一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法转让专利
申请号 : CN202110555902.1
文献号 : CN113633625B
文献日 : 2022-12-09
发明人 : 邹艳 , 师冰洋 , 郑蒙 , 郝明聪 , 孙雅静
申请人 : 河南大学
摘要 :
本发明公开了一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法，涉及药物载体技术领域。其包括内核和外壳，外壳包覆于内核的外周，内核包括ROS响应性载药纳米粒子，ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂，外壳为线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜。该纳米药物借助肿瘤细胞膜的同源靶向性可以跨越BBB并到达肿瘤部位，借助线粒体膜可以同源靶向并进入线粒体，ROS响应性载药纳米粒子在线粒体高水平ROS环境下，内核溶胀降解释放出负载的物质氧化磷酸化抑制剂，从而实现安全高效的靶向药物治疗。通过外壳的包裹，避免了负载药物在血液中半衰期短的缺陷，极大程度上保护了药物在血液中的长循环。
权利要求 :
1.一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其特征在于，其包括内核和外壳，所述外壳包覆于所述内核的外周，所述内核包括ROS响应性载药纳米粒子，所述ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂，所述外壳为线粒体膜与脑胶质瘤细胞膜的混合膜; 所述氧化磷酸化抑制剂为Gboxin; 所述ROS响应性载药纳米粒子为聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）;结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其特征在于，所述聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）中聚（β‑丁内酯）的聚合度为8‑12，聚（β‑丁内酯）
3 3 3
的分子量为2.4×10 ‑3.6×10 ，所述聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）的总分子量4.4×10‑5.6×3
10。
3.根据权利要求1所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其特征在于，所述内核中所述Gboxin的载药量为4.4‑36%。
4.根据权利要求1所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其特征在于，所述线粒体膜与脑胶质瘤细胞膜的混合质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其特征在于，所述内核与所述外壳的质量比为1:1；所述内核的平均粒径为50‑70 nm，所述纳米药物的平均粒径为80‑100 nm。
6.一种如权利要求1‑5任一项所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物的制备方法，其特征在于，其包括：将所述线粒体膜与脑胶质瘤细胞膜的混合膜与所述内核混合以使得所述混合膜包覆在所述内核外周。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备所述内核，所述内核的制备包括将所述氧化磷酸化抑制剂与所述ROS响应性载药纳米粒子混合，超声和/或挤压。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述ROS响应性载药纳米粒子置于溶剂中，加入所述氧化磷酸化抑制剂。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，超声的频率为100‑110 W，36‑38℃下，超声处理8‑10 min。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述挤压是在滤膜下挤压。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述挤压是在孔径为800 nm，400 nm，200 nm滤膜下依次反复7次挤压。
12.一种如权利要求1‑5任一项所述的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物或由权利要求6‑11任一项所述的制备方法制得的纳米药物在制备肿瘤治疗药物或线粒体凋亡激活剂中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述线粒体凋亡抑制剂是促使线粒体膜电位改变的线粒体凋亡抑制剂和/或抑制ATP合酶活性的线粒体凋亡抑制剂。
15.一种用于纳米药物的内核，其特征在于，所述内核包括ROS响应性载药纳米粒子，所述ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂；所述氧化磷酸化抑制剂为Gboxin，所述ROS响应性载药纳米粒子为聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）；结构式如下：。
说明书 :
一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物载体技术领域，具体而言，涉及一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法。
背景技术
