含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用，属于组织工程领域。该复合静电纺丝纤维膜的制备方法包括：羊膜清洗和脱细胞预处理得到dHAM，采用冻干研磨和消化透析的增溶步骤制备可溶dHAM粉末，以HFIP作为静电纺丝溶剂配制共混/同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液，在环境湿度为30％–50％、温度为25–35℃的条件下进行共混静电纺丝或同轴静电纺丝得到，本发明创新性地将人羊膜用于静电纺丝，所得含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的理化特性和生物相容性好，对hUC‑MSCs无明显细胞毒性，适于细胞粘附与增殖，可作为组织工程生物网片或生物支架材料用于盆腔器官脱垂组织工程领域。

权利要求

1.含dHAM的复合静电纺丝纤维膜作为生物网片或生物支架材料在盆腔器官脱垂组织工程中的应用，其特征在于，所述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜为微米级纤维有序排列的层叠网状结构，其制备方法包括以下步骤：(1)羊膜清洗和脱细胞预处理，包括：新鲜的人羊膜样本在超净工作台中平铺，用去离子水配制的PBS溶液清洗、去除血污，用75％乙醇漂洗至半透状态；放入含有10％双抗的PBS溶液中浸泡，同时磁力搅拌漂洗震荡，每间隔12h更换所述含有10％双抗的PBS溶液，共换2次；放入占PBS重量1％的表面活性剂Triton‑100溶液中浸泡，每间隔8h更换所述占PBS重量

1％的表面活性剂Triton‑100溶液，共换2次；放入含有1000U胰脂酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；放入含有1000U DNA酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；

放入含有10％双抗的PBS溶液中漂洗，每间隔12h更换，共换2次，得到dHAM，4℃存于含有双抗的PBS溶液中；

(2)制备可溶dHAM粉末，包括：取步骤(1)得到的dHAM，剪成适当大小平铺在培养皿中，盖一层有孔的保鲜膜，预先置于‑80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干dHAM；将冻干dHAM置于‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到

5mL离心管中，得到可通过50目筛的不溶dHAM粉末；取1g不溶dHAM粉末加入20mL的含有0.5M HCl和不小于1600U/L的胃蛋白酶的水溶液中进行消化，在4℃和200r/min的条件下连续搅拌3天，使之获得可溶性，用4N NaOH中和至pH为7.4，配制成dHAM悬浮液，去离子水透析24h，每4h换一次去离子水，得到乳白色的dHAM粘性溶液；消化后的dHAM粘性溶液置于培养皿，盖有孔保鲜膜于‑80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干可溶dHAM；

将冻干可溶dHAM置于‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的可溶dHAM粉末；

(3)以六氟异丙醇(HFIP)作为静电纺丝溶剂配制共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液或同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液；

(4)连接静电纺丝装置，打开电源，步骤(3)得到的静电纺丝溶液在环境湿度为30％–

50％、温度为25–35℃的条件下进行共混静电纺丝或同轴静电纺丝，得到微米级纤维有序排列的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液的配制方法为：HFIP为10mL，称3g的PCL加入，以300–3000rpm速度磁力搅拌至溶解，12h后得浓度为30％的PCL静电纺丝液，采用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液和5％的dHAM静电纺丝液，将PCL、PLGA、dHAM以1：1：1的比例搅拌混匀得到。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液的配制方法为：HFIP为10mL，称3g的PCL加入，以300–3000rpm速度磁力搅拌至溶解，12h后得到浓度为30％的PCL静电纺丝液，作为“核”部分的静电纺丝液，采用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液和5％的dHAM静电纺丝液，作为“壳”部分的静电纺丝液。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述静电纺丝工艺参数包括：

电压为15–20kV、针距接收棒距离为18cm、流速为30μL/min。

说明书

含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于组织工程领域，具体涉及含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 盆腔器官脱垂(Pelvic organ prolapse，POP)常见于中老年妇女，由于盆底提肛肌群和结缔组织等支撑结构衰弱引起的器官下坠、脱出致结构及功能病变，是盆底功能障碍这类多因素疾病(Pelvic floor dysfunction，PFD)的一种病症。PFDs是一种常见病，在美国约25％的妇女受PFDs的影响倍感压力，我国有POP临床表现的成年女性高达9.6％，女性因POP等疾病导致的手术风险约20％，可谓妇科手术的常见原因。临床中，盆底重建手术是一种疗效较好、满意度高的治疗策略。

[0003] 组织工程是一门修复、重建损伤组织的技术，包括支架、种子细胞以及细胞因子三个要素，具体步骤为：具有分化能力的种子细胞种植在可降解的生物相容材料上，形成复合生物网片并植入待修复部位，网片瓦解的同时与周边组织融合成新组织，达到修复重建效果。组织工程中支架是关键要素，它提供足够的空间用于组织和器官再生，支架材料和制备方法的选择直接关系到细胞和生长因子与特定组织的相互作用，关系到材料植入及后续损伤组织功能修复和改善的效果。以生物可降解聚合物为原料制备的支架材料广泛用于组织工程，但原料高昂的制造成本、不理想的生物活性仍促使研究人员寻找更好的原料替代品。近年来，组织工程方法在POP治疗领域有巨大潜力，在重建医学领域中新型组织工程生物网片得到研究者的青睐，随着对女性盆底功能解剖学的认识加深及改善盆底重建手术并发症的需求增多，使修复网片的应用更加广泛。不能降解聚丙烯网片作为盆底重建手术的常用合成材料之一，曾被认为是修复网片设计的理想模型，但其植入后易产生如网片暴露穿孔、感染甚至流血等并发症，美国食品药品监督管理局于2011年发布的安全通报更新也证明这一点。因此，应用于盆底重建的组织工程也面临选择理想生物材料、最佳种子细胞和相关诱导因子以及设计合适支架等方面的挑战。

