口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法转让专利
申请号 : CN202110786329.5
文献号 : CN113607626B
文献日 : 2022-06-14
发明人 : 周红梅 , 罗晶晶 , 刘扬帆 , 吴杨 , 杨津 , 吴芳龙
申请人 : 四川大学
摘要 :
本发明提供了一种口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法，该方法包括：在第一预设辐照条件下，对口腔癌相关成纤维细胞进行辐照，构建僵尸样口腔癌相关成纤维细胞；在第二预设辐照条件下，研究僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响。本发明公开的口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法，从电离辐射对口腔癌相关成纤维细胞(CAFs)的生物学功能影响，以及接受放疗后的僵尸样口腔CAFs对口腔鳞状癌细胞的影响角度出发，研究僵尸样口腔CAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响，以寻找可能诱导OSCC复发的因素，有助于未来更好地对口腔CAFs导致的肿瘤复发和转移进行研究，从而更好地探索与口腔CAFs相关的预防放疗后OSCC复发及转移的方向。
权利要求 :
1.一种口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法，其特征在于，所述研究方法包括：
在第一预设辐照条件下，对口腔癌相关成纤维细胞进行辐照，并对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测和增殖能力检测；
根据所述DNA损伤检测结果和所述增殖能力检测结果，构建僵尸样口腔癌相关成纤维细胞，对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行迁移活性检测，所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞为未死亡的增殖受阻、衰老增加、迁移能力降低的所述口腔癌相关成纤维细胞；
在第二预设辐照条件下，研究所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响；
根据所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例，确定所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞能够降低辐照后的口腔鳞癌细胞的耐放射能力。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为2Gy、6Gy、12Gy和18Gy。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测的方法包括：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行53BP1免疫荧光染色，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中53BP1焦点数大于3的细胞百分率。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行增殖能力检测的方法为：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行BrdU免疫荧光染色实验，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中BrdU呈阳性表达的细胞百分率。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老特征检测的方法为：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老相关β‑半乳糖苷酶染色实验，并借助倒置相差显微镜确定在3个随机视野中，衰老相关β‑半乳糖苷酶染色呈阳性表达的细胞百分率。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞是在单次X射线的电离辐射剂量为18Gy的辐照条件下得到。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行迁移活性检测的方法为：对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行划痕实验，拍摄划痕面积并使用ImageJ软件分析细胞爬行比例。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述研究所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响的检测操作，包括：以所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养作为实验组，在第二预设辐照条件下，检测所述实验组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定所述实验组中所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例；
