ml。

[0008] 本发明还提供了一种抑菌剂，包括上述噬菌体组合物和/或上述噬菌体组合物的培养物。

[0009] 优选的，所述噬菌体组合物的培养物按照如下步骤制备所得：将权利要求1所述噬菌体分别与大肠杆菌对应单独培养，获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得。

[0010] 优选的，所述大肠杆菌的浓度分别单独地为1×108cfu/ml。

[0011] 优选的，所述抑菌剂还包括药学上可接受的辅料。

[0012] 优选的，所述药学上可接受的辅料包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。

[0013] 本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备抑制和/或清除大肠杆菌的制剂中的应用。

[0014] 本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备防治禽类细菌感染的药物中的应用。

[0015] 优选的，所述动物包括但不限于鸡、鸭或猪。

[0016] 本发明的有益效果体现在：本发明提供的噬菌体组合物对大肠杆菌具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除大肠杆菌。本发明的噬菌体组合物能够通过抑制大肠杆菌的过度生长，有效防控禽类动物相关疾病的发生，为防控禽类因大肠杆菌引发的疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体抑菌产品来源。

[0017] 生物保藏信息：

[0018] 本发明所述大肠杆菌噬菌体((Escherichia coliphage))RDP‑EC‑20098，于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22484。

[0019] 本发明所述大肠杆菌噬菌体((Escherichia coli phage))RDP‑EC‑20110，于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22485。

[0020] 本发明所述大肠杆菌噬菌体((Escherichia coli phage))RDP‑EC‑20123，于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22486。

附图说明

[0021] 本发明上述的以及其它的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

[0022] 图1为本发明三株噬菌体的电镜图；

[0023] 图2为本发明三株噬菌体的一步生长曲线示意图；

[0024] 图3为本发明三株噬菌体的酸碱稳定性示意图

[0025] 图4为本发明三株噬菌体的热稳定性试验示意图；

[0026] 图5为本发明三株噬菌体的遗传稳定性试验示意图；

[0027] 图6为本发明中不同噬菌体对宿主菌BE‑20097的裂解曲线；

[0028] 图7为本发明中不同噬菌体对宿主菌BE‑20109的裂解曲线；

[0029] 图8为本发明中不同噬菌体对宿主菌BE‑20122的裂解曲线；

[0030] 图9为本发明中不同噬菌体对多重宿主菌的裂解曲线。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0032] 实施例1致病性大肠杆菌BE‑20097、BE‑20109、BE‑20122的分离及其鉴定[0033] 从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基(SS琼脂或麦康凯琼脂)上划线，37℃培养18‑24h后，病菌在LB培养基上形成乳白色、圆凸、表面湿润的光滑型菌落；在麦康凯培养基上形成表面光滑湿润的粉红色菌落，在LB肉汤中形成白色粘稠沉淀，振摇后呈均匀浑浊；挑取典型菌落继续划线纯化3～5次，直至菌落形态一致，然后挑取单菌落接种于5mL的LB肉汤培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性大肠杆菌，将其中一株命名为BE‑20097，鉴定好的菌株在LB培养基平板上划线，培养12h，将全部菌落用接种环刮至30％甘油‑LB液体中，保存于‑80℃冰箱。

[0034] 致病性大肠杆菌BE‑20109和BE‑20122分别采取同样的方法分离出来。

[0035] 实施例2噬菌体的分离及鉴定

[0036] 以噬菌体RDP‑EC‑20098的分离为例，步骤如下：

[0037] (1)病料处理：从养殖场取病鸡，解剖留取肝脏，无菌操作剪取2g肝脏组织，加入2mL灭菌LB液体，将肝脏充分研磨，然后10000rpm离心30min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；

[0038] (2)制备噬菌体富集液：取0.2mL菌悬液和1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，100rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；

[0039] (3)噬菌体分离：采用双层平板法进行噬菌体的分离，取噬菌体富集液滤出液0.1mL和宿主大肠杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6‑8h后，挑取透明斑于1mL SM缓冲液中4℃浸泡12h，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4‑6h纯化，照此步骤纯化5次，即得。RDP‑EC‑20098在双平板形成的噬菌斑直径在1mm‑3mm。

[0040] 噬菌体RDP‑EC‑20098保存方法：将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合，保存于‑80℃冰箱或液氮中均可。

[0041] 大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20110和RDP‑EC‑20123分别采取同样的方法分离和保存。