发明内容

[0004] 本发明的第一目的是提供一种含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，采用静电纺丝技术，在高压静电下将PCL、PLGA与dHAM结合得到由微米级纤维有序排列构成的PCL/PLGA/dHAM静电纺丝膜，充分保留PCL和PLGA物化特性的同时，创新性地将人羊膜用于静电纺丝，理化特性及生物相容性良好，对hUC‑MSCs无明显细胞毒性，用于POP具有潜在的临床应用价值。

[0005] 本发明的第二目的是提供一种通过上述制备方法得到的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜。

[0006] 本发明的第三目的是提供上述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜在盆腔器官脱垂组织工程中的应用。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 本发明提供的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

[0009] (1)羊膜清洗和脱细胞预处理，得到dHAM；

[0010] (2)采用包含冻干研磨、消化透析和二次冻干研磨的增溶步骤制备可溶dHAM粉末；

[0011] (3)以六氟异丙醇(HFIP)作为静电纺丝溶剂配制共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液或同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液；

[0012] (4)连接静电纺丝装置，打开电源，步骤(3)得到的静电纺丝溶液在环境湿度为30％–50％、温度为25–35℃的条件下进行共混静电纺丝或同轴静电纺丝，得到微米级纤维有序排列的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜，通风静置，待表面溶剂挥发后真空保存。

[0013] 优选地，步骤(1)中，所述羊膜清洗和脱细胞预处理包括以下步骤：

[0014] (1–1)新鲜的人羊膜样本在超净工作台中平铺，用去离子水配制的PBS溶液清洗、去除血污后，用75％乙醇漂洗至半透状态；

[0015] (1–2)放入含有10％双抗的PBS溶液中浸泡，同时磁力搅拌漂洗震荡，每间隔12h更换所述含有10％双抗的PBS溶液，共换2次；

[0016] (1–3)放入占PBS重量1％的表面活性剂Triton‑100溶液中浸泡，每间隔8h更换所述占PBS重量1％的表面活性剂Triton‑100溶液，共换2次；

[0017] (1–4)放入含有1000U胰脂酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；

[0018] (1–5)放入含有1000U DNA酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；

[0019] (1–6)放入含有10％双抗的PBS溶液中漂洗，每间隔12h更换，共换2次，得到dHAM，4℃存于含有双抗的PBS溶液中备用。

[0020] 优选地，步骤(2)中，所述可溶dHAM粉末的制备方法包括：

[0021] (2–1)取步骤(1)得到的dHAM，剪成适当大小平铺在培养皿中，盖一层有孔的保鲜膜，预先置于‑80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干dHAM；将冻干dHAM置于‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的不溶dHAM粉末；

[0022] (2–2)取1g不溶dHAM粉末加入20mL的含有HCl(0.5M)和胃蛋白酶(≥1600U/L)的水溶液中进行消化，在4℃和200r/min的条件下连续搅拌3天，使之获得可溶性，用NaOH(4N)中和至pH为7.4，配制成dHAM悬浮液，去离子水透析24h，每4h换一次去离子水，得到乳白色的dHAM粘性溶液；

[0023] (2–3)消化后的dHAM粘性溶液置于培养皿，盖有孔保鲜膜于‑80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干可溶dHAM；将冻干可溶dHAM置于‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的可溶dHAM粉末。

[0024] 优选地，步骤(3)中，所述共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液的配制方法为：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，以300–3000rpm速度磁力搅拌至溶解，12h后得浓度为30％的PCL静电纺丝液，采用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液和5％的dHAM静电纺丝液，将PCL、PLGA、dHAM以1：1：1的比例搅拌混匀得到；

[0025] 和/或所述同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液的配制方法为：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，以300–3000rpm速度磁力搅拌至溶解，12h后得到浓度为30％的PCL静电纺丝液，作为“核”部分的静电纺丝液，采用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液和5％的dHAM静电纺丝液，作为“壳”部分的静电纺丝液。

[0026] 优选地，步骤(4)中，所述静电纺丝工艺参数包括：电压为15–20kV、针距接收棒距离为18cm、流速为30μL/min。

[0027] 本发明还提供通过上述制备方法得到的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜，为白色均匀的层叠网状纤维膜。

[0028] 本发明还提供上述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜在盆腔器官脱垂组织工程中的应用。

