一种大环精胺类化合物incasine B的制备方法及用途转让专利
申请号 : CN202110956529.0
文献号 : CN113648314B
文献日 : 2023-02-24
发明人 : 代小勇 , 张玉波
申请人 : 强德(深圳)生物医药科技有限公司
摘要 :
一种大环精胺类化合物incasine B的制备方法及用途，属于天然药物化学技术领域。本发明一方面提供了大环精胺类化合物incasine B在制备抗乳腺癌疾病药物中的用途，一种用于预防或治疗乳腺癌的药物制剂。另一方面提供了大环精胺类化合物incasine B的制备方法。本发明从中药材角蒿中分离的大环精胺类化合物对乳腺癌细胞有很好抑制作用，能够显著抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549的增殖。本发明可为新型抗乳腺癌药物的开发提供物质基础，有利于中药材角蒿药用价值的进一步开发。为乳腺癌等提供有效的治疗小分子药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。
权利要求 :
1.大环精胺类化合物incasine B在制备抗乳腺癌疾病药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述incasine B抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549的增殖，抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231迁移、侵袭和克隆，促进乳腺癌细胞MDA‑MB‑231发生凋亡。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述incasine B抑制乳腺癌细胞HUVEC血管形成。
说明书 :
一种大环精胺类化合物incasine B的制备方法及用途
技术领域
[0001] 本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种大环精胺类化合物 incasine B的制备方法及用途。
背景技术
[0002] 乳腺癌(Breast cancer)是指发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。而手术、 放疗和化疗等传统治疗方式，作用的特异性和专一性不佳，不可避免的会对正常 细胞和组织产生杀伤性作用，给患者带来极大的副作用。因此，寻找高效特异性 的靶向药物，将极大提高乳腺癌的治疗效果。
[0003] 角蒿(Incarvillae sinensis)别名莪蒿、萝蒿、透骨草等，为紫葳 科(Bignoniaceae)角蒿属(Incarvillae)植物，全草入药，主要分布在我国的西南、 西北、东北、华北等地区。角蒿作为一种传统的中药，药用历史悠久，有祛风湿、 解毒、杀虫等功效，主治风湿痹痛、跌打损伤、齿龈溃烂、口疮、耳疮、湿疹等。 所含的化学成分种类丰富，主要有生物碱类、环己乙醇类、萜类等，此外还存在 有酚酸类、香豆素类、黄酮类等。具有镇痛、抗炎以及抗氧化等作用。现有技术 并无报道其具有治疗乳腺癌的作用。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种大环精胺 类化合物incasine B的制备方法及用途，本发明首次发现中药材角蒿提取物具有 明显的抗乳腺癌肿瘤活性，具有制备预防或治疗乳腺癌肿瘤症及其相关疾病的药 物制剂的成药潜力，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 大环精胺类化合物incasine B在制备抗乳腺癌疾病药物中的用途。
[0007] 所述的用途，其特征在于所述incasine B抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231， BT549的增殖，抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231迁移、侵袭和克隆，促进乳腺癌 细胞MDA‑MB‑231发生凋亡。
[0008] 所述的用途，其特征在于所述incasine B抑制乳腺癌细胞HUVEC血管形成。
[0009] 一种用于预防或治疗乳腺癌的药物制剂，其特征在于所述药物制剂含有大环 精胺类化合物incasine B。
[0010] 所述的用于预防或治疗乳腺癌的药物制剂，其特征在于所述药物制剂是通过 添加常规辅料，按照常规工艺制备而成；
[0011] 所述的常规辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇‑4000、 聚乙二醇‑6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、交联聚维酮、微粉硅胶、氢化 植物油、滑石粉、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、 碳酸氢纳、枸橼酸、羧甲基淀粉钠中一种或一种以上；
[0012] 所述的制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬 剂。
[0013] 一种大环精胺类化合物incasine B的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0014] (1)称取角蒿干燥全草，用乙醇提取，减压浓缩得粗提物，加水混悬萃取 除杂后多次氯仿萃取合并，减压浓缩氯仿萃取液得到总碱；
[0015] (2)将步骤(1)得到的总碱用乙醇混悬，经D101大孔树脂柱层析洗脱， 得到目标合并物溶解后，硅胶拌样，减压蒸干，得到样品；
[0016] (3)取硅胶干法装柱，将步骤(2)得到的样品装入上柱，再覆上一层硅胶， 梯度洗脱得到目标馏分溶解混合溶剂洗脱部位，上柱凝胶柱，洗脱，收集保留时 间130min‑150min之间的流份，减压浓缩，干燥得到incasine B。
[0017] 所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)具体操作为：称取角蒿干燥全 草，分批次用95％乙醇提取合并，减压浓缩得粗提物，将粗提物加水混悬，用 1％HCL调pH至3，搅拌后静置，用氯仿萃取除杂，再将除杂后的酸水层用2％ 的氨水调pH至10，搅拌后静置，用氯仿多次萃取合并，减压浓缩氯仿萃取液得 到总碱。
[0018] 所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)具体操作为：将总碱用30％乙 醇混悬，经D101大孔树脂柱层析，依次用30％、50％、70％和95％乙醇进行 洗脱，70％部位和95％部位经HPLC检识后合并得到合并物，将合并物用二氯 甲烷溶解后，用100‑200目硅胶拌样，减压蒸干，得到样品。