以所述未辐照口腔癌相关成纤维细胞与所述口腔鳞癌细胞共培养作为对照组，在第二预设辐照条件下，检测所述对照组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定所述对照组中所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对照组还包括：对所述口腔鳞癌细胞的常规培养以及未辐照正常相关成纤维细胞与所述口腔鳞癌细胞共培养。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第二预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy。
说明书 :
口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学研究领域，特别涉及口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法。
背景技术
[0002] 口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势。由于OSCC特殊的口腔颌面部生理位置，其发展往往会对OSCC患者的容貌和面部功能造成极大的损害。现有治疗手段中，本领域技术人员普遍认为放疗对治疗OSCC具有较好的短期疗效。所谓放疗，就是通过高能射线直接诱导DNA双链断裂或通过活性氧(ROS)积累造成间接氧化DNA损伤来杀伤癌细胞。
[0003] 但经过放射治疗的OSCC患者在原发肿瘤显著抑制后，出现放射耐受导致局部复发或转移的情况较为常见。而对OSCC放射耐受导致局部复发或转移的具体相关机制，尚未明确。
发明内容
[0004] 基于背景技术介绍的接受放疗后OSCC复发或转移的问题，发明人想到，放疗在一定条件下也有可能发挥“反派”的作用：在杀死癌细胞的同时，特定条件下还有可能促进癌细胞的增殖或转移。同时，辐射对肿瘤微环境(TME)的扰动，也应当引起关注。因为，TME是一个错综复杂的系统，它包含各种各样的细胞类型，主要有成纤维细胞、内皮细胞、各种免疫细胞和癌症干细胞等。其中，成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的基质细胞类型，其可通过旁分泌作用和/或与癌细胞的交互通话，促进肿瘤的发生。
[0005] 基于上述思考，本发明的发明人提出从电离辐射对口腔癌相关成纤维细胞(口腔CAFs)的生物学功能影响，以及接受放疗后的口腔CAFs对口腔鳞癌细胞(OSCC细胞)的影响角度出发，研究口腔CAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响，以明确可能诱导OSCC放疗后复发或转移的因素，从而有助于未来更好地研究口腔CAFs调控的肿瘤复发和转移机制，进而探索以口腔CAFs靶标的防治放疗后OSCC复发及转移的策略。
[0006] 本发明提供一种口腔癌相关成纤维细胞影响癌耐放射能力的研究方法，所述研究方法包括：
[0007] 在第一预设辐照条件下，对口腔癌相关成纤维细胞进行辐照，并对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测和增殖能力检测；
[0008] 根据所述DNA损伤检测结果和所述增殖能力检测结果，构建僵尸样口腔癌相关成纤维细胞，所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞为未死亡的增殖受阻、衰老增加、迁移能力降低的所述口腔癌相关成纤维细胞；
[0009] 在第二预设辐照条件下，研究所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响；
[0010] 根据所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例，确定所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞能够降低辐照后的口腔鳞癌细胞的耐放射能力。
[0011] 优选地，所述第一预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为2Gy、6Gy、12Gy和18Gy。
[0012] 优选地，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测的方法包括：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行53BP1免疫荧光染色，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中53BP1焦点数大于3的细胞百分率。
[0013] 优选地，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行增殖能力检测的方法为：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行BrdU免疫荧光染色实验，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中BrdU呈阳性表达的细胞百分率。
[0014] 优选地，所述对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老特征检测的方法为：对所述辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老相关β‑半乳糖苷酶染色实验，并借助倒置相差显微镜确定在3个随机视野中，衰老相关β‑半乳糖苷酶染色呈阳性表达的细胞百分率。
[0015] 优选地，所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞是在单次X射线的电离辐射剂量为18Gy的辐照条件下得到。
