草甘膦降解菌及其应用

摘要

本发明公开了一种草甘膦降解菌及其应用，属于利用微生物改良土壤领域，所述草甘膦降解菌为假单胞菌，该菌株已于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为假单胞菌SYH12 Pseudomonas sp.SYH12，保藏编号为CCTCC NO：M 20211071，保藏地址为中国武汉。本发明所述的草甘膦降解菌具有生长速度快、能够耐受高浓度草甘膦、遗传稳定性强的特点，可用于降解农田草甘膦和修复土壤。

权利要求

1.一种草甘膦降解菌，其特征在于：所述草甘膦降解菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）SYH12，该菌株已于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211071，保藏地址为中国武汉。

2.一种含有权利要求1所述草甘膦降解菌的菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（S1）培养基配制：（a）固体保藏培养基各成份及其终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0；（b）一级种子培养基各成份及其终浓度：葡萄糖5‑10 g/L，(NH4)2SO4 1‑5g/L，KH2PO4 1‑ 3g/L，MgSO4 0.1‑1g/L，胰蛋白胨5‑10 g/L，酵母浸粉 2‑7 g/L，CaCl2 1‑3g/L，pH 7.0‑7.2；（c）二级种子培养基各成份及其终浓度与一级种子培养基相同；

（S2）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱32℃培养24～

48h；

（S3）一级种子制备：挑取活化菌株接种于装有50mL一级种子培养基的三角瓶中，三角瓶的容积为500mL，并用纱布封口，于25‑35℃、150～200r/min摇床振荡培养24～48h，得一级液体种子；

（S4）二级菌种扩大培养：按5～10%接种量向二级种子培养基接入一级液体种子，在5L发酵罐上进行菌种培养，装液量为3L，转速200～700r/min，溶氧控制20%，pH7.0～7.5，温度

26～37℃，当葡萄糖浓度降至至2g/L时，流加500g/L的葡萄糖并维持葡萄糖浓度在2g/L，培养24～48h，8000r/min离心10min收集菌体，将菌体溶解于等体积清水中，制备SYH12菌悬液。

3.权利要求1所述草甘膦降解菌在降解农田草甘膦、修复土壤中的应用。

说明书

草甘膦降解菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种假单胞菌，尤其涉及一种可以降解草甘膦的假单胞菌，属于利用微生物改良土壤领域。

背景技术

[0002] 草甘膦是一种广谱、高效的有机磷除草剂，可控制世界上绝大多数危害性杂草，是目前世界上产量最大的农药品种之一。因其良好的除草效果得到广泛应用，导致其在土壤
中大量积累，已经对土壤化学过程和生态系统造成影响，同时也给环境带来安全风险，威胁
了人类健康。调查研究发现，土壤中残留的草甘膦会破坏土壤微生态，影响微生物数量和土
壤酶的活性，尤其会抑制放线菌数量和脲酶的活性，而且残留的草甘膦会随地表径流进入
地表水，影响水质，造成水生生态的失衡。不仅如此，更有研究发现，草甘膦会影响孕期动物
的胚胎发育，导致形态异变，给畜牧养殖行业带来危害。

[0003] 微生物降解是土壤中草甘膦降解的最主要途径。微生物主要通过两条途径降解草甘膦，碳磷键(C‑P键)断裂生成肌氨酸和碳氮键(C‑N键) 断裂生成氨甲基膦酸(AMPA)。目
前，生物降解草甘膦还局限于实验室研究阶段，降解能力有限，尤其尚未有土壤原位修复的
报道。因此，筛选高效降解菌是消除草甘膦造成的环境危害的关键。

发明内容

[0004] 发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种草甘膦降解菌及其应用。

[0005] 技术方案：为实现上述目的，本发明的一种草甘膦降解菌，所述草甘膦降解菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）SYH12，该菌株已于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏
中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211071，保藏地址为中国武汉。

[0006] 一种含有所述草甘膦降解菌的菌剂制备方法，包括以下步骤：

[0007] （S1）培养基配制：（a）固体保藏培养基各成份及其终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；（b）一级
种子培养基各成份及其终浓度：葡萄糖5‑10 g/L，(NH4)2SO4 1‑5g/L， KH2PO4 1‑ 3g/L，
MgSO4 0.1‑1g/L，胰蛋白胨5‑10 g/L，酵母浸粉 2‑7 g/L，CaCl2 1‑3g/L，pH 7.0‑7.2，121℃
高压蒸汽灭菌20min；（c）二级种子培养基各成份及其终浓度与一级种子培养基相同；

[0008] （S2）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱32℃培养24～48h；

[0009] （S3）一级种子制备：挑取活化菌株接种于装有50mL一级种子培养基的三角瓶中，三角瓶的容积为500mL，并用纱布封口，于25‑35℃、150～200r/min摇床振荡培养24～48h，
得一级液体种子；

[0010] （S4）二级菌种扩大培养：按5～10%接种量向二级种子培养基接入一级液体种子，在5L发酵罐上进行菌种培养，装液量为3L，转速200～700r/min，溶氧控制20%，pH7.0～7.5，
温度26～37℃，当葡萄糖浓度降至至2g/L时，流加500g/L的葡萄糖并维持葡萄糖浓度在2g/
L，培养24～48h，8000r/min离心10min收集菌体，将菌体溶解于等体积清水中，制备SYH12菌
悬液。