[0029] 优选地，所述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜作为组织工程复合生物网片或生物支架。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0031] (1)本发明采用静电纺丝技术，在高压静电下将PCL、PLGA与dHAM结合，高压静电可将带电共聚物溶液快速拉伸变细，溶剂挥发后形成长度极长、比表面积大、表面有微孔结构的微米纤维，得到由微米级纤维有序排列构成的PCL/PLGA/dHAM静电纺丝膜，充分保留PCL和PLGA物化特性的同时，创新性地将人羊膜用于静电纺丝，理化特性及生物相容性良好，对hUC‑MSCs无明显细胞毒性，且微米纤维结构与ECM相近，层层叠叠的静电纺丝膜适于细胞粘附与增殖，用于盆腔器官脱垂组织工程具有潜在的临床应用价值。

[0032] (2)本发明首次提出利用静电纺丝的高压电场将不可纺的纯dHAM制备成微米或纳米级纤维，采取冻干研磨、消化透析、二次冻干研磨等，最大限度保留活性成分的基础上增加dHAM的可溶性，并选择强极性的HFIP作溶剂将dHAM均匀溶解。另外，dHAM不规则的结构在高压电场力牵引下也很难缠绕成纤维，本发明将易于静电纺丝加工成型的PCL、PLGA两种共聚物加入到静电纺丝体系中，以HFIP为溶剂，在共聚物中加少量dHAM，得到微米级纤维有序排列的层叠网状复合静电纺丝纤维膜。

[0033] 参考以下详细说明更易于理解本发明的上述以及其他特征、方面和优点。

附图说明

[0034] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

[0035] 图1是HAM脱细胞前(a)和后(b)的SEM图；

[0036] 图2是HAM和dHAM的DNA含量；

[0037] 图3是复合静电纺丝纤维膜的SEM图；

[0038] 图4是复合静电纺丝纤维膜的接触角测试；

[0039] 图5是G、T、GT和TH的红外光谱图；

[0040] 图6是DSC曲线(A为升温曲线，B为降温曲线)；

[0041] 图7是复合静电纺丝纤维膜的力学性能，其中：(a)杨氏模量、(b)抗拉强度(TS)、(c)断裂伸长率(EAB)和(d)应力–应变曲线(n＝3，杆为标准差)；

[0042] 图8是复合静电纺丝纤维膜的降解保留率；

[0043] 图9是复合静电纺丝纤维膜在不同浓度的材料提取液对细胞毒性等级测试；

[0044] 图10是复合静电纺丝纤维膜的生物相容性‑细胞增殖试验测试。

具体实施方式

[0045] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0046] 羊膜是人胎盘的一部分，主要由单层柱状上皮细胞、致密基底膜层、无细胞致密胶原层、下层成纤维细胞和海绵层组成，原本是一个包裹着发育中胎儿的充满羊水的囊，常在婴儿出生时被丢弃，以下实施例中新鲜的人羊膜样本取自上海市第六人民医院妇产科。

[0047] 在组织工程中，可医用的高分子材料经美国食品药品监督管理局认证的有生物降解性和生物相容性的聚(乳酸‑乙醇酸)PLGA、聚己内酯(PCL)等材料，PCL是ε‑己内酯单体聚合成的高分子聚合物，不同聚合条件可得不同分子量，优点在于易加工、韧性好，然而亲水性欠佳、降解时间较长；PLGA是乳酸和聚乙醇酸两种单体聚合成的无毒共聚物，生物降解速度可通过乳酸和聚乙醇酸两种单体的配比调控。两种单体中，乳酸是糖代谢的正常产物，体内可降解为H2O和CO2，不干扰人体组织正常生理功能；聚乙醇酸亲水性较好，与乳酸共混可提高降解速度、增加组织相容性，因其具有良好的生物相容性被广泛用于医用材料，缺点在于脆性大、韧性差，且降解周期相对较短，不能满足盆底部位长期修复的要求。PCL韧性好，与PLGA共混可提升力学参数并延长降解时间，随着PCL含量增加，纤维直径减小，纤维膜的断裂伸长率提高，通过调节聚合物的含量选择比例为30％PCL与15％PLGA调节静电纺丝纤维膜的力学性能。

[0048] 六氟异丙醇(HFIP)挥发性极强，能使聚合物在高压电场进行纺丝的时候充分延伸成细长纤维，到达接收装置的时候溶剂已经完全挥发，以HFIP为溶剂的静电纺丝液可极大增加原料溶解的程度，尤其是dHAM溶解的程度，并使纤维直径进一步缩小，以下实施例中采用HFIP作为静电纺丝溶剂。

[0049] 实施例1

[0050] 以下实施例中制备PCL/PLGA/dHAM静电纺丝膜，步骤如下：

[0051] 第一步：羊膜脱细胞

[0052] 初步清洗：在超净工作台中，将羊膜样本平铺，用去离子水配制的PBS进行清洗、去除血污，随后用75％乙醇漂洗至半透的状态。

[0053] 抑菌：配制含有10％双抗的PBS，将羊膜放入其中浸泡，用磁力搅拌器搅拌漂洗震荡，间隔12h更换浸泡液，共换2次，更换后继续震荡浸泡。

[0054] 表面活性剂漂洗：配制占PBS重量的1％的表面活性剂Triton‑100溶液，间隔8h更换浸泡液，共换2次。

[0055] 胰脂酶漂洗：配制每升含有1000U胰脂酶的PBS溶液，将羊膜浸泡于其中，37℃下震荡24h，随后取出清洗。

[0056] DNA酶漂洗：配制每升含有1000U的DNA酶的PBS溶液，将羊膜浸泡于其中，37℃下震荡3h，随后取出清洗。

[0057] 二次清洗：将用含双抗PBS溶液漂洗羊膜，间隔12h更换，共换2次，得到dHAM。4℃存于含有双抗的PBS溶液中备用。

[0058] 第二步：制备可溶dHAM粉末

[0059] 冻干研磨：取dHAM剪成适当大小，平铺在培养皿中，盖一层有孔的保鲜膜，预先置于‑80℃冰箱中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中，冷冻干燥48h制成冻干dHAM。将冻干dHAM在‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz下研磨3次，每次30s，用药匙迅速转移到5mL离心管中，磨成可通过50目筛的不溶dHAM粉末。