[0002] 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是哺乳动物的动力源和能量供应者。除了为细胞供能外，还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程。近年来，靶向线粒体被认为是一种很有前景的肿瘤治疗策略。
[0003] 目前，Gboxin是一种脑胶质瘤（GBM）特异性的针对线粒体的氧化磷酸化抑制剂，作用机理在于：通过Gboxin与线粒体内膜上的ATP合酶结合，从而使得ATP合酶失活，造成ATP合成的减少，此外，Gboxin还能阻断氧化磷酸化过程中的电子传递，导致线粒体的膜电位发生改变，使得线粒体的结构遭到破化，促使线粒体膜间隙中的细胞色素C（Cytochrome C，CytC）加速释放至细胞质中，CytC进一步激活细胞质中的凋亡蛋白家族（Caspase 3及9），最终实现低浓度高效杀死胶质瘤细胞。然而，Gboxin存在血液半衰期非常短的缺陷，这也严重阻碍了其在GBM治疗中的应用。
[0004] 随着生物医学的飞速发展，基于纳米技术的药物递送系统提供了新的思路。与游离抗癌药物相比，纳米粒子具有保护药物免受体内酶降解、促进药物通过多种生物屏障、提高药物溶解度和延长在体内循环时间等优势。与此同时，传统纳米药物作为机体外来物质，极易被体内免疫系统识别、并清除，而且并对肝、肾有一定的潜在性毒副作用，这极大地限制了纳米药物递送系统的发展。
[0005] 鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法以解决上述技术问题。
[0007] 受启发于自然界生态系统，生物膜仿生的概念渐渐从理想假设运用到了实际研究中，即提取各种生物膜包裹在纳米药物的表面形成生物膜仿生纳米药物体系。红细胞膜可避免免疫细胞的吞噬作用，延长体内循环时间。癌细胞膜表面存在特异蛋白与受体（Thomsen，Friedenreich（TF）抗原、上皮细胞钙粘蛋白（E‑cadherin）和包括CD47在内的膜蛋白，阻止免疫系统清除的同时实现同源靶向。免疫细胞能够实现免疫逃逸和炎症部位靶向的同时，还能有效激活肿瘤免疫抑制微环境，通过免疫系统清除癌细胞。细胞系膜也能在实现免疫逃逸，提高生物相容性的同时，具有同源靶向功能。
[0008] 发明人提出，将线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载肿瘤抑制药物，以期在治疗癌症的可行性。
[0009] 本发明是这样实现的：
[0010] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其包括内核和外壳，外壳包覆于内核的外周，内核包括ROS响应性载药纳米粒子，ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂，外壳为线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜。ROS即为Reactive Oxygen Species，活性氧。
[0011] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述氧化磷酸化抑制剂为Gboxin，即为氯化（1‑羧甲基‑2‑乙基‑3‑甲基‑1H‑苯并咪唑‑3‑铵）L‑薄荷醇酯，结构式如下：
[0012] 。
[0013] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述ROS响应性载药纳米粒子为ROS响应性高分子聚合纳米载体；
[0014] 优选地， ROS响应性高分子聚合纳米载体为两嵌段聚合物；
[0015] 优选地，两嵌段聚合物为聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯），结构式如下：
[0016] 。
[0017] 优选地，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）中聚（β‑丁内酯）的聚合度为8‑12，聚（β‑丁内酯）3 3 3 3
的分子量为2.4×10‑3.6×10 ，总分子量4.4×10‑5.6×10 。聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）即为PEG‑PHB。
的分子量为2.4×10‑3.6×10 ，总分子量4.4×10‑5.6×10 。聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）即为PEG‑PHB。
[0018] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述内核中氧化磷酸化抑制剂的载药量为4.4‑36%；
[0019] 优选地，内核中Gboxin的载药量为4.4‑36%。
[0020] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述肿瘤细胞膜来源于脑胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞；
[0021] 优选地，线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合质量比为1:1。
[0022] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述内核与外壳的质量比为；内核的平均粒径为50‑70 nm，纳米药物的平均粒径为80‑100 nm。
[0023] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物的制备方法，其包括：将线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜与内核混合以使得混合膜包覆在内核外周。
[0024] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括制备内核，内核的制备包括将氧化磷酸化抑制剂与ROS响应性载药纳米粒子混合，超声和/或挤压；
