功能性自组装纳米多肽水凝胶、制备方法、用途和制剂

摘要

本发明公开了功能性自组装纳米多肽水凝胶、制备方法、用途和制剂，功能性自组装纳米多肽水凝胶包含与Ca2+结合的结合肽和响应凝血因子13的交联肽，其中，所述结合肽和交联肽的摩尔比为1:1‑10:1；本发明由交联肽(CRP)和结合肽(CBP)自组装形成纳米纤维，在Ca2+驱动下进行第二阶段自组装编织成网状网络形成NBA，NBA可以迅速有效地止住大鼠肝划伤模型的出血，同时有效减少伤口周围的炎症，促进伤口愈合。

权利要求

2+

1.一种功能性自组装纳米多肽水凝胶，其特征在于，包含与Ca 结合的结合肽和响应凝血因子13的交联肽，其中，所述结合肽和交联肽的摩尔比为3:1；所述交联肽的序列为：(RADA)4‑GGQQLK，所述结合肽的序列为：(RADA)4‑GSVLGYIQIR。

2.制备权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将(RADA)4‑GGQLK交联肽和(RADA)4‑GSVLGYIQIR结合肽按3：1质量比溶解混合成多肽混合溶液，通过超声处理使多肽完全溶解并混合均匀，然后在室温下诱发多肽混合溶液自组装形成水凝胶。

3.权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶在制备组织工程材料中的用途。

4.权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组织工程材料是人工血管组织材料。

5.一种人工血管，其特征在于，所述人工血管通过将来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞在权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶中进行三维培养而获得，所述离体血管内皮细胞取自哺乳动物的肺、皮肤、大动脉血管或脐血管。

6.一种功能性自组装纳米多肽制剂，其特征在于，所述功能性自组装纳米多肽制剂包括权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽；

2+

所述功能性自组装纳米多肽为：包含与Ca 结合的结合肽和响应凝血因子13的交联肽，其中，所述结合肽和交联肽的摩尔比为3:1；所述交联肽的序列为：(RADA)4‑GGQQLK，所述结合肽的序列为：(RADA)4‑GSVLGYIQIR。

7.根据权利要求6所述的一种功能性自组装纳米多肽制剂，其特征在于，所述功能性自组装纳米多肽制剂的剂型包括粉剂或液体制剂，所述功能性自组装纳米多肽制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽制剂或权利要求6或7所述的功能性自组装纳米多肽制剂的应用：制备止血材料。

说明书

功能性自组装纳米多肽水凝胶、制备方法、用途和制剂

技术领域

[0001] 本发明属于血管组织工程领域，尤其涉及功能性自组装纳米多肽水凝胶、制备方法、用途和制剂。

背景技术

[0002] 据估计，全世界每年有580万人死于严重创伤，相当于每天近16000人死亡。根据世界卫生组织(WHO)的统计，道路交通事故、自杀、凶杀和战争是造成创伤的主要原因，在这些情况下，肝脏是最常受损伤的内脏器官，造成至少10％的致命性。不受控制和创伤后大量肝出血仍然是主要和潜在可预防的致死性原因，即使及时抢救，这些患者也会遭受危及生命的凝血病。无论是战场上还是日常救援，快速有效的止血是肝外伤应急的核心原则。此外，出血不可避免地发生在常见的肝脏手术中，包括部分肝脏切除和肝脏移植等，与术后效果密切相关。虽然目前临床上已经做了大量努力来处理和防止肝手术中的过度失血，但手术并发出血对个体患者仍然可能发生，特别是那些经历肝脏大面积表面切除的患者。更重要的是，机体自身的血液凝结不能及时停止出血以防止大量持续失血，因此，使用止血剂及时地止血对于涉及肝脏的创伤急救和外科手术都是有意义的。