[0042] 实施例3噬菌体的电镜观察

[0043] 取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。

[0044] 由图1可知，噬菌体RDP‑EC‑20098有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约60nm，有一个长约83nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

[0045] 噬菌体RDP‑EC‑20110有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约77nm，有一个长约93nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

[0046] 大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20123有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约77nm，有一个长约124nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

[0047] 实施例4噬菌体最佳感染复数试验

[0048] 按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果如表1‑表3所示。

[0049] 表1 RDP‑EC‑20098噬菌体最佳感染复数试验结果

[0050]

[0051] 由表1数据可知，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP‑EC‑20098的最佳感染复数为0.1。

[0052] 表2 RDP‑EC‑20110噬菌体最佳感染复数试验结果

[0053]

[0054]

[0055] 由表2数据显示，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP‑EC‑20110的最佳感染复数为0.1。

[0056] 表3 RDP‑EC‑20123噬菌体最佳感染复数试验结果

[0057]

[0058] 由表3数据显示，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP‑EC‑20123的最佳感染复数为0.1。

[0059] 实施例5噬菌体一步生长曲线试验

[0060] 取对数生长期的大肠杆菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种大肠杆菌BE‑20122和噬菌体RDP‑EC‑20123，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30‑60min每隔20min计数，60‑400min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图2所示。

[0061] 由图2可知，噬菌体RDP‑EC‑20098感染宿主菌后的50min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约50min，感染后50‑160min内噬菌体的效价明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为110min。通过计算，噬菌体裂解量约为184PFU/感染细胞，表明噬菌体具有较强的裂解和复制能力。

[0062] 噬菌体RDP‑EC‑20110感染宿主菌后的60min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约60min，感染后60‑160min内噬菌体的效价明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为100min。通过计算，噬菌体裂解量约为172PFU/感染细胞，表明噬菌体具有较强的裂解和复制能力。

[0063] 噬菌体RDP‑EC‑20123感染宿主菌后的80min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约80min，感染后80‑200min内噬菌体的效价明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为120min。通过计算，噬菌体裂解量约为187PFU/感染细胞，表明噬菌体具有较强的裂解和复制能力。

[0064] 实施例6噬菌体pH稳定性试验

[0065] 制备105cfu/mL的指数期宿主菌液，将噬菌体液按最佳感染复数调整浓度。调整LB液体培养基的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，取噬菌体液加入到等体积的不同pH值下的LB液体培养基混匀，37℃培养箱静置2h后，取100μL混合液与等体积的菌液混合，通过双层板法测效价，每个pH值三个平行，绘制pH‑效价曲线，确定最高点的pH范围。结果如图3所示。

[0066] 由图3可知，噬菌体RDP‑EC‑20098在pH3.0‑12.0范围能维持较好的活性，噬菌体能保持较高的效价。随着pH值的升高或降低，噬菌体的效价有所下降，表明噬菌体RDP‑EC‑20098能够耐受强酸和强碱。

[0067] 噬菌体RDP‑EC‑20110在pH2.0‑13.0范围能维持较好的活性，噬菌体一直保持着较高的效价。表明噬菌体RDP‑EC‑20110能够耐受强酸和弱碱。

[0068] 噬菌体RDP‑EC‑20123在pH3.0‑13.0范围能维持较好的活性，噬菌体能保持较高的效价。随着pH值的降低，噬菌体的效价没有明显下降，在pH为2.0时，噬菌体效价最低。随着pH值的升高，噬菌体的效价没有明显下降，表明噬菌体RDP‑EC‑20123虽不能耐受强酸，但能够耐受强碱。

[0069] 实施例7噬菌体热稳定试验

[0070] 制备105cfu/mL指数期宿主菌液，将噬菌体原液按照最佳感染复数稀释到适合浓度，取100μL与等体积菌液混合，倒双层平板，分别置于35℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下培养30min和60min，通过双层板法测噬菌体效价，每个温度三个平行，绘制时间‑效价曲线，确定温度范围。结果如图4所示。

[0071] 由图4可知，噬菌体RDP‑EC‑20098、RDP‑EC‑20110在70℃以下能保持较好的活性，在80℃时，活性仍然可以保持60min以上，90℃环境中1h内仍然有一定的活性，说明该噬菌体能够耐受一定的高温，具有较好的温度耐受性。

[0072] 噬菌体RDP‑EC‑20123在80℃以下能保持较好的活性，90℃环境中1h内仍然有一定的活性，说明该噬菌体能够耐受一定的高温，具有较好的温度耐受性。