[0025] 优选地，将ROS响应性载药纳米粒子置于溶剂中，加入氧化磷酸化抑制剂。超声的频率为100‑110 W，36‑38℃下，超声处理8‑10 分钟（min）。
[0026] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述挤压是在滤膜下挤压，优选地，挤压是在孔径为800 nm，400 nm，200 nm滤膜下依次反复挤压7次。
[0027] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物或由上述制备方法制得的纳米药物在制备肿瘤治疗药物或线粒体凋亡激活剂中的应用；
[0028] 优选地，肿瘤为脑胶质瘤。
[0029] 优选地，线粒体凋亡抑制剂是促使线粒体膜电位改变的线粒体凋亡抑制剂和/或抑制ATP合酶活性的线粒体凋亡抑制剂。
[0030] 本发明还提供了一种用于纳米药物的内核，内核包括ROS响应性载药纳米粒子，ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂；优选地，氧化磷酸化抑制剂为Gboxin。
[0031] 本发明具有以下有益效果：
[0032] 本发明提供的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物为仿生靶向纳米药物，该纳米药物借助肿瘤细胞膜的同源靶向性可以跨越BBB并到达肿瘤部位，借助线粒体膜可以同源靶向并进入线粒体，ROS响应性载药纳米粒子在线粒体高水平ROS环境下，内核溶胀降解，释放出负载的物质氧化磷酸化抑制剂，从而实现安全高效的靶向药物治疗。该纳米药物通过外壳的包裹，避免了负载药物在血液中半衰期短的缺陷，有利的保护了药物在血液中的长循环。
[0033] 肿瘤细胞膜表面存在特异蛋白与受体（Thomsen，Friedenreich（TF）抗原、上皮细胞钙粘蛋白（E‑cadherin）和包括CD47在内的膜蛋白，在阻止免疫系统清除的同时还实现了同源靶向。即肿瘤细胞膜能够实现免疫逃逸和炎症部位靶向的同时，还能有效激活肿瘤免疫抑制微环境，通过免疫系统清除癌细胞。线粒体膜也能在实现免疫逃逸，提高生物相容性的同时，具有同源靶向功能。
[0034] 由上述纳米药物制备的线粒体凋亡激活剂可通过激活线粒体凋亡通路杀死肿瘤细胞，达到肿瘤细胞安全高效的化疗。
附图说明
[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0036] 图1为当氧化磷酸化抑制剂为Gboxin时的纳米药物的制备、在肿瘤部位积累、在细胞内释放以及药效发挥的示意图；
[0037] 图2为PEG‑PHB的合成示意图；
[0038] 图3为线粒体‑肿瘤细胞混合膜纳米囊泡制备示意图；
[0039] 图4为HM‑NPs@G制备示意图；
[0040] 图5为PEG‑PHB结构表征NMR结果图；
[0041] 图6为线粒体‑肿瘤细胞混合膜的荧光共聚焦（CLSM）图片；
[0042] 图7为纳米药物的粒径分布和结构以及载药量；
[0043] 图8为体外释放实验结果；
[0044] 图9为流式细胞图和激光共聚焦显微镜图；
[0045] 图10为细胞毒性实验结果图；
[0046] 图11为细胞内ATP活性检测实验结果图；
[0047] 图12为HM‑NPs@G等不同纳米药物处理的U87MG细胞内线粒体膜电位；
[0048] 图13为HM‑NPs@G等不同纳米药物处理的U87MG细胞内细胞色素C及凋亡相关蛋白的表达含量；
[0049] 图14为体内药代药代学研究结果；
[0050] 图15为HM‑NPs@G等不同纳米药物对于荷瘤小鼠的体内治疗效果；
[0051] 图16为HM‑NPs@G等不同纳米药物给药时小鼠各器官的H&E染色图；
[0052] 图17为HM‑NPs@DiR等不同纳米药物在小鼠体内不同时间点的荧光强度。
具体实施方式
[0053] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0054] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物，其包括内核和外壳，所述外壳包覆于所述内核的外周，内核包括ROS响应性载药纳米粒子，ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂，外壳为线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜。
[0055] 内核与外壳通过物理挤压和/或超声的方式实现外壳对内核的负载。外壳包覆于内核的外周，通过外壳中的线粒体膜与肿瘤细胞膜分别实现同源靶向线粒体和同源靶向肿瘤细胞。
[0056] 本发明利用肿瘤细胞内的ROS水平显著高于正常细胞和组织，以及线粒体为肿瘤细胞内ROS水平最高的部位，特设置ROS响应性载药纳米粒子负载氧化磷酸化抑制剂制备内核，这样有利于在高ROS水平的刺激下响应释放负载的药物。
[0057] 肿瘤细胞膜的来源可以是肺癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病等多种肿瘤。
[0058] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述氧化磷酸化抑制剂为Gboxin，即为氯化（1‑羧甲基‑2‑乙基‑3‑甲基‑1H‑苯并咪唑‑3‑铵）L‑薄荷醇酯，其结构式如下：
[0059] 。
[0060] 在其他实施方式中，上述内核可以负载任何抑制线粒体功能激活肿瘤细胞凋亡的药物。