[0016] 优选地，所述对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行迁移活性检测的方法为：对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行划痕实验，拍摄划痕面积并使用ImageJ软件分析细胞爬行比例。
[0017] 优选地，所述对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行迁移活性检测的方法为：对所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行划痕实验，拍摄划痕面积并使用ImageJ软件分析细胞爬行比例。
[0018] 优选地，所述研究所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响的检测操作，包括：
[0019] 以所述僵尸样口腔癌相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养作为实验组，在第二预设辐照条件下，检测所述实验组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定所述实验组中所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例。
[0020] 以所述未辐照口腔癌相关成纤维细胞与所述口腔鳞癌细胞共培养作为对照组，在第二预设辐照条件下，检测所述对照组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定所述对照组中所述口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例。
[0021] 优选地，所述对照组还包括：对所述口腔鳞癌细胞的常规培养以及未辐照正常相关成纤维细胞与所述口腔鳞癌细胞共培养。
[0022] 优选地，所述第二预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 本发明的发明人提出从电离辐射对口腔癌相关成纤维细胞(口腔CAFs)的生物学功能影响，以及接受放疗后的口腔CAFs对口腔鳞癌细胞(OSCC细胞)的影响角度出发，研究高剂量辐照后构建的僵尸样口腔CAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响，以明确可能诱导OSCC复发或转移的因素。
[0025] 本发明提供的研究方法通过研究高剂量辐照后构建的僵尸样口腔CAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响，得出高剂量辐照后构建的僵尸样口腔CAFs对OSCC细胞耐放射能力具有明显的抑制作用。该结论有助于未来更好地研究口腔CAFs调控的肿瘤复发和转移机制，进而探索以口腔CAFs靶标的防治放疗后OSCC复发及转移的策略。
附图说明
[0026] 图1a示出了本发明实施例分离得到的人原代口腔CAFs的ICC染色结果示意图；其中，FAP(+),Vimentin(+),α‑SMA(+),Pan‑CK(‑)；
[0027] 图1b示出了本发明实施例分离得到的人原代口腔NAFs的ICC染色结果示意图；其中，FAP(‑),Vimentin(+),α‑SMA(‑),Pan‑CK(‑)；
[0028] 图2a示出了本发明实施例的口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于24小时后进行53BP1核焦点免疫荧光染色的结果示意图；
[0029] 图2b示出了本发明实施例的口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行53BP1核焦点免疫荧光染色的结果示意图；
[0030] 图3示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照，分别于24小时后和6天后进行53BP1核焦点免疫荧光染色，对单个口腔CAFs细胞53BP1阳性核焦点平均值分析的统计图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0031] 图4示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照，分别于24小时后和6天后进行53BP1核焦点免疫荧光染色，对53BP1阳性核焦点大于3的口腔CAFs(即DNA损伤的CAFs)细胞百分比分析的统计图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0032] 图5a示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于24h后进行BrdU染色的结果示意图；
[0033] 图5b示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行BrdU染色的结果示意图；
[0034] 图6示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24小时后和6天后进行BrdU染色阳性的增殖细胞百分比的统计图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0035] 图7示出了本发明实施例口腔CAFs在18Gy IR辐照后的形态变化示意图；
[0036] 图8示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行SA‑β‑gal染色的结果示意图；
