一种青霉素G酰化酶突变体及其应用

摘要

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种青霉素G酰化酶突变体及其应用。所述的青霉素G酰化酶突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中突变多个氨基酸位点。利用本发明的青霉素G酰化酶突变体，催化水解7‑苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G‑7‑ADCA)制备7‑氨基‑3‑脱乙酰氧基头孢烷酸(7‑ADCA)，与突变之前的酶相比，具有更高比活力，更高的转化效率，更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性，更适用于工业规模化生产应用。

权利要求

1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于：是对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行突变，突变方式为以下任一种：

G477D； G477D和L567M；G477D和Q683R； G477D和L567M和Q683R。

2.一种编码权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体的核苷酸。

3.权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体的应用，其特征在于：以G‑7‑ADCA为底物，催化合成7‑ADCA。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，底物G‑7‑ADCA浓度为6%‑8%，酶的活力为

3000‑6000U/L。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，反应温度为25‑28℃，反应时间0.5‑3.5 h。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，底物溶剂为0.05‑0.2mol/L硼酸缓冲液，反应pH7.5‑8.5。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的青霉素G酰化酶的突变体是固定化的青霉素G酰化酶突变体。

说明书

一种青霉素G酰化酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于酶工程技术领域，涉及一种青霉素G酰化酶突变体及利用其制备7‑ADCA的方法。

背景技术

[0002] β‑内酰胺抗生素是临床使用最多、应用最广的一类抗生素，主要分为青霉素类和头孢类抗生素。青霉素类抗生素具有抗菌谱相对较窄，对酸不稳定等缺点；而头孢类抗生素则是对革兰氏阳性菌和阴性菌都较强的抑制作用，广谱性好。用于头孢类抗生素合成的关键中间体为7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)和7‑氨基‑3‑脱乙酰氧基头孢烷酸(7‑ADCA,结构式见图1)。7‑ACA主要是以头孢菌素C为原料，通过酶法水解侧链获得，现有技术已非常成熟；7‑ADCA是制造头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛等半合成头孢菌素的重要医药中间体，市场用量大。用于7‑ADCA制备的方法主要有以下两种路线：化学法和半合成酶法，化学法主要是以青霉素G钾为原料，通过化学氧化为青霉素G亚砜，然后硅酯化、再经化学扩环重排反应得到扩环酸(G‑7‑ADCA)。G‑7‑ADCA再经过化学裂解将7‑位的苯乙酰基侧链水解，最终得到7‑ADCA，整个过程由于工艺复杂、工序多，同时需要使用大量有机溶媒而逐渐被取代；而半合成酶法则是以青霉素G钾为底物，通过化学或酶法扩环生成G‑7‑ADCA,再通过青霉素酰化酶水解侧链，生成7‑ADCA(图2)。从上述工艺路线可以看出，无论是化学法或半合成酶法，7‑ADCA的制备都需要通过G‑7‑ADCA去掉侧链获得，现有的工业中所采用的工艺都是通过固定化酶水解侧链制备。

[0003] 但是，工业中应用表明：青霉素酰化酶水解侧链制备7‑ADCA时依然存在以下的问题：酶对有机溶剂耐受性不好(化学扩环生成G‑7‑ADCA存在有机溶剂残留)，导致酶催化性能下降，多批次反应容易失活；现有的酶催化效率和转化率偏低、反应过程中底物G‑7‑ADCA残留较多等等，上述问题会对7‑ADCA乃至后面以7‑ADCA为中间体的系列抗生素产品的质量和品质造成影响，基于此，在现有酶的基础上以G‑7‑ADCA为底物，进行定向筛选底物特异性更好、有机溶剂耐受性更高的、转化率更高的性能优良的突变体酶应用于半合成抗生素工业显得非常重要，对提升我国β‑内酰胺抗生素的产品质量和品质水平具有非常重要的意义。

[0004] 在前期的工作中，发现用突变型的青霉素G酰化酶(专利号：ZL201510638013.6)为催化剂，以G‑7‑ADCA为底物，催化水解侧链生成7‑ADCA具有较好的效果，为进一步提升催化效率，减少底物残留。在该专利基础上，本发明以突变型的青霉素G酰化酶PGA‑6为出发酶，在此基础上进行了进一步的叠加突变和定向筛选，使得突变后的酶相比PGA‑6具有更高的转化率，更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性，更适用于工业规模化应用。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的是提供一种青霉素G酰化酶突变体，以能够使突变体较PGA‑6具有更高的比活力，并能在以G‑7‑ADCA为底物催化制备7‑ADCA时具有更高的转化率，更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性。

[0006] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种青霉素G酰化酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的青霉素G酰化酶PGA‑6中突变多个氨基酸位点，突变的多个氨基酸位点包括G477D，L567M和Q683R中的至少一个。