[0003] 为此，出现了两大类止血材料：1)Combat Gauze、QuikClot和WoundStat，和2)以聚合物材料为代表的无机材料，HemCon和Celox等。无机材料通常促进血块的形成，并催化从纤维素到纤维蛋白的转化，获得很好的止血效果。聚合物止血材料始终作为物理屏障，具有防止出血的功能。虽然这两种材料在涉及肝脏的创伤急救和外科手术中的止血取得了许多成功，但是在快速和有效控制出血方面仍然存在重大挑战，尤其是无法按压止血的穿孔伤口和无法缝合的大伤口。此外，商业止血剂经常存在副作用，包括无机产品体外反应的二次损伤和聚合物产品降解产生的生物毒性。因此，开发无副作用的生物相容止血材料迫在眉睫。

[0004] 为了解决这些问题，自组装肽水凝胶作为止血材料具有独特地优势，因为它们具有内在的生物相容性和安全性。在疏水作用、静电作用和氢键结合等非共价弱相互作用的驱动下，自组装肽(如SPG‑178、EAK16、SLac和RADA16等)可以在出血部位凝胶化，显著减少失血。这种由弱相互作用驱动的自我组装是一把双刃剑：能够自我组装成特定的网络纳米结构是这些肽的一个最大好处，但微弱的闭合体间相互作用使得它们较脆弱，不适合用高压阻断动脉血管的出血，如肝动脉。因此，开发具有机械特性的肽衍生止血材料以快速有效地控制出血仍然是一项挑战。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供功能性自组装纳米多肽水凝胶、制备方法、用途和制剂，以解决现有凝胶以及止血材料无法应对大创面以及高压血管出血的问题。

[0006] 本发明采用以下技术方案：一种功能性自组装纳米多肽水凝胶，包含与Ca2+结合的结合肽和响应凝血因子13的交联肽，其中，所述结合肽和交联肽的摩尔比为1:1‑10:1。

[0007] 进一步地，结合肽和交联肽的摩尔比为3:1。

[0008] 进一步地，交联肽的序列为：(RADA)4‑GGQQLK，结合肽的序列为：(RADA)4‑GSVLGYIQIR。

[0009] 一种功能性自组装纳米多肽水凝胶的制备方法，制备方法包括以下步骤：将结合肽和交联肽的水溶液按3:1的摩尔比混合成多肽混合溶液，通过超声处理使多肽完全溶解并混合均匀，然后在室温下诱发多肽混合溶液自组装形成水凝胶。

[0010] 功能性自组装纳米多肽水凝胶在制备组织工程材料中的用途。

[0011] 进一步地，组织工程材料是人工血管组织材料。

[0012] 一种人工血管，人工血管通过将来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞在权利要求1‑3中任一项的功能性自组装纳米多肽水凝胶中进行三维培养而获得，离体血管内皮细胞取自哺乳动物的肺、皮肤、大动脉血管或脐血管。

[0013] 一种功能性自组装纳米多肽制剂，功能性自组装纳米多肽制剂包括权利要求1‑3任一项的功能性自组装纳米多肽。

[0014] 进一步地，功能性自组装纳米多肽制剂的剂型包括粉剂或液体制剂，功能性自组装纳米多肽制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

[0015] 功能性自组装纳米多肽制剂的应用：制备止血材料。

[0016] 本发明的有益效果是：本发明功能性自组装纳米多肽水凝胶(NBA)，通过两种功能化肽的三阶段自组装策略快速有效地止血。NBA首先通过两阶段的自组装构建，由交联肽2+
(CRP)和结合肽(CBP)自组装形成纳米纤维，在Ca 驱动下进行第二阶段自组装编织成网状网络，进而在凝血因子十三(FXIIIA)的催化下进行第三阶段的自组装，形成一个致密物理屏障以阻止出血。与预期相符，NBA可以迅速有效地止住大鼠肝划伤模型的出血，同时有效减少伤口周围的炎症，促进伤口愈合。更重要的是，NBA对大鼠1/3肝缺损引起的无法缝合的出血和穿透性伤口引起的不可压迫的出血有极好的止血作用，本发明的多肽完全没有毒副作用，大幅度止血材料的安全性，这种仿生三阶段自组装策略将为致命性肝出血提供一种临床上潜在的基于肽的治疗方法，并重振自组装肽水凝胶止血剂的研发，具有广泛的潜在应用前景。