[0060] 消化透析：取1g不溶dHAM粉末加入20mL的含有HCl(0.5M)和胃蛋白酶(≥1600U/L)的水溶液中进行消化，在4℃下以每分钟200转的速度连续搅拌3天，使之获得可溶性，用NaOH(4N)中和至pH为7.4，配制成dHAM悬浮液。将dHAM悬浮液用去离子水透析24h，每4h换一次去离子水，得到dHAM粘性溶液。

[0061] 二次冻干研磨：将消化后的乳白色dHAM粘性溶液置于培养皿，盖有孔保鲜膜于‑80℃冰箱中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中，冷冻干燥48h制成冻干可溶dHAM。将冻干可溶dHAM在‑198℃的冷冻研磨机中，30Hz下研磨3次，每次30s，用药匙迅速转移到5mL离心管中，磨成可通过50目筛的可溶dHAM粉末。

[0062] 脱细胞程度检测与鉴定：用扫描电镜观察定性，将脱细胞前HAM与脱细胞后dHAM冻干，在加速电压为5–6kV的条件下用SEM放大500倍观察拍照，结果如图1所示。

[0063] 用试剂盒测定脱细胞前后DNA浓度定量鉴定羊膜脱细胞程度，按组织DNA提取试剂盒说明进行操作，检测HAM和dHAM的DNA浓度，用BCA试剂盒量化dHAM消化物中的蛋白质含量，并在562nm处用酶标仪测量吸光度值(Optical density，OD)，结果如图2所示。其中，配制稀释牛血清蛋白标准溶液(BSA)标准品：取50μL的2mg/mL的BSA标准品于1mL离心管中，加150μL的去离子水，混匀得200μL的0.5mg/mL的稀释后的BSA溶液标准品，于96孔板每孔分别加稀释后标准品各0、1、2、4、8、12、16、20μL，加去离子水补至20μL，加入适量稀释后的dHAM消化物，再次加去离子水补至20μL，取试剂盒中的SolutionA、B各6000μL、120μL混匀，得BCA工作液，96孔板每孔加200μL工作液，60℃反应30min，冷却至室温，在562nm用酶标仪测OD得到标准曲线，适量稀释后的dHAM消化物中蛋白质含量由样品OD代入回归方程中计算。将所测结果代入标准曲线的回归方程，发现脱细胞后的羊膜粉末中仍有较多蛋白质，根据回归曲线结果算得每克脱细胞羊膜粉末中含有81.693mg可检测出来的蛋白成分，证明经脱细胞、冻干研磨、消化透析、二次冻干研磨等一系列增溶步骤，并未使dHAM中有活性的蛋白质成分完全消失，而是成为分散的胶原纤维。

[0064] Triton X‑100与生物酶相结合的方式脱细胞操作简便，高效无毒，温和彻底。经生物酶联合脱细胞前HAM半透明，呈现乳白色，而脱细胞后dHAM变薄变大，干净透明，保留一定弹性。冻干后的dHAM为白色纸状，质地变硬，表面略粗糙。如图1所示，SEM放大500倍后，HAM表面有细胞黏附及丝状组织，而dHAM只见波浪状基质，表面干净致密，无细胞残留。如图2所示，HAM平均DNA浓度为389.26μg/mL，而dHAM平均DNA浓度为3.98μg/mL，显著低于脱细胞前。上述SEM和DNA含量检测结果均表明步骤一中羊膜脱细胞较彻底。

[0065] 第三步：配制静电纺丝溶液

[0066] 当静电纺丝溶剂为HFIP时，选取PCL、PLGA、dHAM的浓度分别为30％、15％、5％，配制静电纺丝溶液，具体如下：

[0067] 共混PLGA/PCL静电纺丝膜(简称G)的溶液：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，磁力搅拌器以300–3000rpm速度搅拌至溶解，12h后得到浓度为30％的PCL静电纺丝液，用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液，将PCL与PLGA以1:1的比例搅拌混匀，获得共混PLGA/PCL静电纺丝液。

[0068] 同轴PLGA/PCL静电纺丝膜(简称T)的溶液：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，磁力搅拌器以300–3000rpm速度搅拌至溶解，12h后得浓度为30％的PCL静电纺丝液，作为“核”部分的静电纺丝液，用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液，作为“壳”部分的静电纺丝液。

[0069] 共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝膜(简称GH)的溶液：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，磁力搅拌器以300–3000rpm速度搅拌至溶解，12h后得浓度为30％的PCL静电纺丝液，用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液及5％的dHAM静电纺丝液，将PCL、PLGA、dHAM以1：1：1的比例搅拌混匀，得到共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液。