[0019] 所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)具体操作为：取200‑300目硅 胶干法装硅胶柱，将样品装入上柱，再覆上一层硅胶，用二氯甲烷‑甲醇系统进 行梯度洗脱，得到3个馏分Fr.1‑3，将Fr.1用甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上 柱Sephadex LH‑20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC‑MS分析跟踪检测，收集保留 时间130min‑150min之间的流份，减压浓缩，干燥得到incasine B。
[0020] 所述的制备方法，其特征在于所述硅胶柱的内径×长度＝7×50cm，所述Fr.1 溶解时Fr.1:甲醇溶液＝8:6g/mL，所述Sephadex LH‑20凝胶柱的体积为100mL。
[0021] 本发明具有以下有益效果：
[0022] 1、本发明首次发现角蒿及提取物具有明显的抗乳腺癌肿瘤活性，具有制备 预防或治疗乳腺癌肿瘤及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗乳腺癌肿 瘤创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。
[0023] 2、本发明的角蒿提取物成本低、污染小，有利于节能减排条件下的大规模 生产，产业化前景好。
[0024] 3、本发明通过研究角蒿提取物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549的增殖 抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用，有力证明 了本发明的角蒿提取物对乳腺癌肿瘤细胞具有明显的抑制和致亡作用。
[0025] 4、本发明的角蒿或角蒿提取物还具有祛风除湿、舒筋活血等功效，可用于 风湿性关节炎、跌打损伤、瘀积肿痛、产后风瘫等症，可以在用于预防或治疗肿 瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。
[0026] 5、角蒿可以与其他药材进行配伍组成复方药用于预防或治疗乳腺癌肿瘤， 还可以将角蒿提取物与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂，这些制剂较为 方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送 至病症部位进行有效治疗。
附图说明
[0027] 图1为大环精胺类incasine B化合物化学结构式；
[0028] 图2为大环精胺类incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549 增殖的影响作用，其中A为incasine B化合物在不同作用时间下对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231增殖影响，B为sophaline B化合物在不同作用时间下对乳腺癌细 胞BT549增殖影响；
[0029] 图3为大环精胺类incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231凋亡影响 作用，其中A为incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231凋亡影响，B为 凋亡统计；
[0030] 图4为大环精胺类incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231迁移和侵 袭的影响作用，其中A为incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231迁移和 侵袭影响，B为迁移统计，C为侵袭统计；
[0031] 图5为大环精胺类incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231克隆形成 的影响作用，其中A为incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231克隆形成 影响，B为克隆统计；
[0032] 图6为大环精胺类incasine B化合物对乳腺癌细胞MDA‑MB‑231血管形成 的影响作用，其中A为incasine B化合物对HUVEC细胞血管形成影响，B为血 管长度统计，C为血管百分比统计，D为血管连接长度统计。
具体实施方式
[0033] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实 施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商 购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或 按照仪器制造商所建议的条件。
[0034] 实施例1：角蒿中提取化合物incasine B
[0035] 50.5kg的角蒿干燥全草，分批次用95％乙醇渗漉提取，减压浓缩得粗提物。 粗提物加水混悬，用1％的HCl调pH至3，搅拌，静置，用氯仿萃取除杂，再 将除杂后的酸水层用2％的氨水调pH至10，搅拌，静置，用氯仿多次萃取，减 压浓缩氯仿萃取液得到285.6g总碱。
总碱用30％乙醇混悬，经D101大孔树脂 柱层析，依次用30％、50％、70％和95％乙醇进行洗脱，70％部位和95％部 位经HPLC检识后进行合并得到样品50g。将角蒿过大孔树脂合并物用二氯甲烷 溶解后，用50g硅胶(100～200目)拌样，减压蒸干，得到样品；另取500g硅胶 (200～300目)干法装硅胶柱(内径×长度＝7×50cm)，将样品装入上柱，再覆上 一层硅胶，用二氯甲烷‑甲醇系统进行梯度洗脱，得到3个子馏分(Fr.1‑3)。Fr.1 (8g)用6mL甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上柱体积为100mL的Sephadex LH‑20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC‑MS分析跟踪检测，收集保留时间130 min‑150min之间的流份，减压浓缩，干燥得到角蒿提取物
1.2g。将角蒿提取 物1.2g采用制备型HPLC制备得到化合物，经结构鉴定，为分离得到化合物 incasine B，化合物结构如图1所示。
总碱用30％乙醇混悬，经D101大孔树脂 柱层析，依次用30％、50％、70％和95％乙醇进行洗脱，70％部位和95％部 位经HPLC检识后进行合并得到样品50g。将角蒿过大孔树脂合并物用二氯甲烷 溶解后，用50g硅胶(100～200目)拌样，减压蒸干，得到样品；另取500g硅胶 (200～300目)干法装硅胶柱(内径×长度＝7×50cm)，将样品装入上柱，再覆上 一层硅胶，用二氯甲烷‑甲醇系统进行梯度洗脱，得到3个子馏分(Fr.1‑3)。Fr.1 (8g)用6mL甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上柱体积为100mL的Sephadex LH‑20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC‑MS分析跟踪检测，收集保留时间130 min‑150min之间的流份，减压浓缩，干燥得到角蒿提取物