[0037] 图9示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy，2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行SA‑β‑gal染色结果呈阳性的衰老细胞百分比统计的结果图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0038] 图10示出了本发明实施例zCAFs在18Gy IR辐照后，于6天后进行划痕实验，分别在划痕0h、24h、48h时的划痕实验结果示意图；
[0039] 图11示出了本发明实施例zCAFs在18Gy IR辐照后，于6天后进行划痕实验，分别在划痕24h、48h时的细胞爬行面积占比统计图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0040] 图12示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞存活的克隆形成实验示意图；
[0041] 图13示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞存活的克隆形成百分比的统计图；其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
[0042] 图14示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞的存活分数统统计图；
[0043] 图15示出了本发明实施6Gy IR辐照后，分别于24小时和48小时后进行不同培养条件下的口腔鳞癌细胞53BP1核焦点免疫荧光染色的结果示意图；
[0044] 图16示出了本发明实施6Gy IR辐照后，分别于24小时和48小时后对不同培养条件下DNA损伤的口腔鳞癌细胞的百分比分析的统计图。
具体实施方式
[0045] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0046] 实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0047] 为了研究口腔CAFs对OSCC细胞的影响，本发明提出的技术构思为：首先，研究了电离辐射(IR)对口腔癌相关成纤维细胞(口腔CAFs)的影响，确定在不同电离辐射剂量条件下，电离辐射对口腔CAFs生物学功能影响；在观察IR对口腔CAFs生物学特性的影响过程中，发明人发现，一些CAFs即使暴露于高剂量IR也不死亡，而是变成一种“僵而不死”的类僵尸状态(发明人将其命名为僵尸样口腔癌相关成纤维细胞)，于是，发明人又进行了进一步研究实验，将僵尸样口腔癌相关成纤维细胞与OSCC细胞在辐照条件下进行共培养，并设置相应对照组，检测实验组和对照组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率和DNA损伤水平，确定实验组和对照组中口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例，根据实验得到的口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例，以确定僵尸样口腔癌相关成纤维细胞影响口腔鳞癌细胞耐放射能力。基于该技术构思，本发明实施例的具体内容如下：
[0048] 在第一预设辐照条件下，对口腔癌相关成纤维细胞进行辐照，并对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测和增殖能力检测；
[0049] 根据DNA损伤检测结果和增殖能力检测结果，构建僵尸样口腔癌相关成纤维细胞，僵尸样口腔癌相关成纤维细胞为未死亡的增殖受阻、衰老增加、迁移能力降低的口腔癌相关成纤维细胞；
[0050] 具体实施时，辐照后的口腔CAFs细胞的DNA损伤检测结果表现为除受18Gy的高剂量IR辐照外，其他剂量辐照后的CAFs有足够的能力随辐照后时间的延长而进行DNA损伤修复。而经过18Gy IR辐照的口腔CAFs的DNA损伤无法恢复；
[0051] 具体实施时，辐照后的口腔CAFs细胞的增殖能力检测结果表现为当IR达到6Gy及以上时，细胞增殖完全停止；6天后，2Gy和6Gy(相对低剂量IR)辐照的CAFs增殖能力部分恢复，而12Gy和18Gy(相对高剂量IR)辐照的CAFs增殖仍完全停止。
[0052] 具体实施时，发明人观察到接受18Gy IR剂量辐照后的口腔CAFs形态变成一种“僵而不死”的类僵尸状态，并表现出衰老表型增加和迁移能力降低。因此，发明人将受18Gy IR剂量辐照后表现出未死亡、增殖受阻、DNA损伤难以恢复、衰老增加、迁移能力降低的口腔CAFs命名为僵尸样口腔癌相关成纤维细胞(zCAFs)。
[0053] 在第二预设辐照条件下，研究僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对电离辐射辐照后口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的影响；
[0054] 根据口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例，确定僵尸样口腔癌相关成纤维细胞能够降低口腔鳞癌细胞的耐放射能力。
[0055] 具体实施时，优选地，第一预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为2Gy、6Gy、12Gy和18Gy。
[0056] 具体实施时，经过IR辐照的口腔CAFs均未死亡且增殖受阻；而12Gy和18Gy辐照的CAFs具有增殖受阻和明显的衰老表型。