[0070] 同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝膜(简称TH)的溶液：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，磁力搅拌器以300–3000rpm速度搅拌至溶解，12h后得到浓度为30％的PCL静电纺丝液，作为“核”部分的静电纺丝液，用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液及5％的dHAM静电纺丝液，作为“壳”部分的静电纺丝液。

[0071] 第四步：静电纺丝制备纤维支架

[0072] 连接静电纺丝装置，打开电源，采用不同的工艺参数，在倒置显微镜下观察纺丝形态并及时调整，经过参数优化，在环境湿度为30％–50％、温度为25–35℃的情况下，静电纺丝工艺参数包括：电压为15–20kV、针距接收棒距离为18cm、流速为30μL/min，所得纤维状态较好，收集四种静电纺丝薄膜，放置于通风橱中静置24h，待表面溶剂挥发后，再放入真空干燥箱保存。

[0073] 表征与测试

[0074] (1)正置显微镜观察

[0075] 用正置显微镜初步表征纤维形貌。稳定静电纺丝时，镊子夹载玻片收集3min，所得样品用于正置显微镜下观察形态，通过显微镜放大40倍，观察静电纺丝纤维膜的微观形态，如图3所示，四种复合静电纺丝纤维膜均呈白色薄纸状，微观表现出均匀层叠的微米纤维膜结构。G、T静电纺丝支架纯白扁平，微观为多孔纤维结构，呈无序分布；GH、TH静电纺丝支架表面不平整，微观结构与G、T相比发生显著变化，dHAM的添加表现为棒状或近珠状结构。可以看出，四种复合静电纺丝纤维膜都与ECM的结构非常相似。

[0076] (2)扫描电镜观察

[0077] 用扫描电镜进一步表征静电纺丝膜的微观结构，并据此测量纤维直径。制备的静电纺丝薄膜，肉眼下看起来为白色均匀的层叠网状膜，摸起来光滑、有韧性。膜经干燥、除去残留溶剂后，用剪刀剪成10mm×10mm的小块，贴在试样台上喷金90s，用扫描电镜在5kV电压下放大1000、2000倍观察并拍摄SEM图。用Image J软件分析SEM图，对纤维直径和分布进行测量，计算出平均直径值(n＝100)。

[0078] 静电纺丝纤维的分布趋势及定量如图3所示，G和T纤维直径平均集中在4–5μm的区域，添加dHAM的GH和TH纤维直径分布较宽泛，主要集中在10μm以下区域。少数纤维直径较大，可能与静电纺丝液中加入部分没有完全溶解的dHAM成分有关。对于含有dHAM的纤维，大量纤维表面收缩，少量纤维由于与相邻纤维融合而形成直径较大的纤维，GH纤维的最大直径为53.03μm，TH纤维的最大直径为51.12μm，远大于G(15.63μm)和T(14.57μm)。同轴静电纺丝纤维的形态与共混纤维相同，但纤维直径较小，最小直径为1.62μm，交点处有轻微的融化连接现象。另外，GH纤维的平均直径为9.3±0.21μm，TH纤维的平均直径为8.63±0.12μm，均小于G(7.7±0.11μm)和T(6.3±0.15μm)。

[0079] (3)接触角测试

[0080] 接触角(CA)测试可判断静电纺丝支架的亲水性，亲水性可影响材料上蛋白吸附和细胞增殖，将静电纺丝支架表面的杂质清理干净并保持平整光滑，然后通过视频接触角测量仪测量不同纤维支架的水接触角，常温下将一滴去离子水滴在纤维支架上，瞬时用高分辨率相机拍摄水滴与支架表面的夹角并观察。

[0081] 用图像法对样品表面的接触角进行分析，角的读数越大，越疏水、不易被润湿，即液体易在上面移动。PCL表面官能团有限，相对疏水，纯PCL微纤维支架表面的孔隙不能通过水，缺乏细胞粘附的结合位点，PCL材料上胞内蛋白吸附及天然生物活性相对较弱，而PLGA和dHAM的亲水性有利于细胞粘附，通过添加PLGA和dHAM共混的方式，提高材料表面羟基含量和亲水性，进而改善材料植入体内的细胞黏附状况。PLGA和dHAM与PCL相比加工性能较低，然而其指导生物反应的能力较高，通过添加PCL来提高PLGA和dHAM的加工性能，并制备易于加工的具有生物活性的材料。

[0082] 如图4所示，同轴静电纺丝纤维支架的接触角(T和TH)小于混纺纤维支架的接触角(G和GH)，不同微纤维支架的水接触角随PLGA暴露量的增加而减小，说明PCL具有疏水性，PLGA可提高其亲水性：T的接触角为87.24°，G的接触角为102.52°，这是因为同轴静电纺丝中PLGA在外面，T具有良好的亲水性；TH和GH的接触角分别为86.57°和92.12°，说明添加dHAM后静电纺丝纤维支架的亲水性更好。可以看出，亲水性PLGA包裹的T和TH的性能优于G和GH，说明PLGA比PCL更亲水，同轴静电纺丝支架更亲水。加入dHAM成分后，大部分孔隙被水填满。因此，GH膜和TH膜的水接触角要小于G膜和T膜。