附图说明

[0017] 图1为NBA的设计和特点；(A)为两个功能化多肽CRP和CBP的三阶段自组装策略示意图；(B)和(C)为合成CBP(B)和CRP(C)的LC‑MS表征；(D)为由CRP和CBP在PBS缓冲液中第一2+
阶段自组装而成的纳米纤维的透射电镜图像；(E)为CBP与Ca 亲和力的恒温滴定热法(ITC)
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测定，在pH7.4的PBS缓冲液中，25℃时测定其结合亲和力；(F)和(G)为Ca 驱动第二阶段自组装后的TEM图像(F)和SEM图像(G)；(H)和(I)为凝血因子XIIIA(FXIIIa)催化第二阶段自组装后的透射电镜图像(H)和扫描电镜图像(I)；(J)为以600nm处的吸光度量化的糊化程
2+
度；(K)为代表性摄影显示C反应蛋白/CBP肽水凝胶对Ca 和FXIIIa的反应呈胶状化；

[0018] 图2为NBA的生物功能；(A)为NBA对FXIIIa、纤维蛋白原和血液共同作用的扫描电镜图像，表明NBA在编织由多肽和纤维蛋白组成的致密物理屏障方面具有巨大的潜力；(B)为代表性照片展示了NBA和对照组的全血凝血评价；(C)为NBA和对照组的体外动态全血凝血评价，在600nm波长处测定血液溶液的吸光度，并用对数方程拟合半血凝时间(BCI50)，(D)为制作长1cm、深0.5cm的矢状面切割伤口后大鼠肝脏止血的代表性图片；(E)和(F)为大鼠肝划伤模型的止血时间(E)和失血量(F)(平均值±SD，n＝6个/组)，用ANOV法计算P值，p<0.001，p<0.0001，p<0.05，p<0.01，p<0.05，p<0.0001；

[0019] 图3为NBA能有效减轻创面周围炎症反应，促进创面愈合的表征展示；(A)为NBA治疗与PBS治疗后创面组织基因差异表达的火山图(n＝3)；(B)和(C)为NBA治疗后炎症反应TM(B)和IL6‑JAK‑STAT3信号通路(C)的基因集富集分析(GSEA)结果；(D)为FIBRILLAR 治疗与PBS治疗(n＝3)后创面组织差异表达基因的V‑olcano图谱(n＝3)；(E)和(F)为对TM
FIBRILLAR 治疗的炎症反应(E)和IL6‑JAK‑STAT3信号通路(F)的GSEA结果；(G)为ELISA法检测创面组织中IL‑6,MCP‑1,NF‑κB和TNFα四种炎症因子的含量；(H)为治疗后第14天肝脏创面的有代表性的H&E影像；

[0020] 图4为NBA在大鼠肝缺损致死性不可缝合的出血模型和穿透创面不可按压的出血模型上均有良好的止血效果；(A)为大鼠肝1/3缺损致死性不可缝合的出血模型建立后大鼠肝脏止血图；(B)和(C)为大鼠肝划伤模型的止血时间(B)和失血量(C)(平均值±标准差，n＝6/组)；(D)为治疗后第14天血细胞计数和肝生化测定；(E)为治疗后第14天肝脏创面的代表性HE影像；(F)为穿透伤不可按压出血模型大鼠肝脏止血图；(G)和(H)为大鼠肝划伤模型的止血时间(G)和失血量(H)(平均值±SD，n＝6个/组)；(I)为治疗后第3天血细胞计数；(J)为治疗后第14天肝脏创面的代表性HE影像，使用ANOVA计算P值。p<0.001，p<0.0001，p<0.05，p<0.01，p<0.05，p<0.0001；