[0057] 具体实施时，优选地，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测的方法包括：对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行53BP1免疫荧光染色，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中53BP1焦点数大于3的细胞百分率。
[0058] 具体实施时，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行DNA损伤检测，选择辐照后持续观察1天和6天的口腔癌相关成纤维细胞进行53BP1免疫荧光染色实验。
[0059] 具体实施时，优选地，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行增殖能力检测的方法为：对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行BrdU免疫荧光染色实验，并借助荧光倒置显微镜确定3‑5个随机视野中BrdU呈阳性表达的细胞百分率。
[0060] 具体实施时，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行增殖能力检测，选择辐照后持续观察1天和6天的口腔癌相关成纤维细胞进行BrdU免疫荧光染色实验。
[0061] 具体实施时，优选地，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老特征检测的方法为：对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老相关β‑半乳糖苷酶染色实验，并借助倒置相差显微镜确定在3个随机视野中，衰老相关β‑半乳糖苷酶染色呈阳性表达的细胞百分率。
[0062] 具体实施时，对辐照后口腔癌相关成纤维细胞进行衰老特征检测，选择辐照后持续观察6天的口腔癌相关成纤维细胞进行衰老相关β‑半乳糖苷酶染色实验。
[0063] 具体实施时，优选地，僵尸样口腔癌相关成纤维细胞是在单次X射线的电离辐射剂量为18Gy的辐照条件下得到。
[0064] 具体实施时，优选地，对僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行迁移活性检测的方法为：对僵尸样口腔癌相关成纤维细胞进行划痕实验，拍摄划痕面积并使用ImageJ软件分析细胞爬行比例。
[0065] 具体实施时，优选地，对僵尸样口腔癌相关成纤维细胞对辐照后口腔鳞癌细胞存活率和DNA损伤的影响的执行操作，包括：
[0066] 以僵尸样口腔癌相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养作为实验组，在第二预设辐照条件下，检测实验组辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定实验组中口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例；
[0067] 以未辐照口腔癌相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养作为对照组，在第二预设辐照条件下，检测对照组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定对照组中口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例。
[0068] 具体实施时，在第二预设辐照条件下，将实验组与对照组实验结果比对，可以得出，实验组中，僵尸样口腔癌相关成纤维细胞能够降低对口腔鳞癌细胞存活率和DNA损伤抑制的促进作用，确定僵尸样口腔癌相关成纤维细胞降低辐照后的口腔鳞癌细胞的耐放射能力。
[0069] 具体实施时，优选地，对照组还包括：在常规培养基培养以及以未辐照正常成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养。
[0070] 具体实施时，优选地，第二预设辐照条件包括单次X射线的电离辐射剂量分别为0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy，
[0071] 具体实施时，克隆形成率的检测是在在辐照后，持续观察10天后进行，DNA损伤水平检测分别在辐照后，持续观察1天及2天后分别进行。
[0072] 为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的一种口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法。
[0073] 本发明实施例涉及到的新鲜OSCC组织来自于手术治疗的OSCC患者，正常口腔黏膜组织来自于接收正颌手术或创伤整形手术的病人，临床标本均包括上皮组织和相邻的结缔组织(距上皮3mm以内)，本研究使用人体组织经四川大学华西口腔医院人体研究伦理委员会批准(编号:WCHSIRB‑D‑2018‑057)，所有患者均签署知情同意书。OSCC细胞株Cal‑27从ATCC购买，并已通过短串联重复序列(STR)鉴定。
[0074] 原代成纤维细胞和OSCC细胞系在37℃及5％的CO2加湿环境中，使用添加10％胎牛血清(Gibco，美国)和1％青霉素及链霉素(Gibco，美国)的DMEM高糖培养基(Gibco，美国)培养
[0075] 实施例1：分离培养人源原代口腔CAFs
[0076] 从新鲜OSCC组织分离出口腔CAFs，从正常口腔黏膜组织中分离出正常组织相关成纤维细胞(NAFs)。