[0083] (4)傅里叶变换红外光谱

[0084] 为确定四种含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的化学结构，将样品冻干并使用标准操‑1作程序使用傅立叶变换红外光谱仪对400–4000cm 范围内的样品进行检测，得四种材料的红外光谱图并分析。

[0085] 如图5所示，四种静电纺丝支架G、T、GH和TH的红外光谱都显示出PCL和PLGA对应的‑1 ‑1主要红外特征峰，如1720cm 和1170cm 分别对应着酯羰键和碳氧键的拉伸。另外，几乎所有的PCL峰都与所有的PLGA峰重合，这是由PCL含量较PLGA多所决定的，PLGA作为世界公认的细胞支持载体，存在大量的甲基、羰基和羧基，支持细胞的黏附和增殖。GH光谱中，在‑1 ‑1
1580cm 和1545cm 处出现酰胺的特征波段，酰胺基团的存在证实dHAM存在于静电纺丝纤维中，dHAM中的酰胺基形成氢键增加材料的亲水性；GH和TH的指纹图谱区域发现多糖的特‑1
征峰C‑C‑O和C‑O‑C，伸缩范围在1000到1200cm 之间。此外，含有dHAM的静电纺丝纤维支架GH和TH的红外光谱与G和T的表现相似，这可能是由于GH和TH中dHAM的含量较低，而PCL和PLGA的含量较高所致，特征峰的强度变化与成分含量的对应并不完全相同，这可能是由于静电纺丝薄膜的厚度不均匀，而峰的强度受厚度影响。

[0086] (5)静电纺丝膜热性能表征

[0087] 用差示扫描量热仪(DSC)观察不同静电纺丝膜的升温熔融和降温结晶的过程，进而表征其热力学性能。机械制冷并配有氮气保护以避免样品在高温下分解氧化，干燥样品取用量5mg，升温范围为‑80℃到250℃，升温速度为10℃/min，记录样品熔融过程；保温5min后，降温范围为250℃到‑80℃，以10℃/min的降温速率，绘制升温、降温曲线以记录样品熔融、结晶过程，如图6所示。

[0088] 升温曲线中，可看到熔融吸热峰的位置，加热到一定温度后，非晶体的物质转化为晶体，放出结晶潜热，这四种静电纺丝支架均在30℃和70℃间有一个吸热分解阶段，此后重量保持稳定。玻璃化转变温度也就是分解峰值，对于G和T来说都是55℃左右，而GH为57℃，说明加入dHAM之后使其玻璃化转变温度略有升高。TH的出峰不明显，约为33℃，这可能是由于包裹dHAM时PLGA完全暴露在外使玻璃化转变温度降低。降温曲线中，峰值一般表示凝固点，T、G均为15℃左右，GH为25℃，对TH来说降温曲线中就没有对应峰，可能是因为非晶体到晶体的转变不可逆，或者慢速降温的过程中已经充分结晶。

[0089] (6)力学性能测试

[0090] 为初步表征复合静电纺丝支架的力学性能，在恒温恒湿的环境中静置平衡24h后，利用质构仪进行单轴拉伸试验，对G、GH、T和TH四种材料进行测试。拉伸试验前，纺3mm左右厚度的纤维膜，将样品裁剪成宽为1cm，长为2cm的尺寸，将样品紧紧夹在两个砂纸胶粘探头间以产生最大的摩擦力。起初以2mm/min的速度夹取和拉动样品，以确保支架的力学性能从相同起点开始记录，然后以5mm/min的速度拉至材料断开，由三次平行试验绘制出应力–应变曲线，如图7所示。

[0091] 杨氏模量由应力–应变曲线斜率决定，其越大，表示材料越不易变形、弹性越好，G不易变形，可能是因为其PCL含量较高，并与PLGA充分混合，在脆性PLGA中加入柔性PCL可提高微纤维支架的机械强度，而PLGA包覆的同轴静电纺丝弹性性能相对较差(图7A)。

[0092] 抗拉强度为静电纺丝支架在拉伸试验中断裂前的最大平均应力，改变静电纺丝的方法并加入dHAM后，TS显著降低，GH和TH的最大平均应力分别为2.088±0.856MPa和3.498±1.259MPa(图7B)。

[0093] 断裂伸长率越大，材料张力越好，共混或者同轴的静电纺丝方法对EAB影响不大，在G、T中观察到较高的EAB(图7C)，说明PCL的加入保持纤维的直径，使支架更加稳定，而dHAM的加入使纤维结构变弱，破坏力学性能，力学性能显著下降，但仍可达到盆底组织的力学性能要求。

[0094] 非线性应力–应变曲线显示支架在拉伸过程中的变化情况，由于静电纺丝支架的厚度等不均匀，四种支架之间的差异很大，说明四种支架具有独特的力学性能和不同的纤维(图7D)。

[0095] (7)体外降解实验

[0096] 静电纺丝膜的降解实验在pH为7.2–7.4的PBS中进行，将静电纺丝膜裁剪为1cm×1cm，记录其初始质量W0，保存在温度为37℃、湿度为42％的恒温恒湿培养箱里。并将两种样品储藏于温度为23±5℃、相对湿度为50±10％的环境中进行降解，作为空白对照。每2周取样一次，共测试12周。

