一类用于氧气传感的铱配合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一类用于氧气传感的铱配合物及其制备方法，该类铱配合物以二聚体铱配合物、4,4'‑二甲基‑2,2'‑联吡啶配体或4‑((癸氧基)甲基)‑4'‑甲基‑2,2'‑联吡啶配体以及六氟磷酸钾为反应原料制备而成，与不同N^N配体结合后所得产物可以分别靶向细胞膜和进入细胞质，应用于生物传感中时，可建立一条动态的氧气检测路径，提升检测灵活性，在氧气传感领域具备较好的应用前景；且该类化合物在生理环境中具有良好的稳定性，可不受pH值变化的干扰而稳定存在。

权利要求

1.一类用于氧气传感的铱配合物，其特征在于，所述配合物的结构通式如下：

其中，n＝1，3，5，7，9；

其中，N^N配体为下列中的任一个：

其中，a＝1，3，5，7，9。

2.如权利要求1所述的一类用于氧气传感的铱配合物的制备方法，其特征在于，合成路线是：

3.如权利要求2所述的一类用于氧气传感的铱配合物的制备方法，其特征在于，该类铱配合物的合成步骤为：

1)将3‑溴咔唑和溴乙烷/溴丁烷/溴己烷/溴辛烷/溴癸烷溶于四氢呋喃中，磁力搅拌下加热回流，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到化合物1；

2)将化合物1、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯加入到茄形瓶中，除氧，注入二氧六环，惰性气体保护下加热回流，反应结束，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到化合物2；

3)将化合物2、2‑溴吡啶和四(三苯基膦)钯加入到双口瓶中，除氧，注入甲苯、甲醇和饱和碳酸钾溶液，在惰性气体保护加热油浴回流，反应结束，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到化合物3；

4)将三水合三氯化铱和化合物3加入到茄形瓶中，除氧，注入乙二醇乙醚和去离子水，在氮气保护下加热回流，反应结束，冷却至室温，循环洗涤，干燥，得到化合物4；

5)将化合物4、N^N配体和六氟磷酸钾加入到茄形瓶中，除氧，注入二氯甲烷和甲醇，在惰性气体保护下加热回流，反应结束，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到配合物I；

6)将3‑溴咔唑、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯加入到茄形瓶中，除氧，注入二氧六环，在惰性气体保护下进行反应，反应结束，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到化合物5；

7)将化合物5、2‑溴吡啶和四(三苯基膦)钯加入到双口瓶中，除氧，注入甲苯、甲醇和饱和碳酸钾混合溶液，在惰性气体保护下进行反应，反应结束，冷却至室温，萃取有机相后除水旋干，硅胶柱层析得到化合物6；

8)将化合物6、1‑溴‑2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷和氢氧化钾加入到茄形瓶中，注入四氢呋喃进行反应，反应液除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物7；

9)将化合物7和三水合三氯化铱加入到反应瓶中，除氧，注入乙二醇乙醚和去离子水混合溶液，在惰性气体保护下加热回流反应，反应结束，冷却至室温，循环洗涤，干燥得到化合物8；

10)将化合物8、N^N配体和六氟磷酸钾加入到茄形瓶中，除氧，注入二氯甲烷和甲醇，在惰性气体保护下加热回流，反应结束，冷却至室温，反应液除水后减压旋干，硅胶柱层析得到配合物II。

4.如权利要求3所述的一类用于氧气传感的铱配合物的制备方法，其特征在于，步骤4)中，三水合三氯化铱与化合物3的反应投料摩尔比为1:2～1:3，乙二醇乙醚和去离子水的体积比为3:1～5:1，加热回流温度为110～120℃，在氮气氛围下，回流搅拌时间为24～30h。

5.如权利要求3所述的一类用于氧气传感的铱配合物的制备方法，其特征在于，步骤9)中，三水合三氯化铱与化合物7的反应投料摩尔比为1:2～1:3，乙二醇乙醚和去离子水的体积比为3:1～5:1，加热回流温度为110～120℃，在氮气氛围下，回流搅拌时间为24～30h。

6.如权利要求3所述的一类用于氧气传感的铱配合物的制备方法，其特征在于，步骤5)中和步骤10)中，在惰性气体保护下加热回流温度为40‑50℃，反应时间16‑18h。