[0077] 采用组织贴壁法分离培养人原代口腔CAFs和NAFs。简单步骤为：将组织块尽量剪碎，至碎片直径不大于3mm；将组织碎片转移至T25细胞培养瓶使之贴壁，加入1‑2ml培养基后反向放置培养瓶于孵育箱2小时，再加入3ml培养基，正向放直到爬行细胞满度达到80％。
[0078] 对分离得到的人原代口腔CAFs和NAFs进行免疫细胞化学(ICC)染色，以进一步鉴定其形态和生长模式，并通过倒置相差显微镜进行观察。其中，按说明书使用SP‑9000检测试剂盒和DAB试剂盒(北京中山金桥生物科技有限公司)。使用的一抗包括抗α‑平滑肌肌动蛋白(α‑SMA)抗体(Abcam,1:100)、抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)抗体(Abcam,1:100)、抗波形蛋白(Vimentin)抗体(Abcam,1:250)和抗细胞角蛋白(Pan‑CK)抗体(Abcam,1:100)。PBS作为阴性对照。
[0079] 图1a和图1b示出了本发明实施例分离得到的人原代口腔CAFs和NAFs的ICC染色结果。其中，图1a代表本发明实施例分离得到的人原代口腔CAFs的ICC染色结果，图1b代表本发明实施例分离得到的NAFs的ICC染色结果。通过图1观察到，本发明成功分离了原代口腔CAFs和正常组织相关成纤维细胞(NAFs)。并且，与正常组织相关成纤维细胞(NAFs)相比，原代口腔CAFs表现出Vimentin、FAP和α‑SMA阳性表达，Pan‑CK阴性表达(图1a)，而口腔NAFs仅表现出Vimentin阳性表达，其他标志物表达阴性(图1b)，这表明本发明分离的口腔CAFs处于活化状态。
[0080] 实施例2：检测电离辐射(IR)对口腔CAFs的DNA损伤的影响
[0081] 使用X‑ray 160辐照仪(Precision X‑ray(PXi)，美国)对细胞进行X射线辐照，剂量率为1.92Gy/min，参数设置为电压160KV，电流18.70mA，源靶距50cm。辐照时，将孔板放置在X射线源正下方，以避免射线散射。辐照后的细胞在1小时内尽快放回37℃培养箱。定期在倒置相差显微镜(LEICA,德国)下观察辐照细胞的形态学变化，以确认电离辐射生效。
[0082] 对CAFs细胞进行2Gy、6Gy、12Gy和18Gy单次剂量X射线辐照，分别在辐照24h和6天后，对辐照后口腔CAFs进行53BP1免疫荧光染色，检测电离辐射(IR)对CAFs DNA损伤的影响。染色前使用10％中性甲醛室温下固定细胞15分钟，然后用0.1％Triton X‑100溶液室温下破膜10分钟。一抗为抗53bp1抗体(Abcam，英国，1:250)。二抗为5％BSA稀释的fitc标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，中国，1:100)。核染色均采用DAPI。200×视场图像在德国徕卡荧光倒置显微镜下扫描。53BP1焦点数大于3的细胞百分率以及53BP1细胞核焦点数在3‑5个随机视野中测定，计算测定的平均值和标准误差。
[0083] 图2a和图2b示出了本发明实施例的口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24小时后和6天后进行53BP1焦点染色的结果示意图，如图2a和图2b所示，与未辐照的细胞相比(IR辐照剂量为0Gy)，所有剂量的IR均导致核焦点数增加。这表明辐射的有效性和口腔CAFs对IR辐照的DNA损伤反应。
[0084] 图3示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24小时后和6天后进行53BP1核焦点免疫荧光染色，对单个口腔CAFs细胞53BP1阳性核焦点平均值分析的统计图；如图3所示，单个口腔CAFs细胞的核焦点数量随着IR辐照剂量的增加而增加(图3，左)，除高剂量组(12Gy和18Gy组)外，组间差异有统计学意义，证实了辐照的有效性。
[0085] 此外，发明人还观察到，未辐照的CAFs中的核焦点数不超过3。因此，本发明对53BP1核焦点>3的细胞设置为DNA损伤的细胞，并对DNA损伤细胞的百分比进行了统计，图4示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24小时后和6天后进行53BP1核焦点免疫荧光染色，对53BP1阳性核焦点大于3的口腔CAFs(即DNA损伤的CAFs)细胞百分比分析的统计图，如图4所示，其结果与平均核焦点数统计的结果趋势相同(图4，左)。
[0086] 通过分析比对图3中辐照6天后平均核焦点数(图3，右)和图4中辐照6天后DNA损伤细胞比例(图4，右)发现，辐照6天后，核焦点数和DNA损伤细胞比例仍与IR剂量呈依赖性增加，但相比24h明显降低。并且，经18Gy剂量辐照的口腔CAFs DNA损伤几乎无法恢复。这表明，除18Gy的高剂量IR辐照外，辐照后的CAFs有足够的能力随辐照后时间的延长而进行DNA损伤修复。而经过18Gy IR辐照的口腔CAFs的DNA损伤无法恢复。
[0087] 实施例3：检测电离辐射(IR)对口腔CAFs增殖能力的影响
[0088] 使用X‑ray 160辐照仪(Precision X‑ray(PXi)，美国)对细胞进行X射线辐照，剂量率为1.92Gy/min，参数设置为电压160KV，电流18.70mA，源靶距50cm。辐照时，将孔板放置在X射线源正下方，以避免射线散射。辐照后的细胞在1小时内尽快放回37℃培养箱。定期在倒置相差显微镜(LEICA,德国)下观察辐照细胞的形态学变化，以确认电离辐射生效。