[0007] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种青霉素G酰化酶的突变体，突变方式包括以下7种中的任一种：

[0008] G477D；L567M；Q683R；G477D和L567M；G477D和Q683R；L567M和Q683R；G477D和L567M和Q683R。

[0009] 进一步地，上述七种突变体的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.2‑8所示。

[0010] 本发明的第二个目的是提供编码前述青霉素G酰化酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的青霉素G酰化酶突变体较青霉素G酰化酶突变体PGA‑6具有更高的催化效率，更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供编码前述突变体的多核苷酸。

[0011] 本发明的第三个目的是提供上述的青霉素G酰化酶突变体的应用，主要是利用所述的青霉素G酰化酶突变体制备7‑ADCA的方法，以能够更好的制备7‑ADCA。

[0012] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供青霉素G酰化酶突变体的应用，所述的方法是在反应体系中，用前述的青霉素G酰化酶突变体催化G‑7‑ADCA水解反应，制备7‑ADCA。

[0013] 在一种优选的实施方案中，本发明提供青霉素G酰化酶突变体的应用，底物G‑7‑ADCA浓度为6％‑8％，酶的活力为3000‑6000U/L。

[0014] 进一步地，反应温度为25‑28℃，反应时间0.5‑3.5h。

[0015] 进一步地，底物溶剂为0.05‑0.2mol/L硼酸缓冲液，反应pH7.5‑8.5。

[0016] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备7‑ADCA的方法，其中所述的青霉素G酰化酶突变体是固定化的青霉素G酰化酶突变体。

[0017] 本发明的有益效果在于，利用本发明的青霉素G酰化酶突变体，能够使突变体较PGA‑6具有更高的比活力，并能在催化制备7‑ADCA时具有更高的转化率，更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性，更加适用于工业规模化应用。

[0018] 本发明选择以专利号为ZL201510638013.6中突变型青霉素G酰化酶PGA‑6作为出发点，其相比其它或野生型来源的青霉素G酰化酶有以下优势：反应活性更高，速度更快，底物浓度更高，转化率高且底物残留量少。在PGA‑6的基础上，本发明通过基因工程及酶工程技术手段，对PGA‑6进行突变，所获得的青霉素G酰化酶突变体较PGA‑6具有酶比活力、催化速率和转化收率更高，底物残留更少，有机溶剂耐受性更强等特点和优势，因此更适用于规模化应用，用于7‑ADCA的生产。

附图说明

[0019] 图1为青霉素G酰化酶催化合成7‑ADCA的原理图。

[0020] 图2为半合成酶法制备7‑ADCA路线图。

具体实施方式

[0021] 以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。

[0022] 青霉素G酰化酶及其突变体的酶活力检测方法如下：

[0023] 底物浓度：6％，称取适量扩环酸(G‑7‑ADCA)底物，溶解于150mL 0.1mol/L、pH 8.0的硼酸盐缓冲液中，用此缓冲液定容至200mL，溶液须现配现用。

[0024] 收集发酵后的菌体，采用球磨或超声破碎后离心(12000g 5min),精确量取0.5mL菌体破碎后的上清于至28℃的20mL底物溶液的带夹套的玻璃反应器中，开搅拌，水浴恒温28℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00计时，保持pH 8.00反应3min，记录氢氧化钠滴定液的消耗量。(0.1mol/L的氢氧化钠滴定液的配制见标准滴定液的配制)[0025] 固定化酶活力检测:精确称取0.20g固定化酶样品，加入已装有预热至28℃的80mL底物溶液的带夹套的玻璃反应器中，开搅拌，水浴恒温28℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00计时，保持pH 8.00反应10min，记录氢氧化钠滴定液的消耗量。

[0026] 酶活力单位：在一定反应条件下，每分钟消耗1μmoL的NaOH的酶量为一个单位。

[0027] 液相法用于产物7‑ADCA的检测：色谱柱：Spherisorb ODS1 5μm 4.6×200mm。流动相：称取1.542g乙酸铵加入965mL超纯水溶解后，用3moL/L的氨水调pH至7.0,0.45μm水系膜过滤，加入50mL色谱纯的乙腈，混合均匀后脱气30min备用。流速：1.0mL/min,检测：UV225 nm,进样：样品溶液和标准品溶液分别进样20μL。

[0028] 实施例1：PGA‑6原核表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)‑PGA‑6的活化及易错突变文库的构建

[0029] 根据专利ZL201510638013.6中突变型青霉素G酰化酶PGA‑6所保存的菌株信息，取出保存于‑80℃的甘油菌株，划线于含有50μg/mL的卡那霉素LB固体培养基上，37℃过夜培养，次日挑取单菌落，接种与含有50μg/mL的卡那霉素LB液体培养基中，220rpm,37℃过夜培养,用质粒试剂盒(OMEGA)提取质粒，以质粒pET30a(+)‑PGA‑6为模板，进行易错突变文库的构建，易错突变文库构建具体流程如下：