1.2g。将角蒿提取 物1.2g采用制备型HPLC制备得到化合物，经结构鉴定，为分离得到化合物 incasine B，化合物结构如图1所示。
[0036] 实施例2：incasine B化合物可以显著抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549 的增殖[0037] 1.将乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，BT549以5×103个/孔接种于96孔细胞培 养板中，每孔培养基体积为200μL，培养24h，然后饥饿过夜；
[0038] 2.加入不同浓度梯度(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125 μM)的化合物分别培养24小时、48小时、72小时；
[0039] 3.每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小 时；
[0040] 4.弃培养板中的上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟， 在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。
[0041] 如图2所示，不同浓度的incasine B化合物可以显著抑制乳腺癌细胞 MDA‑MB‑231，BT549的增殖，并且随着作用时间的增加，化合物抑制乳腺癌细 胞增殖的作用也更为显著。
[0042] 实施例3：incasine B化合物可以促进乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的凋亡[0043] 1.将乳腺癌细胞MDA‑MB‑231以5×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，每 孔培养基体积为1mL，培养24h，然后饥饿过夜；
[0044] 2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养48小时；
[0045] 3.先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培 养液到离心管。500g左右离心5分钟，沉淀细胞；
[0046] 4.用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；
[0047] 5.加入100μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；
[0048] 6.加入5μLAnnexinV‑FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；
[0049] 7.加入400μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀，将样品至于 冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。
[0050] 如图3所示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，incasine B 化合物**可以明显促进乳腺癌细胞MDA‑MB‑231发生凋亡。P<0.01与对照组相 比较。
[0051] 实施例4：incasine B化合物可以显著抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的迁移 和侵袭[0052] 1.Transwell上室种2×105个细胞，加入不同浓度梯度(25μM，50μM) 的化合物培养24小时；
[0053] 2.下室加入800μL含有10％FBS的培养基；
[0054] 3.用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
[0055] 4.用PBS洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；
[0056] 5.用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照。
[0057] 如图4所示，通过实验发现，随着作用浓度的升高，Sophaline B化合物可以 明显**抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231迁移和侵袭。P<0.01与对照组相比较。
[0058] 实施例5：incasine B化合物可以显著抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的体外 克隆形成能力
[0059] 1.将乳腺癌细胞MDA‑MB‑231以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每 孔培养基体积为1mL，培养10天，然后饥饿过夜；
[0060] 2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物作用24h；
[0061] 3.PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
[0062] 4.用PBS洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；
[0063] 5.用PBS洗3次，显微镜拍照。
[0064] 图5显示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，incasine B化合物可 以明显**抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231克隆形成。P<0.01与对照组相比较。
[0065] 实施例6：incasine B化合物可以显著抑制HUVEC血管形成能力
[0066] 1.先用Matrigel铺板24孔板过夜；
[0067] 2.将HUVEC细胞以5×104个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度 梯度(25μM，50μM)的化合物培养6h；
[0068] 3.用PBS洗3次，显微镜拍照。
[0069] 如图6所示，随着作用浓度的升高，incasine B化合物可以明显抑制HUVEC 血管形**成。P<0.01与对照组相比较。
[0070] 本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本 文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。 应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离 由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、 修改和替换。