[0089] 对CAFs细胞进行2Gy、6Gy、12Gy和18Gy单次剂量X射线辐照，分别在辐照后24h和6天后，对辐照后CAFs进行BrdU免疫荧光染色，检测电离辐射(IR)对CAFs增殖能力的影响。染色前使用10％中性甲醛室温下固定细胞15分钟，然后用0.1％Triton X‑100溶液室温下破膜10分钟。一抗为抗BrdU抗体(Abcam，英国，1:250)。二抗为5％BSA稀释的fitc标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，中国，1:100)。核染色均采用DAPI。200×视场图像在德国徕卡荧光倒置显微镜下扫描。BrdU阳性的细胞百分率在3‑5个随机视野中测定，计算三次测定的平均值和标准误差。
[0090] 图5a和图5b示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24h后和6天后进行BrdU染色的结果示意图；图6示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，分别于24小时后和6天后进行BrdU染色阳性的增殖细胞百分比的统计图；如图5a、图5b和图6所示，通过免疫荧光定量BrdU标记的辐照后24小时和6天后口腔CAFs增殖的情况，检测口腔CAFs的细胞增殖能力随梯度剂量IR的变化情况，24小时后，随着IR剂量的增加，口腔CAFs的增殖明显减弱，当IR达到6Gy及以上时，细胞增殖完全停止(图5a)。6天后，2Gy和6Gy(相对低剂量IR)辐照的CAFs增殖能力部分恢复，而12Gy和18Gy(相对高剂量IR)辐照的CAFs增殖仍完全停止(图5b)。
[0091] 图7示出了本发明实施例口腔CAFs在18Gy IR辐照后的形态变化示意图；如图7所示，受18Gy IR剂量辐照后的口腔CAFs的体积较未辐照口腔CAFs更大，形态更复杂(图中箭头所示)，呈现出一种“僵而不死”的状态。
[0092] 基于此，发明人将受18Gy IR剂量辐照后表现出未死亡、增殖受阻、DNA损伤无法恢复的口腔CAFs命名为僵尸型CAFs(zCAFs)。
[0093] 为进一步确定18Gy IR剂量辐照后的僵尸型CAFs(zCAFs)的表型和功能改变，发明人又进行了如下实验：
[0094] (1)半乳糖苷酶实验：
[0095] 检测内源性衰老相关β‑半乳糖苷酶(SA‑β‑gal)表达。将接受过2Gy、6Gy、12Gy和4
18Gy单次剂量X射线辐照的CAFs细胞于6天后分别接种于6孔板，密度为3×10/孔。使用半乳糖苷酶(SA‑β‑gal)染色试剂盒(碧云天，中国)，按照厂家提供的方法进行检测。细胞在1×固定液中固定15分钟，然后使用1×染色液，在37℃无二氧化碳环境中孵育过夜。分别在倒置相差显微镜下拍摄40×和100×图像，在3个随机视野中统计SA‑β‑gal阳性表达细胞比例。细胞质呈绿色或深绿色染色的细胞为阳性。
18Gy单次剂量X射线辐照的CAFs细胞于6天后分别接种于6孔板，密度为3×10/孔。使用半乳糖苷酶(SA‑β‑gal)染色试剂盒(碧云天，中国)，按照厂家提供的方法进行检测。细胞在1×固定液中固定15分钟，然后使用1×染色液，在37℃无二氧化碳环境中孵育过夜。分别在倒置相差显微镜下拍摄40×和100×图像，在3个随机视野中统计SA‑β‑gal阳性表达细胞比例。细胞质呈绿色或深绿色染色的细胞为阳性。
[0096] 图8示出了本发明实施例口腔CAFs口腔CAFs在0Gy，2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行SA‑β‑gal染色结果示意图；图9示出了本发明实施例口腔CAFs在0Gy、2Gy、6Gy、12Gy和18Gy梯度剂量IR辐照后，于6天后进行SA‑β‑gal染色结果呈阳性表达的细胞百分比统计结果图；如图8、图9所示，对辐照后的口腔CAFs进行SA‑β‑gal染色，并观察到在6天后，SA‑β‑gal阳性表达的口腔CAFs与IR剂量呈依赖性增加。
[0097] (2)划痕实验：
[0098] 将接受过18Gy单次剂量X射线辐照的口腔CAFs以及未接受辐照的口腔CAFs细胞分4
别以4×10/孔的密度接种于6孔板中，使其生长至几乎100％的结合度。使用100ul枪尖对单层细胞划痕,然后更换培养基为含2％胎牛血清的DMEM培养基。分别在划痕后0小时、24小时和48小时观察和拍摄划痕面积，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院和实验室，Bethesda，MD，美国)分析细胞爬行比例。
别以4×10/孔的密度接种于6孔板中，使其生长至几乎100％的结合度。使用100ul枪尖对单层细胞划痕,然后更换培养基为含2％胎牛血清的DMEM培养基。分别在划痕后0小时、24小时和48小时观察和拍摄划痕面积，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院和实验室，Bethesda，MD，美国)分析细胞爬行比例。
[0099] 图10示出了本发明实施例zCAFs在18Gy IR辐照后，于6天后进行划痕实验，分别在划痕0h、24h、48h时的划痕实验结果示意图；图11示出了本发明实施例zCAFs在18Gy IR辐照后，于6天后进行划痕实验，分别在划痕24h、48h时的细胞爬行面积占比图；如图10、图11所示，zCAFs迁移活性较未辐照CAFs降低。
[0100] 根据半乳糖苷酶实验及划痕实验证实，受18Gy IR辐照的口腔CAFs具有明显的衰老表型和降低的迁移活性。基于此，发明人进一步明确受18Gy IR剂量辐照后的表僵尸型CAFs(zCAFs)存在，具有放射后未死亡、增殖受阻、DNA损伤无法恢复、衰老增加、迁移能力降低的特性。
[0101] 实施例4：检测zCAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响