[0061] 图1中示出了当氧化磷酸化抑制剂为Gboxin时的纳米药物的制备、在肿瘤部位积累、在细胞内释放以及药效发挥的示意图，（a）为提取肿瘤细胞膜及线粒体膜并通过超声及物理挤压的方式形成杂膜（HM），与此同时，ROS响应性纳米粒子（PEG‑PHB）通过自组装法包载Gboxin，再与HM混合后通过挤压法得到HM‑NPs@G; （b）纳米药物经长循环，利用肿瘤细胞的同源靶向性跨越BBB并到达肿瘤部位；纳米药物被肿瘤细胞靶向摄取后，再利用线粒体膜的同源靶向性靶向并进入线粒体，PEG‑PHB在线粒体高水平ROS环境下，纳米粒溶胀降解，释放出Gboxin，Gboxin通过激活线粒体凋亡通路杀死肿瘤细胞，达到人脑胶质瘤安全高效的化疗。
[0062] Gboxin通过与线粒体中ATP合酶结合并使其失活，减少ATP合成的同时还能阻断氧化磷酸化过程中的电子传递，于是线粒体膜电位改变，导致线粒体结构破化，促使线粒体膜间隙中的细胞色素C（Cytochrome C，CytC）加速释放释放至细胞质，CytC进一步激活细胞质中的凋亡蛋白家族（Caspase 3和9），最终杀死胶质瘤细胞。该智能生物膜仿生纳米药物通过上述反应机理可以安全高效地杀死胶质瘤细胞，有望成功治愈GBM。
[0063] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述ROS响应性载药纳米粒子为ROS响应性高分子聚合纳米载体；
[0064] 优选地， ROS响应性高分子聚合纳米载体为两嵌段聚合物。
[0065] 需要说明的是，在其他实施方式中，上述的ROS响应性载药纳米粒子并不限于两嵌段聚合物，例如可以是三嵌段聚合物，只要具有ROS响应性嵌段的聚合物均可行。
[0066] 优选地，两嵌段聚合物为聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）；
[0067] 优选地，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）中聚（β‑丁内酯）的聚合度为8‑12，聚（β‑丁内酯）3 3 3 3
的分子量为2.4×10‑3.6×10 ，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）的总分子量4.4×10‑5.6×10 。
聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）即为PEG‑PHB。
的分子量为2.4×10‑3.6×10 ，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）的总分子量4.4×10‑5.6×10 。
聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）即为PEG‑PHB。
[0068] 优选地，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）中聚（β‑丁内酯）的聚合度为11，聚（β‑丁内酯）的3 3
分子量为3.3×10，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）的总分子量5.3×10。
分子量为3.3×10，聚乙二醇‑聚（β‑丁内酯）的总分子量5.3×10。
[0069] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述内核中所述氧化磷酸化抑制剂的载药量为4.4‑36%。例如可以是10%，11%，12%，15%，18%，20%，25%，30%。
[0070] 优选地，内核中Gboxin的载药量为4.4‑36%。例如可以是10%，11%，12%，15%，18%，20%，25%，30%，36%。发明人发现，当投药量为10%，20%，30%时，其包封率分别为41.5%，70.4%，
44.9%。
44.9%。
[0071] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述肿瘤细胞膜来源于脑胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞；
[0072] 优选地，线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合质量比为1:1。当混合质量比为1：1时杂膜效果最优。
[0073] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述内核与外壳的质量比为1:1；内核的平均粒径为50‑70 nm，纳米药物的平均粒径为80‑100 nm。
[0074] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物的制备方法，其包括：将线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜与内核混合以使得混合膜包覆在内核外周。可采用超声和/或挤压的方式实现混合膜对内核的包覆。超声的频率为100‑110 W，36‑38℃下，超声处理8‑10 min。
[0075] 在一种实施方式中，上述将线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合膜与内核混合后，先进行超声处理（例如超声处理1‑10 min），然后在800 nm，400 nm，200 nm滤膜下依次反复挤压7次。
[0076] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括制备内核，内核的制备包括将氧化磷酸化抑制剂与ROS响应性载药纳米粒子混合；优选地，将ROS响应性载药纳米粒子置于溶剂中，加入氧化磷酸化抑制剂。上述溶剂可以是四氢呋喃，也可以是DMSO等溶剂，其中四氢呋喃的粒径更优。
[0077] 在一种实施方式中，上述内核的制备包括将线粒体膜与肿瘤细胞膜的混合后，冰浴超声2 min，然后在800 nm，400 nm，200 nm滤膜下反复挤压，最终通过离心（4℃，21,000 × g，30 min）得到线粒体‑肿瘤细胞混合膜。需要说明的是，上述的混合工艺仅为发明人列举的其中一种的制备工艺参数，在实际应用中，还可根据需要自适应调整制备时的时间以及所选择的滤膜的种类。