[0030] 选择常规的通用引物进行PCR反应，引物名称及序列：(通用引物的名称引物序列：T7F:5’‑TAATACGACTCACTATAGGG‑3’SEQ ID NO.9,T7R:GCTAGTTATTGCTCAGCGG SEQ ID NO.10)，以上述提取的的质粒pET30a(+)‑PGA‑6为模板，进行易错PCR的反应体系与流程，调
2+ 2+
整PCR扩增反应体系中Mg 、Mn 、dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为千分之二，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。

[0031]

[0032]

[0033] 易错PCR反应程序：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30‑35个循环；最后72℃延伸10min。将上述易错PCR产物取样2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测无误后用PCR产物纯化试剂盒进行纯化处理。在37℃条件下，用Nde I和Xho I限制性内切酶分别对PCR纯化产物和原核表达载体pET30a(+)进行双酶切，酶切产物切胶回收(其中回收PCR纯化产物片段大小约为2700bp，回收载体pET30a(+)片段大小约为5400bp)后按照易错PCR产物：原核表达载体pET30a(+)为3：1的摩尔比进行混合，加入T4 DNA ligase于16℃过夜连接。次日用DNA产物纯化回收试剂盒对连接产物进行上柱纯化后，进行电击转化流程。电击转化后的产物涂布于含有50μg/mL的卡那霉素LB固体培养基上，平板上生长出来的菌落即为PGA‑6基础上的易错随机突变体文库。

[0034] 实施例2：PGA‑6基础上易错突变文库的筛选

[0035] 用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库的单菌落(每根牙签挑取1个单菌落)，分别接种于96孔细胞培养板的不同孔中(每孔中已加入含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基)。将96孔细胞培养板置于恒温摇床中37℃，700rpm培养6小时，从培养板中取50μL细胞培养液，加入经过无菌处理的96孔酶标板中作为种子液保存，然后用8通道移液器向96孔培养板中加入终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃，250rpm诱导培养8小时。诱导培养完毕后，将96孔细胞培养板放入‑80℃的超低温冰箱中冷冻2小时，取出放置于室温半小时，后4000r/min，4℃离心20分钟，每孔取上清100μL置于96孔酶标板中，用于后续高通量筛选反应。高通量筛选反应相关试剂配制：

[0036] 底物溶液：2g/L的G‑7‑ADCA扩环酸溶液,用0.05M pH 8.0硼酸盐缓冲液配制；

[0037] 反应终止液：100mM NaOH，40％醋酸，按照1:2的比例混合

[0038] 显色液：0.5％(W/V)PDAB(对二甲氨基苯甲醛溶液)，用甲醇现配现用，[0039] 高通量筛选显色反应：

[0040] 在含有100μL菌体破碎上清酶液的96孔酶标板中，分别按1：1的体积比加入反应底物溶液，30℃。温育15‑30min；

[0041] 加入终止液50μL，混匀后，4000rpm离心10min；

[0042] 取50μL上清加入50μL显色液，用酶标仪进行检测分析，选择OD405nm吸光值高的用于后续测序及转化实验验证。

[0043] 经过几轮的突变文库构建与筛选，反复筛选验证(约20000个克隆子)，选择吸光值高的菌株进行测序分析、酶活力测定等，获得了4株对扩环酸活力高于PGA‑6的菌株，具体情况如表1：

[0044] 表1：在PGA‑6基础上易错突变筛选获得的突变体

[0045]

[0046]

[0047] 从表1中可以看出，相比出发模板PGA‑6，各突变体在菌体发酵活力方面都有明显提升，蛋白比活力都要高于出发模板PGA‑6，其中PGA‑7和PGA‑8突变体，活力提升明显，因此可以考虑在PGA‑7和PGA‑8的基础上进行叠加突变与筛选，进一步提升酶对G‑7‑ADCA的催化性能，满足工业规模化应用要求。

[0048] 实施例3：PGA‑7和PGA‑8基础上叠加突变体的构建与验证

[0049] 以PGA‑7和PGA‑8菌株为出发菌株，挑取单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，220rpm,37℃培养，次日收集菌体，用质粒试剂盒(OMEGA)提取质粒，以质粒pET30a(+)‑PGA‑7和pET30a(+)‑PGA‑8为模板，将所获得的突变位点进行叠加突变后进行有利突变位点筛选，最终获得的有利突变位点及菌株如表2：

[0050] 表2：在PGA‑7和PGA‑8基础上叠加突变体的构建

[0051]

[0052]