[0011] 所述草甘膦降解菌可用于降解农田草甘膦和修复土壤。

[0012] 有益效果：本发明所述的草甘膦降解菌具有生长速度快、能够耐受高浓度草甘膦、遗传稳定性强的特点，属于土壤土著微生物，环境定植性好、降解持效期长等优点，具有良
好的应用前景。

附图说明

[0013] 图1基于16SrRNA序列的系统发育树。

具体实施方式

[0014] 以下结合图1对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0015] 本发明所述草甘膦降解菌为假单胞菌，该菌株已于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）SYH12，保藏编号为：CCTCC 
NO：M 20211071，保藏地址为中国武汉。

[0016] （1）菌种的特性

[0017] 在保藏培养基上可以观察到该菌种呈乳白色，近圆形、表面光滑湿润、有光泽、边缘整齐；通过显微镜观察，菌体呈杆状，革兰氏阴性；生理生化指标如表1所示。

[0018] 表1 菌株SYH12生理生化特征

[0019]

[0020] （2）菌株的鉴定

[0021] 经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16SrRNA，基因序列长度为1440bp。在GenBank上进行BLAST比对并绘制系统进化树如图1所示。得出该菌株与Pseudomonas sp.MW578882.1
（HE651920）碱基相似性达99.7%，结合生理生化指标，将SYH12菌株鉴定为假单胞菌
(Pseudomonas sp.)。16SrRNA序列信息如SEQ.NO.1所示：

[0022] aggcctgcggcagctacacatgcagtcgagcggatgagtggagcttgctccatgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcc
tacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggta
aaggcctaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccaga
ctcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaaga
aggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttacca
acagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactg
ggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttggtaagatggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccataa
ctgcctgactagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaaca
ccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagata
ccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcga
taagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtgga
gcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtccggaaccttgcagagatgcgag
ggtgccttcgggaatcggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtccc
gtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaacc
ggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtac
agagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgac
tgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccg
cccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccgcaagggggacggtaccacggagataat
tgct

[0023] （3）假单胞菌SYH12草甘膦耐受性

[0024] 将假单胞菌SYH12涂布在添加不同浓度的草甘膦的LB培养基中培养3天，考察对草甘膦的耐受性。由表2中可见，在草甘膦浓度低于10g/L时，SYH12均可以生长，但不耐受15g/
L浓度的草甘膦。

[0025] 表2 草甘膦耐受性

[0026]

[0027] （4）遗传稳定性

[0028] 采用划线法将假单胞菌SYH12在固体培养基上连续传代20次，测定菌体形态、生长速度及对草甘膦的耐受性，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。

[0029] （5）菌株培养与草甘膦降解

[0030] （S1）分别配置固体保藏培养基、液体种子培养基和降解培养基。

[0031] 其中固体保藏培养基各组份及其终浓度为：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0；

[0032] 液体种子培养基各组份及其终浓度为：草甘膦2g/L，葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母浸粉2g/L，CaCl2 1g/L，121℃高压蒸汽灭
菌20min；

[0033] 降解培养基各组份及其终浓度为：草甘膦 0.5g/L，(NH4)2SO4 2 g/L， KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZeSO4 1mg/L，CaCl2 1g/L，维生素B1 0.1mg/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭
菌20min。

[0034] （S2）挑取菌种至固体保藏培养基，划线接种于恒温培养箱32℃培养48h。

[0035] （S3）挑取活化菌株接种于装有50mL一级液体种子培养基的三角瓶中，三角瓶的容积为500mL，八层纱布封口，于30℃， 200r/min摇床振荡培养36 h，得液体种子。

[0036] （S3）草甘膦降解：按5%接种量向降解培养基接入一级液体种子，装液量为50mL/500 mL三角瓶，转速200r/min，温度30℃，通气培养80h。

[0037] 表3 草甘膦降解率

[0038]

[0039] （6）SYH12菌剂制备

[0040] （S1）分别配置固体保藏培养基、一级种子培养基和二级种子培养基。

[0041] 其中固体保藏培养基各组份及其终浓度为：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

[0042] 一级种子培养基和二级种子培养基的各组份及其终浓度相同，均为：葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 1g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉2 g/L，CaCl2 1g/L，
pH 7.0。

[0043] （S2）挑取菌种至固体保藏培养基中，划线接种于恒温培养箱32℃培养48h。

[0044] （S3）挑取活化菌株接种于装有50mL液体一级种子培养基的三角瓶中，三角瓶的容积为500mL，八层纱布封口，于30℃， 200r/min摇床振荡培养36 h，得一级液体种子。

[0045] （S4）按5%接种量向二级种子培养基接入一级液体种子，在5L发酵罐上进行菌种培养，装液量为3L，转速200r/min，溶氧控制20%左右，pH7.0，温度30℃，当葡萄糖浓度降至至
2g/L时，流加500g/L的葡萄糖并维持葡萄糖浓度在2g/L，培养48h，8000r/min离心10min收
集菌体，将菌体溶解于等体积清水中，制得SYH12菌悬液。

[0046] （7）假单胞菌SYH12田间降解草甘膦效果验证

[0047] 在喷施草甘膦的农田选择6处1m3的地块，3块地喷施制备的菌剂500mL，3块地喷施等量清水作为对照实验组，喷施后10天测定土壤中草甘膦浓度，计算降解效果。试验结果如
下表4所示，喷施后10天，草甘膦降解率均超过68%，可以降解土壤中大部分的草甘膦，具有
潜在的推广应用价值。

[0048] 表4 假单胞菌SYH12田间降解草甘膦效果验证

[0049]

[0050] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。