[0021] 图5为由不同比例的CRP：CBP组成的NBA的扫描电镜图像；

[0022] 图6为NBA的HRTEM(透射电镜)图像和钙元素分析；

[0023] 图7为NBA的细胞毒性0.075％、0.050％、0.025％和0％的NBA对(A)AML12(鼠肝细胞)和(B)HUVEC(人脐静脉内皮细胞)人脐静脉内皮细胞的时间依赖性细胞毒活性；

[0024] 图8为大鼠肝划伤后心、肝、脾、肺、肾组织切片具有代表性的组织学HE染色图像；

[0025] 图9为在大鼠肝脏1/3缺损致死性不可缝合出血模型中，大鼠的心、肝、脾、肺、肾组织切片上具有代表性的组织学HE染色图像。

具体实施方式

[0026] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0027] 本发明为了开发一种能够处理无法按压的穿孔伤口和无法缝合的大伤口的肽衍生止血材料，设计了三阶段自组装策略。在这种情况下，两个量身定制设计的肽(RADA)4‑2+
GGQQLK(交联肽，CRP)和(RADA)4‑GSVLGYIQIR(Ca 结合肽，CBP)由Fmoc化学(图1A)高效合成。在第一阶段的自组装中，(RADA)4模体可以赋予CRP和CBP联合自组装成纳米纤维的能
2+
力。自组装纳米纤维周围侧翼CBP中的功能基序VLGYIQIR能够与配位数为3的Ca 结合，驱动第二阶段自组装成称为纳米创可贴(NBA)的网格状网络(图1A)。至于第三阶段的自组装，纳米纤维周围的另一个模体(CRP中的QQLK)可以通过凝血级联(图1A)中的凝血因子XIIIA(FXIIIA)催化的乙基转移反应进一步相互交叉和纤维素。因此，当NBA遇到血液时，他们可以在出血部位原位形成包括多肽和纤维素在内的物理屏障。更重要的是，NBA在遇到血液之前是一种粘稠的液体，有利于依附穿孔伤口和大伤口。正如预期的那样，NBA在大鼠肝脏划痕、穿透伤非压迫性出血模型和大鼠肝脏缺损致死性不可缝合性出血模型中迅速有效地控制出血，同时保持了良好的安全性特性。这种仿生三阶段自组装策略将为致命性肝出血提供一种临床上潜在的基于肽的治疗方法，并重新振奋开发自组装肽水凝胶作为止血剂的努力，具有广泛的潜在应用前景。

[0028] 本发明公开了一种功能性自组装纳米多肽水凝胶，包含与Ca2+结合的结合肽和响应凝血因子13FXIIIa的交联肽，其中，所述结合肽和交联肽的摩尔比为1:1‑10:1，优选为3:1，所述结合肽的序列为：(RADA)4‑GSVLGYIQIR，所述交联肽的序列为：(RADA)4‑GGQQLK。

[0029] 本发明还公开了一种功能性自组装纳米多肽水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将结合肽和交联肽的水溶液按3:1的摩尔比混合成多肽混合溶液，通过超声处理使多肽完全溶解并混合均匀，然后在室温下诱发多肽混合溶液自组装形成水凝胶。

[0030] 本发明还公开了功能性自组装纳米多肽水凝胶在制备组织工程材料中的用途，所述组织工程材料是人工血管组织材料。

[0031] 本发明还公开了一种人工血管，所述人工血管通过将来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞在上述的功能性自组装纳米多肽水凝胶中进行三维培养而获得，所述离体血管内皮细胞取自哺乳动物的肺、皮肤、大动脉血管或脐血管。

[0032] 本发明还公开了一种功能性自组装纳米多肽制剂，所述功能性自组装纳米多肽制剂包括上述的功能性自组装纳米多肽，所述功能性自组装纳米多肽制剂的剂型包括粉剂或液体制剂，所述功能性自组装纳米多肽制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料，本发明还公开了功能性自组装纳米多肽制剂的应用：制备止血材料。