[0078] 本发明提供了一种线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物或由上述制备方法制得的纳米药物在制备肿瘤治疗药物或线粒体凋亡激活剂中的应用；优选地，肿瘤为脑胶质瘤。
[0079] 需要说明的是，上述肿瘤治疗药物的制备应用，包括不限于肿瘤的病灶消除、肿瘤范围变小、抗肿瘤、肿瘤耐药性治疗等效果。
[0080] 本发明提供了一种线粒体凋亡抑制剂，其包括线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物或由上述的制备方法制得的纳米药物；
[0081] 优选地，线粒体凋亡抑制剂是促使线粒体膜电位改变的线粒体凋亡抑制剂和/或抑制ATP合酶活性的线粒体凋亡抑制剂。
[0082] 本发明还提供了一种用于纳米药物的内核，内核包括ROS响应性载药纳米粒子，ROS响应性载药纳米粒子所载药物为氧化磷酸化抑制剂；优选地，氧化磷酸化抑制剂为Gboxin。
[0083] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0084] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0085] 实施例1
[0086] 本实施例提供了一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法。
[0087] 制备方法如下：
[0088] （1）合成4‑（4，4，5，5‑四甲基‑1，3，2‑二氧杂戊硼烷‑2‑基）丙烯酸苄酯（HB）。
[0089] 首先，将4‑（羟甲基）苯硼酸频哪醇酯溶解于干燥的二氯甲烷中，转移至三颈烧瓶内，再加入一定量的三乙胺。在冰浴条件下，溶解于无水二氯甲烷的甲基丙烯酰氯通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到三颈烧瓶中。滴加完毕后，在室温条件下继续搅拌反应10小时（h）。过滤除去不溶的反应产物，将滤液先通过旋蒸缩小二氯甲烷的体积，再用乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤三次。硫酸镁干燥过夜后，用石油醚和乙酸乙酯（体积比=30：1）对有机溶液进行硅胶柱层析浓缩纯化。
[0090] （2）合成甲基化聚乙二醇‑二硫代萘甲酸‑（4‑氰基）戊酸酯（PEG‑CPADN）。
[0091] 在三颈圆底烧瓶中，将CPADN溶解于干燥的四氢呋喃，随后加入催化剂N‑羟基丁二酰亚胺（NHS）。在0℃条件下，通过恒压漏斗将N，N’‑二环己基碳二亚胺（DCC）的四氢呋喃溶液缓慢滴加到三颈烧瓶内。滴加完毕后，在室温条件下继续反应24 h，加入三乙胺终止反应。接着，加入甲基化聚乙二醇，继续搅拌反应12 h。反应结束后，过滤，旋蒸，冰乙醚沉淀洗涤三次，真空干燥过夜，得到粉红色的固体产物。
[0092] （3）合成ROS响应性的聚合物PEG‑PHB（即为ROS响应性载药纳米粒子）。
[0093] 聚合物PEG‑PHB的制备是通过可逆加成断裂链转移聚合法（RAFT）获得（如图2所示）。具体步骤如下：在氮气保护下，将HB单体、PEG‑CPADN、引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）和1，4‑二氧六环加入到Schlenk真空密封瓶中，在65℃条件下，反应48 h。通过透析除去多余的HB单体及其他未反应的试剂。
[0094] （4）制备线粒体‑肿瘤细胞混合膜纳米囊泡（HM）。
[0095] 制备肿瘤细胞膜：肿瘤细胞膜是通过膜蛋白提取试剂盒获得的。将1毫升（mL）添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至收集好的2,000‑5,000脑胶质瘤细胞（U87MG）中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10‑15 min。4℃，700 × g离心10 min，小心收集上清液至一新的离心管中。随后，4℃，14,000 × g离心30 min，以沉淀所要的肿瘤细胞膜碎片（CM）。
[0096] 线粒体膜则是通过线粒体分离试剂盒获得的。加入1‑2.5 mL添加了PMSF的线粒体分离试剂至2,000‑5,000万U87MG细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置15 min。把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆20下左右。把细胞匀浆在600 × g，4℃离心10 min。小心把上清转移到另一离心管中，在11,000 × g，4℃离心10 min。小心去除上清。沉淀即为分离得到的细胞线粒体。再加入150‑200微升（μL）临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体，通过超高速离心获得线粒体膜（MM）。
[0097] 将CM与MM按蛋白质量比为1：1混合后，冰浴超声2 min，然后在800 nm，400 nm，200 nm滤膜下反复挤压，最终通过离心（4℃，21,000 × g，30 min）得到线粒体‑肿瘤细胞混合膜纳米囊泡（如图3所示）。
[0098] （5）制备线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物。
[0099] ROS响应性纳米粒子的形成及药物Gboxin装载：将PEG‑PHB溶于四氢呋喃中，加入相应理论载药量的Gboxin，透析除去游离药物，最终得到载药的ROS响应性载药纳米粒子（NPs@G）。通过高效液相色谱（HPLC）来检测Gboxin的载药效率（DLE）和载药量（DLC）。
[0100] 将NPs@G与HM按比例混合后，在400 nm，200 nm滤膜下反复挤压7次最终得到HM‑NPs@G（如图 4所示），其粒径、粒径分布和结构可由DLS、TEM测定。