[0053] 从表2中可以看出，叠加后的突变体如PGA‑10、PGA‑11、PGA‑13活力都有明显提升，而突变体PGA‑12活力则有所下降。为了进一步验证各酶的催化反应能力，选择将PGA‑6(SEQ ID NO.1)、PGA‑7(SEQ ID NO.2)、PGA‑8(SEQ ID NO.3)、PGA‑9(SEQ ID NO.4)、PGA‑10(SEQ ID NO.5)、PGA‑11(SEQ ID NO.6)、PGA‑12的(SEQ ID NO.7)、PGA‑13(SEQ ID NO.8)的表达菌株进行发酵培养，分别将目的蛋白进行分离纯化并进行固定化后用于催化水解G‑7‑ADCA生成7‑ADCA反应。

[0054] 实施例4：PGA‑6及突变体蛋白纯化与固定化

[0055] 利用PGA‑6及突变体重组蛋白中所携带His标签，采用已活化的IDA树脂(购买于安诺伦(北京)生物科技有限公司，具体型号:His.Bind Resin，Ni‑charged)对实施例2和实施例3得到的上清进行蛋白纯化，具体方法如下：4℃，10000r/min，离心发酵液10min，弃上清，收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)反复洗涤两次，离心后将菌体浓缩5倍重悬于20mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，超声破碎条件为：工作2s，间隔5s，超声功率500W。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到粗蛋白。将粗蛋白上样到已活化的IDA树脂上，用咪唑溶液(2mM‑20mM)进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio‑Rad)进行实时监控，收集出现的稳定的蛋白峰，即为MATI重组蛋白纯化蛋白，用于固定化酶制备。

[0056] 将纯化的PGA‑6及重组蛋白突变体用于固定化酶的制备，具体方法为：

[0057] (1)固定化载体活化：准确量取60％(m/v)的戊二醛30mL，同磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)4.76g加入600mL去离子水中，溶解后用去离子水定容至1000mL，并用磷酸溶液调节其pH为8.0。将环氧基载体ECEP(意大利Resindion S.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于
25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水冲洗2‑3次后真空滤干备用。

[0058] (2)PGA‑6及重组蛋白突变体的固定化：取一定量上述纯化后的MATI重组蛋白，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)稀释，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下固定化48h，所得固定化酶用去离子水清洗3‑5次，真空滤干后即得固定化酶终品。

[0059] 实施例5：PGA‑6及突变体固定化酶催化生成7‑ADCA反应性能分析

[0060] 将实施例2和实施例3所得到的的突变体PGA‑7、PGA‑8、PGA‑9、PGA‑10、PGA‑11、PGA‑12、PGA‑13和出发蛋白PGA‑6制备成固定化酶，同等条件下用于催化生成7‑ADCA反应，所制备的固定化酶活力情况如下：

[0061] 表3：PGA‑6及突变体固定化酶活力对比

[0062]

[0063]

[0064] 从表3中可以看出，在PGA‑6基础上所制备的突变体固定化酶，都要高于出发蛋白PGA‑6，除了PGA‑12突变体固定化酶活力提升不明显外，其它突变体所制备的固定化酶活力都有明显提升。为进一步验证固定化酶的催化性能，设定以下反应参数进行各固定化酶催化性能的评估。

[0065] 基本反应条件：投入同等质量的固定化酶(活力300‑600U)，底物扩环酸G‑7‑ADCA的浓度6％(用0.05mol/L的硼酸缓冲液溶解)，用3mol/L的氨水维持恒定的pH 8.0左右,反应温度28℃，反应体系100mL。

[0066] (1)在反应不同时间段，取样测定反应体系中底物扩环酸G‑7‑ADCA的残留量，以此为衡量标准进行对比分析，结果如下：

[0067] 表4：PGA‑6及各突变体反应不同时间段底物残留量分析

[0068]

[0069] 从表4可以看出，随着反应时间的延长，出发酶PGA‑6相比突变体酶，底物残留量明显要大，且反应时间至3.5h时，呈现明显的拖尾现象，而突变体PGA‑11、PGA‑13则在3h时候，底物反应完全，相比PGA‑6，更具有工业化应用的价值。

[0070] (2)有机溶剂对酶催化性能的影响。在上述反应体系中，加入0.5％甲苯+0.5％的吡啶，考察对PGA‑6及突变体催化反应过程中的影响，见表5：

[0071] 表5：有机溶剂对PGA‑6及各突变体催化性能影响

[0072]

[0073] 从表5可以明显看出，加入有机溶剂后，PGA‑6的催化性能明显受到抑制作用，导致催化反应速率变慢，底物残留量大，在3.5h时候仍然有15.47mg/mL的底物残留，而突变体PGA‑10、PGA‑11、PGA‑13则受有机溶剂的耐受性较小，催化效率明显优于PGA‑6，尤其是PGA‑13突变体，其在反应3h时，底物完全反应完，催化性能几乎不受有机溶剂的影响，相比PGA‑6和其它突变体，更具有工业应用的价值。

[0074] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。