[0033] 材料和方法

[0034] 所有合成肽均来自CS Bio(Shanghai)Ltd。在本研究中所使用的所有其他化学试剂均购自Sigma‑Aldrich，除非另有说明。乙腈和水(HPLC级)购自Fisher Science Ltd。所有产品均按原样使用，无需进一步纯化。所有数据均以均数±标准差(S.D.)表示。采用t检验进行统计学显著性分析，以确定两个个体数据的显著性，P<0.05为显著。

[0035] NBA的制备及特点

[0036] 利用为FMOC‑chemistry SPPS开发的HBTU活化/DIEA原位中和方案的HBTU/HOBt方法，使用CS bio 336X全自动多肽合成仪，在合适的树脂上合成了(RADA)4‑GGQLK(交联肽，2+
CRP)和(RADA)4‑GSVLGYIQIR(Ca 结合肽，CBP)。粗品在含有88％TFA、5％苯酚、5％H2O和2％TIPS的鸡尾酒试剂中裂解、脱保护后，用冷乙醚沉淀，用制备型C18反相高效液相色谱(HPLC)纯化至均一。用电喷雾电离质谱(ESI‑MS)测定其分子量。

[0037] 制备水凝胶时，将(RADA)4‑GGQLK交联肽和(RADA)4‑GSVLGYIQIR结合肽用含0.1mg/mL CaCl2的PBS溶液按3：1质量比溶解。在交联过程中，37℃条件下，在FXIIIa(Solarbio，G8661在PBS中)中浸透水凝胶，制备的水凝胶浓度分别为0～1.25％、2.5％、
5％、7.5％和15％(w/v)，用来探索一个合适的浓度。用微板阅读器(Epoch，Biotek)测量水凝胶在600nm处的吸光度。

[0038] 为研究NBA与血液的相互作用，将NBA加入全血中，放置在37℃下5min。全血120g离心10min得到富血小板血浆(PRP)。然后，将PRP滴在NBA上，在37℃放置1h，最后用PBS洗涤3次，去除物理附着的血细胞和血小板。这些样品用2.5％的戊二醛在4℃的PBS中固定3h，然后用30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇连续脱水两次进行进一步的形态学观察，如图1所示。

[0039] CRP和CBP采用FMOC化学固相肽合成法(SPSS)合成，经制备性高效液相色谱(HPLC)纯化，冷冻干燥后收集。如图2B和2C所示，经液相色谱‑质谱(LC‑MS)分析，成功合成了两个多肽，分子量正确，纯度超过95％。值得注意的是，CRP和CBP的产率均大于75％，促进了其应用潜力。

[0040] 使用Hitachi S‑4800扫描电镜观察了水凝胶的微观形貌。冻干样品在干燥后的水凝胶支架上喷洒8nm铂层进行进一步观察。并记录了元素(Ca)分布图。用透射电镜(Tecnai G2 SPIRIT，FEI)观察了水凝胶的微观结构。制备透射电镜样品方法，将10μL多肽溶液滴在涂有碳膜的铜网上，用2％磷钨酸溶液染色。

[0041] 为探讨NBA的生物学功能，采用扫描电子显微镜(SEM)观察FXIIa与纤维蛋白原和血液孵育后NBA的超微结构变化。如图2A所示，纤维蛋白原进一步增加了NBA的致密性，可能是因为FXIIIa催化的纤维蛋白原和NBA之间的共交联。此外，NBA与FXIIIa和血液共同孵育后也可以发现致密性增加(图2A)。这些结果表明，NBA在由多肽和纤维蛋白复合的出血部位原位编织致密的物理屏障方面具有巨大的潜力。

[0042] 透射电子显微镜图像所示，将CRP和CBP溶解在PBS缓冲液(pH7.4)中触发了第一阶段自组装成稀疏布线的纳米纤维(图1D)。此外，正如设计的那样，CBP具有结合钙离子的功能，这是二次自组装的驱动力。