[0101] 实验例1
[0102] 本实验例对实施例1制备合成的HB、PEG‑CPADN、PEG‑PHB进行结构表征。图5为结构1
表征NMR结果图。（a）HB合成的H‑NMR（CDCl3），以4‑羟甲基苯基硼酸酯和甲基丙烯酰氯为原
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料，合成了ROS敏感的HB单体，产率为80%;（b）PEG‑CPADN合成的H‑NMR（CDCl3），RAFT活化并
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与PEG‑NH2室温反应生成PEG‑CPADN，其接枝率为100%;（c）PEG‑PHB合成的 H‑NMR（DMSO），PEG‑CPADN与HB单体通过RAFT反应合成得到聚合物纳米载体PEG‑PHB，PHB的聚合度约为11，聚合分子量为3.3k，PEG‑PHB的总分子量5.3k，其聚合度可通过核磁结果的特征峰的面积计算得到。
表征NMR结果图。（a）HB合成的H‑NMR（CDCl3），以4‑羟甲基苯基硼酸酯和甲基丙烯酰氯为原
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料，合成了ROS敏感的HB单体，产率为80%;（b）PEG‑CPADN合成的H‑NMR（CDCl3），RAFT活化并
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与PEG‑NH2室温反应生成PEG‑CPADN，其接枝率为100%;（c）PEG‑PHB合成的 H‑NMR（DMSO），PEG‑CPADN与HB单体通过RAFT反应合成得到聚合物纳米载体PEG‑PHB，PHB的聚合度约为11，聚合分子量为3.3k，PEG‑PHB的总分子量5.3k，其聚合度可通过核磁结果的特征峰的面积计算得到。
[0103] 实验例2
[0104] 本实验例采用荧光共振能量转移技术（FRET）来验证混合膜纳米囊泡，参照图6所示，标尺=10 μm，线粒体膜（MM）染DiI红色荧光，肿瘤细胞膜（CM）染DiR绿色荧光，通过共聚焦观察发现重叠呈现出黄色，证明成功制备出线粒体‑肿瘤细胞杂膜纳米囊泡。
[0105] 实验例3
[0106] 本实验例对实施例1制备的线粒体‑肿瘤细胞混合膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物通过高效液相色谱（HPLC）来检测Gboxin的载药效率（DLE）和载药量（DLC），由DLS、TEM测定纳米药物的粒径分布和结构。
[0107] 实验结果参照图7所示，图7中，（a）为NPs@G和HM‑NPs@G的粒径;（b）为NPs，NPs@G和HM‑NPs@G的Zeta表面电位;（c）为纳米粒子的载药量和载药效率。PEG‑PHB在水溶液中可自组装形成稳定的纳米粒子，粒径为63.9 nm，包裹杂膜后粒径为89.1 nm（图7a），电位由+5 mV变化为‑30mV（图7b），由DLS测试可知，纳米粒径分布均一。由HPLC测得（图7c），在Gboxin的理论载药量为10%，20%，30%时，其包封率分别为41.5%，70.4%，44.9%。
[0108] 实验例4
[0109] 本实验例进行体外药物释放实验。实验步骤如下：将纳米药物孵育在（模拟）肿瘤细胞线粒体高水平ROS（ H2O2,100 μM，1 mM）的环境下，由DLS实时跟踪粒子的数量、粒径及粒径分布。体外释放实验在37℃条件下进行，将600 μL的HM‑NPs@G在25 mL的PBS或含有H2O2缓冲溶液中透析。在设定的时间点，取出5 mL释放介质并补添相同量的新鲜介质。释放介质中Gboxin的量通过HPLC测定。释放结果为三个平行样平均值。
[0110] 体外释放实验结果参照图8所示，（图8a）为HM‑NPs@G在不同浓度H2O2条件下Gboxin的释放情况，在37℃未加H2O2的磷酸缓冲液PBS中（pH 7.4），Gboxin的释放量较低，而在添加100 μM及1 mM H2O2释放条件下，48 h Gboxin的释放量明显增多，这是纳米粒子在氧化性条件下溶胀致使药物释放。此外，（图8b）为HM‑NPs@G在不同浓度H2O2条件下粒径和PDI，相比于未加H2O2组纳米粒子，在H2O2介质中孵育的HM‑NPs@G的粒径及PDI显著增大。这意味着HM‑NPs@G同时解决了传统生物可降解纳米药物的泄露和细胞内释放缓慢两大难题。
[0111] 实验例5
[0112] 本实验例通过流式细胞仪及共聚焦显微镜表征细胞内吞和细胞内释放。
[0113] 在流式细胞仪测试中，将U87MG细胞种在6孔细胞培养板内（1×106细胞/孔），在37 ℃培养24 h后，加入500 μL的HM‑NPs@Cy5，MM‑NPs@Cy5，CM‑NPs@Cy5，NPs@Cy5，or游离 Cy5的PBS溶液（Cy5浓度为10 μg/mL），孵育6 h，吸走样品，用500 μL胰酶消化细胞。得到的细胞悬浮液在1，000 × g离心3 min，用PBS洗两次，再次分散在500 μL PBS，1 h内进行流式细胞仪（BD FACS Calibur，Becton Dickinson， USA）测试，用Cell Quest软件圈取10,000个细胞获得。
[0114] 流式细胞实验（图9a）结果证明，HM‑NPs仿生纳米药物具有较高的细胞内吞效率，其细胞内吞效率是非包膜对照组NPs的2倍。
[0115] 细胞内吞及细胞内药物释放行为通过CLSM照片观察得到。将U87MG细胞铺于含显5
微镜载玻片的24孔细胞培养板里（1×10 细胞/孔）培养24 h后，加入50 μL的HM‑NPs@FITC，MM‑NPs@FITC，CM‑NPs@FITC，或NPs@FITC的PBS溶液（FITC浓度为10 μg/mL）。孵育6 h后，将培养基移除用PBS清洗两遍。用Hoechst33342（10 μg/mL）染细胞核10 min后清洗两次。荧光图片由CLSM（Zeiss LSM800）拍摄获得。