[0102] 为了探究zCAFs对OSCC细胞耐放射能力的影响，发明人在不同培养条件下对Cal‑27细胞分别进行了克隆形成实验和53BP1免疫荧光染色实验。以未辐照口腔癌相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞进行共培养作为对照组，在第二预设辐照条件下，检测对照组中辐照后的口腔鳞癌细胞的克隆形成率及DNA损伤水平，确定对照组中口腔鳞癌细胞的存活率和DNA损伤的口腔鳞癌细胞比例。
[0103] 具体实验过程如下：
[0104] (1)克隆形成实验：
[0105] 将未辐射的口腔鳞癌细胞以800、1600、3200、6400和10000个/孔的密度分别接种于6孔板中，分别暴露于0、1、2、4和6Gy的电离辐射。在不同的条件下培养，包括常规培养基(Cal‑27+DMEM)、zCAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+zCAFs)、未辐照的NAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+NAFs)、未辐照的CAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+CAFs)；当10‑14天后6孔板中出现肉眼可见克隆形成时终止培养。用10％中性甲醛固定细胞15分钟，用结晶紫染色30分钟。计数含有50个以上细胞的克隆菌落，计算克隆形成率以及存活分数。
[0106] 图12示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞存活的克隆形成实验示意图；图13示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞存活的克隆形成百分比的统计图；如图12、图13所示，与未辐照CAFs相比，zCAFs促进口腔鳞癌细胞辐照后克隆形成的能力减弱。图14示出了本发明实施1Gy、2Gy、4Gy和6Gy梯度辐照后，不同培养条件下口腔鳞癌细胞的存活分数统统计图；如图
14所示，与未辐照CAFs相比，zCAFs促进口腔鳞癌细胞辐照后存活的能力减弱。
14所示，与未辐照CAFs相比，zCAFs促进口腔鳞癌细胞辐照后存活的能力减弱。
[0107] (2)53BP1免疫荧光染色实验：
[0108] 使用X‑ray 160辐照仪(Precision X‑ray(PXi)，美国)对细胞进行X射线辐照，剂量率为1.92Gy/min，参数设置为电压160KV，电流18.70mA，源靶距50cm。辐照时，将孔板放置在X射线源正下方，以避免射线散射。辐照后的细胞在1小时内尽快放回37℃培养箱。定期在倒置相差显微镜(LEICA,德国)下观察辐照细胞的形态学变化，以确认电离辐射生效。
[0109] 将将未辐射的口腔鳞癌细胞以2.5×104个/孔的密度分别接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2饱和度恒温培养箱内培养1‑2天后，更换为不同的培养条件培养，包括常规培养基(Cal‑27+DMEM)、zCAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+zCAFs)、未辐照的NAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+NAFs)、未辐照的CAFs‑Cal27 transwell共培养环境(Co‑Cal‑27+CAFs)；然后暴露于6Gy的电离辐射，分别在辐照24小时和48小时后，对未辐照和辐照后口腔鳞癌细胞进行53BP1免疫荧光染色，检测电离辐射(IR)对口腔鳞癌细胞DNA损伤的影响。染色前使用10％中性甲醛室温下固定细胞15分钟，然后用0.1％Triton X‑100溶液室温下破膜10分钟。一抗为抗53bp1抗体(Abcam，英国，1:250)。二抗为5％BSA稀释的fitc标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，中国，1:100)。核染色均采用DAPI。200×视场图像在德国徕卡荧光倒置显微镜下扫描。53BP1焦点数大于3的细胞百分率在3‑5个随机视野中测定，计算测定的平均值和标准误差。
[0110] 图15示出了本发明实施6Gy IR(口腔鳞癌细胞耐受电离辐射的最大剂量)辐照后，分别于24小时和48小时后进行不同培养条件下的口腔鳞癌细胞53BP1核焦点免疫荧光染色的结果示意图；图16示出了本发明实施6Gy IR(口腔鳞癌细胞耐受电离辐射的最大剂量)辐照后，不同培养条件下的53BP1阳性核焦点大于3的口腔鳞癌细胞(DNA损伤的口腔鳞癌细胞)百分比分析的统计图；如图12、图13所示，与未辐照CAFs相比，zCAFs抑制口腔鳞癌细胞辐照后DNA损伤的能力减弱。
[0111] 统计分析
[0112] 使用GraphPad Prism软件进行统计分析。样本量小于8时，正态性由Shapiro‑Wilk正态性检验确定。数据以均数±标准差表示。两组间的差异采用Student t检验，两组以上的差异采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。双侧P＜0.05被认为有统计学意义。
[0113] 通过本发明实施例研究得出：与未辐照的CAFs相比，zCAFs与OSCC细胞相互作用下，zCAFs促进OSCC癌细胞在IR辐照后存活的的能力减弱、抑制其DNA损伤的作用减弱。因此，以上研究结果表明，高剂量IR诱导的zCAFs增殖受阻、DNA损伤修复无法恢复、处于衰老状态且迁移活性减弱，虽然仍具有一定的促癌作用，但对OSCC耐放射能力的促进作用显著减弱，可作为口腔鳞癌放疗后术后复发或转移的新的防治靶标。
[0114] 以上对本发明所提供的一种口腔癌相关成纤维细胞促癌耐放射能力的研究方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。