[0043] 使用PEAQ‑ITC微量热计(MicroCal)进行了等温滴定法实验，检测了水凝胶与钙离子的相互作用。样品溶解在去离子水中。注射器装入200μl氯化钙(100μM)，细胞装入260μl的(RADA)4‑GSVLGYIQIR(10μM)。滴定方案包括19次2μl的注射，两次注射间隔90秒。

[0044] 等温滴定量热分析表明，CBP与Ca2+的结合亲和力为2.14μM，结合位点数为0.3562+
(图1E)，表明一个CBP可以与3个Ca 有效结合。结果，这一特征诱导了纳米纤维之间的交联，组织成一种网状网络，称为NBA(图1F和G)。为了优化这个网络结构，筛选了CBP和CRP的比例。如图5中的SEM图像所示，最佳比例为3：1(CBP：CRP)最有利于这种网状网络的构象(图
5)。值得注意的是，TEM图像与原位Ca元素分析的重叠进一步支持了这一结果，其中Ca可以在纳米纤维的交叉处找到(图6)。此外，CRP中QQLK基序之间的进一步交联将驱动第三阶段的自组装。正如预期的那样，FXIIIa可以催化这一反应，并将网状网络编织成更紧密的纳米
2+
纤维缠结(图1H和I)。此外，凝胶分析再次证明了这种三级多肽的自组装，在含有Ca 和FXIIIa的条件下，对应于最致密凝胶的600nm处的吸光度最高，与仅有多肽的条件下的最低吸光度形成鲜明对比(图1J和K)。值得注意的是，5％的肽密度是一个临界浓度，在这一浓度下，NBA在FXIIIa催化前保持了流动性，并在催化后完全转移到固体凝胶中(图1K)。因此，该浓度被用于随后的功能测试。

[0045] 全血凝血测定

[0046] 将体积为50μL(5％w/v)的水凝胶放入平底培养皿中。然后，将50μL含钙全血溶液(0.2M氯化钙，血液中20mM)缓慢滴在在37℃中预热后的水凝胶的表面。将装有血样的培养皿在37℃下分别孵育0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s和210s。在相应的时间点，轻轻加入5ml去离子水，在不干扰凝块的情况下释放游离血液。将等量(2.5mg)的止血粉(Fu Hetai)、氧化再生纤维素止血剂(Easy Peel)、明胶海绵(Xiang En)进行与凝胶相同的处理和分析。
用微板阅读器(Epoch，Biotek)在542nm处测定上清液的吸光度。进行了4次重复试验。将材料的凝血指数(BCI)量化如下：

[0047]

[0048] 其中Ir代表样品的吸光度，Ir代表50μL含钙全血在5mL去离子水中的吸光度，Ic代表去离子水的吸光度。

[0049] 通过动态全血凝血试验评价了NBA的体外凝血性能。以市售明胶止血海绵(明胶海TM绵)、壳聚糖止血粉(壳聚糖)和止血纤维纱(FIBRILLAR )为阳性对照。在这项测试中，血红TM
蛋白溶液的透过率越低，说明凝血率越高。如图2B所示，NBA和FIBRILLAR 在与血液孵育60秒后均出现澄清，表明它们具有很好的凝血性能。测定各组血液溶液在600nm波长处的吸光度，并用对数方程拟合半凝血时间(BCI50)，以量化凝血能力。如图2C所示，NBA、明胶海绵、壳TM
聚糖和FIBRILLAR 可显著缩短血液的半凝血时间。重要的是，NBA的BCI50值最短，为惊人的TM TM
2.0s，而FIBRILLAR 具有亚水平的凝血能力，BCI50为21.7s，因此选择FIBRILLAR 作为体内试验的阳性对照。