[0097] 为检测支架的生物降解性能，将这些支架的大小裁剪为1cm×1cm，然后放置于装有降解液的EP管中，降解液为1％的猪胰脂肪酶和1％的中性蛋白酶的模拟体液(pH＝7.2–7.4)，称为含酶模拟体液(eSBF)，然后保存在37℃恒温恒湿培养箱里。

[0098] 每组3个平行，每次取样后更换新鲜降解溶液以确保酶活性。每7天称重一次复合静电纺丝支架的剩余质量(Wt)，样品用DW洗涤3次，室温干燥至等重，称量后计算保留率(R％)。最后，根据三次平行试验的结果绘制降解率曲线，如图8所示。

[0099] 两种静电纺丝薄膜在PBS环境中稳定降解，符合共聚物的一般水解降解过程，即水分吸收、酯键断裂、可溶颗粒扩散和碎片溶解四个阶段。PBS中降解12周后，静电纺丝膜T剩余质量相对较少，保留量为86.77％，静电纺丝膜G保留量为90.21％，而两种空白对照组薄膜于储存条件下降解趋势线几乎重合，12周后剩余质量显著高于在PBS中降解的材料。由图可知，加入dHAM含静电纺丝时易产生珠粒，而相比于纯纤维状的膜片，有珠粒的膜降解更快，而且降解速率随珠粒数量的增多而增快，通过含酶降解液进一步证实中性蛋白酶可酶解dHAM，因为含有dHAM的膜降解更快。由于PLGA更亲水，比PCL降解快，且胰脂酶会降解PLGA，因此PLGA为外壳的同轴静电纺丝膜比两者共混的静电纺丝膜降解更快。降解6周后，降解速率最快的TH仍保留65.21％的质量，表示其可在较长的生物降解周期内对盆底受损组织进行支撑，从而达到组织再生恢复解剖结构以治疗疾病的目的。

[0100] 综上所述，接触角测试结果表明，亲水性PLGA包裹的复合静电纺丝纤维膜T和TH的亲水性能优于G和GH，加入dHAM成分的复合静电纺丝纤维膜GH和TH的亲水性能优于G和T，含dHAM的复合静电纺丝纤维膜较好的亲水性能利于后续细胞的黏附和生长。通过红外和热力学性能的表征，发现静电纺丝膜GH和TH成功纺入dHAM，出现特征基团且热力学性能稳定。理想的生物材料应表现出可在完全降解前，维持相关组织形成的机械性能，进一步评估其力学性能和降解速率，发现四种复合静电纺丝纤维膜的应力应变曲线差异显著，共混静电纺丝膜的杨氏模量、断裂强度和断裂伸长率等力学参数均比同轴静电纺丝膜更好。其中，静电纺丝膜G的力学性能最佳，加入dHAM后力学性能下降，但仍能达到盆底组织要求。12周水解试验后，共混静电纺丝膜剩余量为90.21％，同轴静电纺丝薄膜降解相对较快，剩余量为86.77％，表明PLGA为外壳的同轴静电纺丝膜比共混静电纺丝膜降解更快。6周酶解试验后，降解速率最快的TH仍保留65.21％的质量，表示其可在至少6周的生物降解周期内对盆底受损组织进行支撑。

[0101] (8)生物安全性‑细胞毒性实验

[0102] 静电纺丝膜浸提液制备：将各组膜裁剪至1cm×1cm大，1mg左右重。为灭菌，放在紫外线光下正反面各30min，再用75％的乙醇浸泡30min，无菌PBS洗净，再放在紫外线光下正反面各30min。按照静电纺丝膜：MSC培养液＝1mg：mL的比例配制，将静电纺丝膜完全浸泡于MSC培养液中，置于恒温培养箱中3d过滤除菌备用，经过滤和除菌，得到四种材料浸提液。

[0103] 细胞培养：取前期冻存MSC培养至P3，消化后制成浓度为每毫升50万个细胞的悬液，在96孔板每孔加100μL，培养24h使细胞贴壁。吸弃旧液，每孔加入100％、75％、50％、25％、12.5％不同比例浸提液各100μL。阴性对照是不包含浸提液的培养液(n＝6)。

[0104] 细胞相对增殖率检测：培养3d后，使用CCK8法检测细胞在四种支架上的增殖特性。在96孔板每孔加100μLCCK‑8工作液，孵育1h后及时取出，在450nm测定其OD，计算细胞的相对增值率(P％)，将各组PGR转换成材料毒性分级，0级和1级为无毒性。

[0105] 材料的细胞毒性：将hUC‑MSCs直接植入支架前，用支架浸提液测试支架的细胞毒性。为研究这一点，将hUC‑MSCs培养在含有不同浓度浸提液的MSCM培养基中，并用CCK8进行测定，以确定支架对hUC‑MSCs活力的影响。

[0106] 如图9所示，四种不同浓度静电纺丝支架提取液均对hUC‑MSCs增殖有一定抑制作用，且抑制程度随着材料提取液浓度的增大而增加，但经计算材料的毒性等级均小于1，说明静电纺丝支架没有明显毒性。纯聚合物静电纺丝支架对细胞增殖的抑制作用更明显，如G和T，而加入dHAM后材料生物相容性更好。共混静电纺丝膜上细胞增殖抑制较明显，如G和GH，同轴静电纺丝膜起初抑制率较低，随后因为PLGA比PCL生物相容性更好，表层PLGA逐渐降解后抑制率逐渐提高。