微镜载玻片的24孔细胞培养板里（1×10 细胞/孔）培养24 h后，加入50 μL的HM‑NPs@FITC，MM‑NPs@FITC，CM‑NPs@FITC，或NPs@FITC的PBS溶液（FITC浓度为10 μg/mL）。孵育6 h后，将培养基移除用PBS清洗两遍。用Hoechst33342（10 μg/mL）染细胞核10 min后清洗两次。荧光图片由CLSM（Zeiss LSM800）拍摄获得。
[0116] CLSM（图9b）观察到HM‑NPs仿生纳米药物孵育6 h后，U87‑MG细胞内有更强的FITC的荧光，这证实了HM‑NP具有较强的肿瘤细胞特异性同源靶向能力，并有效转运进入肿瘤细胞。
[0117] 实验例6
[0118] 本实验例进行细胞毒性实验。
[0119] U87MG或CSC‑2细胞铺在96孔板内（1×103细胞/孔），24 h后，培养基吸走，换上90 μL新鲜培养基和10 μL的不载Gboxin的空纳米粒子（HM‑NPs），孵育96 h后，加入10 μL的CCK‑8溶液（5 mg/mL）孵育40 min后，酶标仪测定各孔在450 nm的吸收，以加了CCK‑8的培养基孔为零点。每个实验数据平行做四组（n = 4）。
[0120] U87MG或CSC‑2细胞铺在96孔板内（1×103 细胞/孔），24 h后，培养基吸走，换上90 μL新鲜培养基和10 μL的负载Gboxin的纳米药物HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，NPs@G及自由Gboxin，使Gboxin的最终浓度为800 nM。孵育96 h后，加入10 μL的CCK‑8溶液（5 mg/mL）孵育40 min后，酶标仪测定各孔在450 nm的吸收，以加了CCK‑8的培养基孔为零点。每个实验数据平行做四组（n = 4）。
[0121] 结果可知，即使当HM‑NPs仿生纳米材料浓度高达0.8 mg/mL时，对U87MG和CSC2细胞仍然无毒，证实了HM‑NPs仿生纳米药物良好的生物相容性。和我们期望的一样，相比于其他对照组，HM‑NPs@G对U87‑MG及CSC‑2细胞表现出最为显著的抗肿瘤活性（图10为HM‑NPs@G等不同纳米药物对U87MG及CSC‑2细胞的杀伤效果（Gboxin浓度=800 nM））。
[0122] 实验例7
[0123] 进行细胞内ATP活性检测实验。
[0124] 将U87MG或CSC2细胞种在24孔板中（1 × 105个细胞/孔）并过夜培养。随后，加入50 μL HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，NPs@G和自由Gboxin，使Gboxin的最终浓度为800 nM。继续培养96h后，1 × PBS洗两遍并用ATP裂解液裂解细胞，裂解后4℃，12,000 × g离心5 min，取上清。然后与ATP检测工作液结合，利用酶标仪及标准曲线确定细胞裂解液中的ATP。
[0125] 值得注意的是，Gboxin是一种ATP合酶抑制剂，可以抑制ATP合酶的活性，使得ATP合成过程被阻断，导致ATP的合成量减少。图11结果显示，在U87MG及CSC2细胞中，相比于其他对照组，HM‑NPs@G组ATP量减少最为显著。该结果也为该仿生纳米药物确实可以通过减少ATP的合成来杀死肿瘤细胞提供了证据。
[0126] 实验例8
[0127] 进行线粒体膜电位检测。
[0128] 用荧光探针JC‑1测定肿瘤细胞内线粒体膜电位变化。将U87MG细胞种于12孔板底5
的玻璃爬片上，接种密度为1 × 10个细胞每孔，培养过夜。随后，加入50 μL HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，NPs@G和自由Gboxin，使Gboxin的最终浓度为800 nM。继续培养96 h后加入200 μL的JC‑1染色工作缓冲液，37℃环境下孵育20 min，将染色工作缓冲液吸除，再用预冷的JC‑1清洗缓冲液（1 ×）反复洗涤三次。加入4%的多聚甲醛固定15 min，1× PBS洗涤两次，随后加入细胞核染色溶液Hoechst33342（10 μg/mL），孵育10min，1 × PBS洗涤两次。
用镊子将细胞爬片从12孔板中取出，倒扣于如涂抗淬灭封片剂的载玻片上，晾干后即可用于共聚焦显微镜成像观察。
的玻璃爬片上，接种密度为1 × 10个细胞每孔，培养过夜。随后，加入50 μL HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，NPs@G和自由Gboxin，使Gboxin的最终浓度为800 nM。继续培养96 h后加入200 μL的JC‑1染色工作缓冲液，37℃环境下孵育20 min，将染色工作缓冲液吸除，再用预冷的JC‑1清洗缓冲液（1 ×）反复洗涤三次。加入4%的多聚甲醛固定15 min，1× PBS洗涤两次，随后加入细胞核染色溶液Hoechst33342（10 μg/mL），孵育10min，1 × PBS洗涤两次。
用镊子将细胞爬片从12孔板中取出，倒扣于如涂抗淬灭封片剂的载玻片上，晾干后即可用于共聚焦显微镜成像观察。
[0129] ATP合酶失活不仅会导致ATP合成量的减少，同时还会造成线粒体膜电位的降低。通过JC‑1线粒体膜电位探针测定线粒体膜电位的改变，JC‑1在正常线粒体膜电位较高时，以多聚体的形式存在，呈现出红色荧光，而当膜电位降低时，JC‑1则变成以单体形式存在，发出绿色荧光。从CLSM结果（图12）可以清晰地看出，HM‑NPs@G处理的U87MG细胞的绿色荧光最强，表明线粒体膜电位被显著降低。
[0130] 实验例9
[0131] 蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）检测蛋白含量