[0050] 肝出血模型的止血作用

[0051] 实验过程由第四军医大学医学伦理委员会批准。SD大鼠(雄性，～200g)随机分组。麻醉采用异氟醚(R510‑22，VETEASY)，麻醉诱导水平为3％，维持水平为2％。行腹正中切口，显露肝脏左叶。在本发明中建立了三种肝损伤模型。其中第一种模型，切除了部分(近1/3)的左叶(穿刺伤)。第二种模型，在暴露的肝脏(穿刺伤)上制造两个垂直的创面，长3cm，深
5mm。第三种模型，用活组织检查穿孔(不能缝合的出血伤口)制作直径为4mm的近全层伤口。
实验组在伤后10s用5％(w/v)水凝胶或氧化再生纤维素止血器涂抹于创面。对照组的伤口不做处理。分别记录出血时间和出血量。手术后，缝合大鼠后，独立安置。未经任何处理的大鼠为空白组。所有接受人类护理和研究的动物都符合机构动物护理和使用委员会的指导方针。

[0052] 使用严重肝损伤的大鼠模型进一步评价NBA的止血性能，其长1cm、深0.5cm的交叉矢状切口可以模拟不能缝合的严重创面。如图2D所示，造成快速大量出血的严重肝损伤，在TM出血后15s用5％NBA或辅助剂FIBRILLAR 治疗。意想不到的是，在NBA治疗的肝脏中，水凝胶迅速与病变相吻合，并立即就地凝胶化。更重要的是，NBA在不到50秒的时间内止血，TM
FIBRILLAR 的止血时间为120秒，而PBS对照组的止血时间超过220秒(图2E)。此外，与TM
FIBRILLAR 和PBS治疗组(Ctrl)相比，NBA在统计上显著减少了失血量(图2F)。这些结果表明NBA具有良好的体内止血能力。

[0053] 转录组测序

[0054] 分别于造模后和治疗后3天采集穿刺伤实验组、对照组和空白组的肝组织。按说明TM书要求用TRIzol(Invitgen)提取组织RNA。RNA‑Seq文库由 Ultra RNA Library Prep Kit for (E7530L，New England Biolabs)构建，并在NovaSeq6000平台上进行测序(2×150bp)。

[0055] 由于NBA的快速止血作用和良好的生物相容性，推测NBA可以有效地减轻创面周围的炎症反应，这非常有利于创面的愈合。为证实这一点，在止血治疗3d后，从损伤肝脏中分3
离出1cm的创面组织。RNA测序分析表明，与PBS对照组相比，NBA引发了920个基因表达的差异变化(图3A)，并且通过基因集富集分析(GSEA)可以发现一致的和可重复的炎症调控基因表达特征的丰富(图3B和C)。具体地说，NBA导致炎症反应通路(图3B)和IL6‑JAK‑STAT3信号TM
通路(图3C)显著下调。与之形成鲜明对比的是，将FIBRILLAR 与PBS对照进行比较，尽管只TM
发现了162个差异表达基因(图3D)，但FIBRILLAR 在统计学上显著上调了炎症反应(图3E)和IL6‑JAK‑STAT3信号通路(图3F)，这可能是因为它的生物相容性有限。为了进一步验证这些结果，用酶联免疫吸附试验对创面组织中的4种炎症因子：IL‑6,MCP‑1,NF‑κB和TNFα进行了定量测定，结果再次支持了NBA能有效地减轻创面组织的炎症反应。结果是，NBA治疗促进了创面愈合，治疗后第14天的创面肝脏病理切片(图3H)证实了这一结果，这些结果得到了正常化的肝功能指标(图4D)和全血计数(图4D)的进一步支持。此外，经NBA治疗后，小鼠的心、脾、肺、肾未见病理改变(图8和图9)，支持NBA的安全性。总体而言，NBA在止血治疗和消炎方面表现出色，显示出作为一种快速、高效和安全的肝脏止血材料的巨大潜力。

[0056] 血常规检查和血液生化

[0057] 为评估创面肝的再生情况，于造模和治疗后2周采集组织标本，用4％多聚甲醛固定。石蜡包埋组织切片40‑μm厚切片，苏木精‑伊红染色。所有切片均由显微镜拍摄(IX53,Olympus,Japan)。