[0107] (9)生物相容性‑细胞增殖实验

[0108] 定量测试：24孔板中放入同样大小的无菌静电纺丝膜(1cm×1cm)PBS充分浸润后，4
吸出。用MSCM浸泡24h。将P3代MSC调整为2×10 个/mL的细胞悬液，每孔100μL细胞悬液，让hUC‑MSCs直接接触四种静电纺丝支架，于接种后1天、3天、5天、7天后取出细胞和支架复合物，浸泡在CCK8中1h后取出，记录液体在450nm时的OD(n＝6)。

[0109] 定性测试：六孔板中，将细胞培养在G、T、GH和TH的无菌静电纺丝支架上，以1×1042
个细胞/cm的密度培养，不含细胞的MSCM作为空白对照组。3d后，用活死细胞试剂盒检测细胞活力。首先，用PBS洗涤细胞，先后加入钙黄绿素、碘化丙啶两种染色液，在室温下将细胞置于黑暗处孵育30min：钙黄绿素激发活细胞的酯酶活性呈现绿色，碘化丙啶穿透死细胞呈现红色，吸弃染色液，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

[0110] 材料的生物相容性：采用体外培养法测定纤维的生物相容性，将hUC‑MSCs植入支架，为防止污染，用紫外线照射膜两面各30min，酒精浸泡30min，PBS冲洗后把膜放入96孔板，细胞早期在材料上的黏附和铺展对后续的细胞增殖及分化等行为影响大，往膜上接种hUC‑MSCs三天后，采用活死细胞试剂盒染色，在共聚焦显微镜下放大观察细胞在纤维表面形貌，定性检测细胞活力及生长状态。

[0111] 如图10所示，G和T组有细胞附着，但铺展不明显，而添加dHAM的支架GH和TH组呈正常多边形形态，很少的死亡细胞被注意到，而绝大多数细胞是活的，膜完好无损，GH和TH支架上出现绿色的活细胞生长良好，细胞仍保持正常的代谢活性和附着形态，GH组和TH组的活细胞密度明显高于G组和T组。结果显示hUC‑MSCs在GH和TH上的增殖能力明显高于在G和T上的增殖能力，hUC‑MSCs数量的增加表明GH和TH的生物相容性远强于G和T，即dHAM对细胞有良好反应，说明高细胞相容性的GH和TH适合于盆底组织的修复和再生。

[0112] 细胞粘附在膜表面形成组织样结构，静电纺丝支架的层次结构与天然细胞外基质相似，细胞表现出良好的生长能力，含dHAM的纤维支架具有较好的增殖效果。静电纺丝制备的复合支架具有良好的生物相容性和生物降解性，可支持hUC‑MSCs在其上增殖，所有这些细胞都成功地粘附在膜表面，显示正常形态，并以与常规二维培养相同速度增殖。检测到的死亡细胞数量可忽略不计，表明含dHAM的三维膜基质对细胞培养的相容性。细胞较易在高比表面积和高孔隙率的支架上生长，丝状或间距较大纤维膜提供高孔隙率适合细胞生长，低孔隙率含有串珠的纤维膜因其纤维直径缩小，具有高比表面积适合细胞生长，含有珠状结构的静电纺丝膜对细胞增殖没太大影响。

[0113] 综上所述，本发明制备出含有dHAM的共聚物静电纺丝膜，创新性地将dHAM这种细胞外基质用于静电纺丝，得到降解性能、力学性能和生物相容性都适于POP治疗的新型支架材料。基于组织工程原理成功制备PCL/PLGA‑dHAM共混及同轴静电纺丝支架，既保持化学合成材料的理化性能，又通过添加dHAM提高生物相容性。与PCL/PLGA单独合成的支架相比，含dHAM的静电纺丝支架均能提高MSCs增殖。另外，制备出的静电纺丝膜材料中，GH和TH的生物相容性远强于G和T，说明高细胞相容性的GH和TH适合于盆腔组织再生，PCL/PLGA/dHAM静电纺丝支架可模拟hUC‑MSCs的体内成分和结构，促进hUC‑MSCs的体外增殖。

[0114] 盆底修复和重塑是一个动态平衡的过程，而细胞作为操纵者，在盆底组织工程中，一方面维持稳定的微环境和维持功能性成纤维细胞和平滑肌细胞的数量是主要目标，另一方面种子细胞诱导分化可产生大量生物活性因子，帮助结缔及肌肉组织新生，治疗病变的盆底。随着生物补片在修复部位降解，新形成的组织逐渐取代补片，支持和纠正盆底的正常解剖结构，以实现POP的治疗。通过生物安全性‑细胞毒性实验和生物相容性‑细胞增殖实验证实，该支架对hUC‑MSCs没有细胞毒性，且具有较好的生物相容性，含有dHAM的静电纺丝膜更利于细胞的附着和增殖，展现出其在治疗POP方面的潜力，可用于个性化诊疗的组织工程复合生物网片。