[0132] 将U87MG细胞接种于6孔板中，每孔2 × 105个细胞并孵育24 h。然后，分别加入200 μL HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，NPs@G和自由Gboxin，使Gboxin的最终浓度为800 nM，未经处理的细胞作为对照。在细胞培养箱中孵育96h后，吸去含有纳米粒子的培养液，并用1 × PBS缓冲液洗涤3次，随后胰酶消化并收集细胞。采用含有1 mM PMSF的RIPA（强）细胞裂解液（Beyotime，中国）裂解收集的细胞，然后用BCA蛋白浓度检测试剂盒（Beyotime，中国）检测各组蛋白浓度，确定蛋白上样体积大小。通过电泳（SDS聚丙烯酰胺凝胶）分离裂解物，并将其转移到PDVF膜上（Beyotime，中国）。将PDVF膜分别与抗Caspase‑3/9，Cleaved caspase‑3/9，细胞色素C的一抗（cell signaling technology，9662s，9502s，9664s）（Abcam，ab133504），4℃孵育过夜。IRDye800CW二抗孵育1 h，显示蛋白条带（Licor，USA）。使用Image J软件分析蛋白质条带。本实验以β‑Actin作为内参。
[0133] 线粒体膜电位的降低可以促进细胞色素C至细胞质中，细胞色素C转运到细胞质中可以激发级联的半胱天冬酶反应，激活凋亡蛋白家族Caspase 3及Caspase 9。细胞色素C和凋亡蛋白家族均是肿瘤细胞凋亡的重要指标。图13的western blotting结果显示，HM‑NPs@G组细胞中细胞色素C的表达量最高，相对应地，Caspase 3，Caspase 9，Cleaved caspase‑9和Cleaved caspase‑3的表达也显著升高。这些结果进一步说明细胞凋亡受线粒体固有凋亡通路调控。综上所述，HM‑NPs@G可以将更多的Gboxin递送到线粒体靶位点，从而显著降低线粒体膜电位，显著激活肿瘤细胞的凋亡。
[0134] 实验例10
[0135] 药代动力学研究实验。
[0136] 在体内药代动力学研究中，6‑8周BALB/c小鼠随机分组（每组平行3只），由尾静脉注射200 µL的HM‑NPs@G，MM‑NPs@G，CM‑NPs@G或free Gboxin （Gboxin剂量为5 mg/kg），在预定时间点眼眶取血。血样经有机溶剂萃取分离出药物，并通过HPLC定量。由软件拟合可计算得到药物在体内的消除半衰期（t1/2, β）、药物浓度‑时间曲线下面积（AUC）、清除率（CL）等药代动力参数，并逐一与无线粒体‑肿瘤细胞膜包裹的纳米药物进行比较，可以断定仿生纳米药物的血液稳定性。
[0137] 体内药代药代学研究结果表明（图14），HM‑NPs@G仿生纳米药物在体内的循环时间较长，长于NPs@G，更长于自由的Gboxin，说明细胞膜修饰的纳米粒子的生物相容性较好。
[0138] 实验例11
[0139] 体内抗肿瘤效果。
[0140] U87MG脑胶质瘤原位模型的建立是在BALB/c裸鼠（18‑20 g，6‑8周龄）脑部移植肿5 5 6
瘤组织。以平均生物荧光强度为给药单位，在1 × 10‑5 × 10用于治疗实验，1 × 10 ‑5
6
× 10用于生物分布实验。
瘤组织。以平均生物荧光强度为给药单位，在1 × 10‑5 × 10用于治疗实验，1 × 10 ‑5
6
× 10用于生物分布实验。
[0141] 以荧光素酶标记的人脑胶质瘤细胞（U87MG‑Luc）建立原位模型，通过尾静脉注射方式多剂量给药，由IVIS III定性及定量跟踪肿瘤生长情况。在治疗过程中，通过肿瘤生物荧光强度、小鼠体重变化及生存率来评估纳米药物的系统毒副作用及抗肿瘤活性。治疗结束后，由H&E和TUNEL等组织学染色方法分析纳米药物治疗后小鼠各正常器官健康状况及肿瘤组织凋亡情况。通过治疗实验，我们可以断定线粒体‑肿瘤细胞杂膜包裹的纳米药物对荷U87MG‑Luc裸鼠的系统毒性及抗肿瘤活性。
[0142] HM‑NPs@G在荷U87MG‑luc的BALB/C裸鼠中的治疗实验结果显示，在经过五次尾静脉给药（3 mg/kg）之后，表现出最优的抗胶质瘤效果，能显著抑制肿瘤增长，在治疗周期22天内存活率为100%（图15a，b）。生物发光定量结果也同样证明HM‑NPs@G对肿瘤生长的抑制显著优于其他对照组（图15c）。此外，Kaplan‑Meier生存曲线（图15e）显示HM‑NPs@G极大地延长了小鼠的寿命，中位生存期为63天，显著长于MM‑NPs@G，CM‑NPs@G，自由Gboxin和PBS。体内Western Blot结果（图15f）也证明了HM‑NPs@G可以通过促使细胞色素C释放，激活凋亡蛋白家族，有效促使肿瘤细胞凋亡。TUNEL结果（图15g）也证实了HM‑NPs@G可以有效凋亡GBM细胞。
[0143] 图16h显示Cleaved caspase 3 （cc3）凋亡蛋白表达量增多，表明HM‑NPs@G可以有效促进肿瘤细胞凋亡；而Ki67为增殖因子，图16h显示Ki67表达量减少，证明HM‑NPs@G可以有效抑制增殖。
[0144] 由H&E染色的组织学分析结果证明，HM‑NPs@G在5 mg Gboxin/kg剂量给药时，对心、肝、脾、肺、肾在内的主要器官危害很小（图16 i）。结果说明HM‑NPs@G具有极低的系统毒性。
[0145] 实验例12
[0146] BBB跨越作用及靶向性。
[0147] 我们用近红外染料DiR代替Gboxin自组装形成纳米粒子，通过尾静脉注射纳米药物至荷原位人脑胶质瘤U87MG裸鼠体内，由小动物成像仪（IVIS III）跟踪纳米药物在体内不同时间点的分布情况，并重点考察在脑肿瘤部位的积累及滞留，通过与无包膜对照组及单膜包裹组进行定性及定量比较，考察BBB跨越效率及纳米药物肿瘤靶向能力。
[0148] 由小动物成像仪（IVIS III）跟踪纳米药物在体内不同时间点的分布情况的结果（图17）表明，HM‑NPs的荧光强度明显高于对照组，说明其具有很好的同源靶向肿瘤的能力。
[0149] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。