[0073] 实施例8噬菌体遗传稳定性试验

[0074] 将RDP‑EC‑20098连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP‑EC‑20098和BE‑20097，每代培养时间6h，然后倒双平板，测定其效价。RDP‑EC‑20110和RDP‑EC‑20123采用同样的方法进行试验。结果如图5所示。

[0075] 由图5可知，噬菌体RDP‑EC‑20098、RDP‑EC‑20110和RDP‑EC‑20123在传代30次的过程中，始终保持较高的效价，没有出现明显波动，说明该噬菌体可以稳定遗传

[0076] 实施例9噬菌体裂解谱测定

[0077] 噬菌体宿主谱采用点滴法检测。于细菌库中选取株经鉴定为致病性大肠杆菌的宿主80株(编号E20001‑E20080)，各取100μL待测菌液分别涂布于LB固体培养基上，待晾干后，吸取10μL噬菌体液各滴2滴于培养基上，37℃倒置培养6～8h，观察是否出现空斑，若出现则说明噬菌体对该菌株有裂解作用。结果如表4所示。

[0078] 表4噬菌体裂解谱

[0079]

[0080]

[0081] 由表4可知，噬菌体RDP‑EC‑20098对试验中所选的80株大肠杆菌中的74株有裂解作用，裂解率92.5％；RDP‑EC‑20110对试验中所选的80株大肠杆菌中的72株有裂解作用，裂解率90％；RDP‑EC‑20123可对试验中所选的80株大肠杆菌中的69株有裂解作用，裂解率86.25％，说明三株噬菌体均有较宽的裂解谱。

[0082] 实施例10噬菌体对不同宿主的裂解曲线

[0083] 首先同样的用点滴法检测RDP‑EC‑20098对BE‑20109和BE‑20122，RDP‑EC‑20110对BE‑20097和BE‑20122，RDP‑EC‑20123对BE‑20097和BE‑20109裂解作用，点滴法检测发现三株噬菌体对其他两株非宿主菌均有一定的裂解作用，但点板后产生的噬菌斑较弱，说明裂解作用不强。

[0084] 设计试验验证不同噬菌体对不同宿主的裂解曲线，以及混合噬菌体对单一宿主和多重宿主混合液裂解作用。多重宿主混合液比例为BE‑20097：BE‑20109：BE‑20122＝1：1：1，噬菌体组合物中，各噬菌体的比例为RDP‑EC‑20098：RDP‑EC‑20110：RDP‑EC‑20123＝1：1：1。

[0085] (1)不同噬菌体及组合物对BE‑20097的裂解曲线

[0086] 在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的BE‑20097宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，以最佳感染复数，向其中加入噬菌体增殖液，共分为四个实验组分别为RDP‑EC‑20098组、RDP‑EC‑20110组、RDP‑EC‑20123组和噬菌体组合物组，同时以不加噬菌体的作为对照，每组设置3个平行，结果取其平均值。

[0087] 由图6可知，没有加入噬菌体的宿主，随着宿主的增殖，其OD600在60min内逐渐增加，60min‑150min内呈指数增加，在200min后趋于稳定。加入噬菌体组合物的宿主，由于噬菌体对宿主的吸附、侵染，OD600增加比较缓慢，250min内其OD600没有明显的提升，但随着时间的延长，噬菌体裂解率达到顶峰，未被裂解的宿主菌继续繁殖，其OD600逐渐增大。

[0088] 噬菌体RDP‑EC‑20098组，在200min内其OD600没有明显的提升，虽然对宿主有较好的裂解作用，但裂解效率明显弱于噬菌体组合物组。

[0089] 而RDP‑EC‑20110组和RDP‑EC‑20123组由于对BE‑20097的裂解斑较弱，OD600与对照组相比亦有所下降，下降值较小，说这两株噬菌体单独作用该宿主时，裂解作用较弱。

[0090] (2)不同噬菌体及组合物对BE‑20109的裂解曲线

[0091] 在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的BE‑20109宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，以最佳感染复数，向其中加入噬菌体增殖液，共分为四个实验组分别为RDP‑EC‑20098组、RDP‑EC‑20110组、RDP‑EC‑20123组和噬菌体组合物组，同时以不加噬菌体的作为对照，每组设置3个平行，结果取其平均值。