[0058] 分别于造模和治疗2周后，从实验组(划痕和穿刺伤)、对照组和空白组大鼠的下腔静脉采集血常规和血液生化指标。为了分离血清，全血样本以6000g离心10min。血常规检查使用自动血细胞分析仪(BC‑2800VET，Mindray)进行。根据全自动生化分析仪(Chemray800)的使用说明，使用相应的试剂盒(Kayto)进行血液生化参数的测定。

[0059] 在功能测试之前，首先通过检测NBA与肝细胞(AML12细胞)和血管内皮细胞(HUVEC细胞)孵育后的活性来探讨NBA的体外急性毒性。如图7所示，在7天的孵育过程中没有发现细胞毒性，这表明NBA具有安全性和生物相容性。

[0060] 为进一步挑战其止血能力，建立了大鼠肝缺损致死性不可缝合出血模型和穿透伤不可按压出血模型。如图4A所示，超过1/3的肝脏被切除，超过一半的全血将在损伤后失血TM(图4B和4C)。出血后15s，对照组加压创面，其他两组创面用NBA或FIBRILLAR 创面处理。不TM
出所料，与压迫创面组或FIBRILLAR 治疗组相比，NBA显著缩短了止血时间。同时，与压迫相比，NBA治疗减少了一半的出血量(图4C)。此外，NBA还促进了伤口愈合和肝功能恢复(图4D和4E)，同时保持了良好的安全性(图9)。

[0061] 小口径武器和简易爆炸装置造成的小而深的穿透伤是不可按压的，常规止血剂也TM难以止血。如图4F所示，直径50mm的穿透伤口导致严重出血，但FIBRILLAR 对大出血没有止血作用(图4G和H)。与之形成鲜明对比的是，NBA迅速穿过伤口，并立即就地凝胶止血(补充视频剪辑和图4F)。结果，NBA治疗将出血时间缩短了一半(图4G)，出血量减少了一半(图
4H)。此外，治疗3天后，白细胞(WBC)和中性粒细胞的显著下降表明NBA治疗后炎症反应减轻(图4I)。此外，NBA还促进创面愈合(图4J)，各脏器未见炎症反应(图8)。

[0062] 酶联免疫吸附试验

[0063] 于造模后和治疗后3天，分别从实验组(未缝合出血创面)、对照组和空白组采集血清标本，进行酶联免疫吸附测定。按厂家说明书进行TNFα,NF‑KB,IL‑6,MCP‑1,TGFα,EGF和HGF的ELISA检测。

[0064] 细胞存活率

[0065] AML12细胞系和HUVEC细胞系购自中国上海中科院细胞库，在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中以每孔1000个细胞的速度培养，24h后换成0.075％NBA、0.05％NBA、0.025％NBA、0.001mg/mLCaCl2(相应培养基)和新鲜培养基。并每天更换相应的培养基，培养7d。分别于第0、1、2、3、5、7d用CCK8(Dojindo)法检测细胞存活率。

[0066] 本发明通过两个功能化多肽的三阶段自组装策略，快速有效地止血。在前两步自2+
组装中，CRP和CBP首先组装成纳米纤维，然后在Ca 的驱动下交织成网状网络。这种NBA在与血液相遇之前是一种粘性液体，因此有利于覆盖和顺应穿孔创面和大创面。最终，伤口将激活凝血因子XIIIA(FXIIIa)催化NBA进行第三阶段的自组装，形成致密的物理屏障，以有效止血。不出所料，NBA能迅速地阻止大鼠肝脏划痕出血，同时有效地减轻创面周围炎症，促进创面愈合。更重要的是，NBA对大鼠1/3肝缺损不能缝合的出血和穿透性伤口的不可按压出血有良好的止血效果，同时保持了良好的安全性。这种仿生的三阶段自组装策略将为致命的肝出血提供一种具有临床潜力的多肽治疗方法，并重振自组装肽水凝胶止血剂的研发，具有广泛的潜在应用前景。

[0067] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。