[0092] 由图7可知，没有加入噬菌体的宿主，随着宿主的增殖，其OD600在60min内逐渐增加，60min‑150min内呈指数增加，在200min后趋于稳定。加入噬菌体组合物的宿主，由于噬菌体对宿主的吸附、侵染，OD600增加比较缓慢，350min内其OD600没有明显的提升，但随着时间的延长，噬菌体裂解率达到顶峰，未被裂解的宿主菌继续繁殖，其OD600逐渐增大。

[0093] 噬菌体RDP‑EC‑20110组，在300min内其OD600没有明显的提升，虽然对宿主有较好的裂解作用，但裂解效率明显弱于噬菌体组合物组。

[0094] 而RDP‑EC‑20098组和RDP‑EC‑20123组由于对BE‑20109的裂解斑较弱，OD600与对照组相比亦有所下降，下降值较小，说这两株噬菌体单独作用该宿主时，裂解作用较弱。

[0095] (3)不同噬菌体及组合物对BE‑20122的裂解曲线

[0096] 在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的BE‑20122宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，以最佳感染复数，向其中加入噬菌体增殖液，共分为四个实验组分别为RDP‑EC‑20098组、RDP‑EC‑20110组、RDP‑EC‑20123组和噬菌体组合物组，同时以不加噬菌体的作为对照，每组设置3个平行，结果取其平均值。

[0097] 由图8可知，没有加入噬菌体的宿主，随着宿主的增殖，其OD600在60min内逐渐增加，60min‑150min内呈指数增加，在200min后趋于稳定。加入噬菌体组合物的宿主，由于噬菌体对宿主的吸附、侵染，OD600增加比较缓慢，400min内其OD600没有明显的提升，但随着时间的延长，噬菌体裂解率达到顶峰，未被裂解的宿主菌继续繁殖，其OD600逐渐增大。

[0098] 噬菌体RDP‑EC‑20123组，在200min内其OD600没有明显的提升，虽然对宿主有较好的裂解作用，但裂解效率明显弱于噬菌体组合物组。

[0099] 而RDP‑EC‑20098组和RDP‑EC‑20110组由于对BE‑20122的裂解斑较弱，OD600与对照组相比亦有所下降，下降值较小，说这两株噬菌体单独作用该宿主时，裂解作用较弱。

[0100] (4)不同噬菌体及组合物对多重宿主的裂解曲线

[0101] 在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的三种不同宿主菌悬液以1：1：1制成多重宿主混合液，然后1:100的比例接种到100mL LB培养基中，以前三组最佳感染复数，向其中加入噬菌体增殖液，共分为四个实验组分别为RDP‑EC‑20098组、RDP‑EC‑20110组、RDP‑EC‑20123组和噬菌体组合物组，同时以不加噬菌体的作为对照，每组设置3个平行，结果取其平均值。

[0102] 由图9可知，没有加入噬菌体的宿主，随着宿主的增殖，其OD600在60min内逐渐增加，60min‑200min内呈指数增加，在200min后趋于稳定。加入噬菌体组合物的宿主，由于噬菌体对宿主的吸附、侵染，OD600增加比较缓慢，400min内其OD600没有明显的提升，但随着时间的延长，噬菌体裂解率达到顶峰，未被裂解的宿主菌继续繁殖，其OD600逐渐增大。

[0103] 而噬菌体RDP‑EC‑20098组、RDP‑EC‑20110组和RDP‑EC‑20123组，虽然每株噬菌体对其相应的宿主有较好的裂解效果，但由于对其他两株非宿主菌株的裂解斑较弱，不能很好地抑制其生长，结果可以看出，OD600与对照组相比亦有一定的下降，裂解效率远不如噬菌体组合物组，说明当三种致病菌同时存在时，单独的噬菌体并不能有很好的杀菌效果，相反，噬菌体组合物则对多重宿主的感染有很好的治疗效果。

[0104] 实施例11噬菌体安全性试验

[0105] 选择体重为20～25g的健康BALB/C小鼠50只，雌雄各半，分成4个实验组和1个对照组，每组小鼠雌雄各半，分别灌服纯化的RDP‑EC‑20098增殖液、RDP‑EC‑20110增殖液、RDP‑10
EC‑20123增殖液和RDP‑EC‑20098、RDP‑EC‑20110、RDP‑EC‑20123组合物(200μl 10 PFU/ml)和生理盐水(200μl)，连续灌服7d，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。

[0106] 结果发现，4个实验组和对照组小鼠行为无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别。

[0107] 实施例12噬菌体对禽大肠杆菌病的防治实验

[0108] 利用临床分离株大肠杆菌攻毒实验鸡，然后用噬菌体对其治疗，下面以噬菌体RDP‑EC‑20098为例，

[0109] (1)取21日龄左右SPF鸡20只，平均分成2组，每组10只，分别为噬菌体组和对照组，试验前翅静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在。

[0110] (2)每组实验鸡腿部肌肉注射分离菌株BE‑20097菌液，每只200μL(108CFU/mL)；

[0111] (3)120min后，噬菌体组口服噬菌体RDP‑EC‑20098(1010PFU/mL)500μL/只，对照组口服生理盐水做对照；

[0112] (4)每隔1h观察记录各治疗组实验鸡的生理状态及存活情况，对濒临死亡及已死亡实验鸡进行剖检，统计死亡率和保护率。

[0113] 结果如表5所示。

[0114] 表5噬菌体RDP‑EC‑20098对禽大肠杆菌治疗效果

[0115]分组情况 死亡数 死亡率 保护率
噬菌体组 2 20％ 80％
对照组 8 80％  

[0116] 实验鸡感染宿主后，2h内健康状况迅速下降，2h后对其进行治疗，结果由表5可以看出，噬菌体组保护率为80％，对照组则80％死亡，说明噬菌体RDP‑EC‑20098对鸡感染大肠杆菌具有较好的治疗效果。

[0117] 采用同样的方法，分别测定噬菌体RDP‑EC‑20110和RDP‑EC‑20123的防治效果，结果如表6和表7所示。

[0118] 表6噬菌体RDP‑EC‑20110对禽大肠杆菌治疗效果

[0119] 分组情况 死亡数 死亡率 保护率噬菌体组 3 30％ 70％
对照组 9 90％  

[0120] 实验鸡感染宿主后，2h内健康状况迅速下降，2h后对其进行治疗，结果由表6可以看出，噬菌体组保护率为70％，对照组则90％死亡，说明噬菌体RDP‑EC‑20110对鸡感染大肠杆菌具有较好的治疗效果。

[0121] 表7噬菌体RDP‑EC‑20123对禽大肠杆菌治疗效果

[0122]分组情况 死亡数 死亡率 保护率
噬菌体组 3 30％ 70％
对照组 7 70％  

[0123] 实验鸡感染宿主后，2h内健康状况迅速下降，2h后对其进行治疗，结果由表7可以看出，噬菌体组保护率为70％，对照组则70％死亡，说明噬菌体RDP‑EC‑20123对鸡感染大肠杆菌具有较好的治疗效果。

[0124] 实施例13噬菌体组合物对禽大肠杆菌病的防治实验

[0125] 利用临床分离株大肠杆菌攻毒实验鸡，然后用噬菌体混合制剂对其治疗

[0126] (1)取21日龄左右SPF鸡20只，平均分成2组，每组10只，分别为噬菌体组和对照组，试验前翅静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在。

[0127] (2)每组实验鸡腿部肌肉注射分离菌株BE‑20097、BE‑20109和BE‑20122混合菌液，8
每只200μL(10CFU/mL)；

[0128] (3)制备噬菌体组合物：将RDP‑EC‑20098增殖液(1010PFU/mL)、RDP‑EC‑20110增殖10 10
液(10 PFU/mL)和RDP‑EC‑20123增殖液(10 PFU/mL)按照1：1：1比例制备成噬菌体组合物，
4℃保存，用于后续实验；

[0129] (4)120min后，噬菌体组口服(3)中噬菌体混合制剂500μL/只，对照组口服生理盐水做对照；

[0130] (5)每隔1h观察记录各治疗组实验鸡的生理状态及存活情况，对濒临死亡及已死亡实验鸡进行剖检，统计死亡率和保护率。结果如表8所示。

[0131] 表8噬菌体组合物对禽大肠杆菌治疗效果

[0132]分组情况 死亡数 死亡率 保护率
噬菌体组合物 1 10％ 90％
对照组 10 100％  

[0133] 实验鸡感染宿主后，2h内健康状况迅速下降，2h后对其进行治疗，结果由表8可以看出，噬菌体组保护率为90％，对照组则100％死亡，说明噬菌体组合物对鸡感染大肠杆菌具有很好的治疗效果，且比噬菌体单独治疗效果更好。

[0134] 应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。