7.如权利要求1所述的一类用于氧气传感的铱配合物在制备生物传感材料领域的应用，其特征在于，N^N配体不同的铱配合物分别靶向细胞膜和进入细胞质，将连接有不同N^N配体的铱配合物配合使用实现细胞中氧气浓度的动态检测过程。

说明书

一类用于氧气传感的铱配合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于有机光电材料技术领域。具体涉及一类用于氧气传感的铱配合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 自20世纪70年代顺铂成功应用于临床以来，金属配合物在生物医学领域得到了广泛的应用和研究。与有机染料相比，金属配合物具有优异的光物理性质，如耐光漂白、斯托克斯位移大、发光寿命长等，使其在生物成像应用方面有着显著的优势，并被开发为各种生物探针，可对生物分子进行检测，也可对细胞内的各种动态行为和演化过程进行示踪。在各类金属配合物中，铱(Ⅲ)配合物由于具有良好的细胞膜通透性、较长的磷光寿命、优异的光稳定性以及灵敏的激发态等优点，近年来在生物成像和灵敏探针方面的应用成果显著。特别是基于其细胞膜通透性良好和磷光寿命较长这两点优势，对基于寿命的生物传感和在活细胞中的成像是非常有利的。

[0003] 生物体呼吸作用消耗氧气，而且氧气分子参与线粒体内三磷酸腺苷(ATP)的产生和消耗。在健康的器官、组织和细胞中氧气含量会保持在21％左右的水平。体内氧气供应不足会导致乏氧，这可能会引起多种严重疾病，例如动脉硬化、脑梗死、缺血性心脏病、慢性肾脏疾病和糖尿病性视网膜病。因此实时检测氧气浓度在细胞生物学上有着重要意义。

[0004] 过渡金属配合物探针对O2的检测机理为：当金属配合物吸收一个光子到达其单重激发态S1后，经过系间窜越过程使电子反转，变为三线态激发态T1，由于T1→S0的跃迁是自旋禁阻的，因而金属配合物的T1态和磷光的寿命往往非常长。由于基态的氧气分子为三线态，因此能够与金属配合物的T1态之间发生能量转移，使配合物的磷光发射被猝灭，从而实现对氧气浓度的检测。

[0005] 中国专利CN 105294771 B公开一种可用于氧气传感的阴离子型铱配合物、及其制+备和应用，其以正四丁基铵根离子nBuN为抗衡离子，C^N配体选自2‑苯基吡啶(ppy)、2,4‑二氟苯基吡啶(dfppy)、2‑噻吩‑喹啉(thq)、2‑苯基‑喹啉(bqu)、1‑苯基异喹啉(piq)，该类铱配合物对氧气响应灵敏度比较高、选择性好，可用于生物传感领域，能够在细胞或活体中进行氧气检测，但是该类铱配合物只能进入细胞质中进行氧气检测，难以构建一条动态的检测路线，对乏氧环境的检测灵活性还有待进一步提升。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一类用于氧气传感的铱配合物及其制备方法，该类铱配合物可以分别靶向细胞膜和进入细胞质，检测灵活，在生物环境中具有良好的稳定性，通过生物成像技术可实现对细胞层次氧气的实时监控。

[0007] 本发明的技术方案为：本发明公开的一类用于氧气传感的铱配合物，所述配合物的结构通式如下：

[0008]

[0009] 其中，n＝1，3，5，7，9；

[0010] 其中，N^N配体为下列中的任一个：

[0011]

[0012] 其中，a＝1，3，5，7，9。

[0013] 上述用于氧气传感的铱配合物的制备路线是：

[0014]

[0015]

[0016] 1)将3‑溴咔唑和溴乙烷/溴丁烷/溴己烷/溴辛烷/溴癸烷溶于四氢呋喃中，在磁力搅拌下加热回流，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物1；

[0017] 2)将化合物1、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯加入到茄形瓶中，除氧，注入二氧六环，在氮气保护下，加热回流，反应完成后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物2；

[0018] 3)将化合物2、2‑溴吡啶和四(三苯基膦)钯加入到双口瓶中，除氧，注入甲苯、甲醇和饱和碳酸钾溶液，在氮气保护加热油浴回流，反应完成后，自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物3；

[0019] 4)将三水合三氯化铱和化合物3加入到茄形瓶中，除氧，注入乙二醇乙醚和去离子水，在氮气保护下加热回流，反应完成后，自然冷却至室温，经过5次水洗、抽滤循环洗涤后，置于真空干燥箱中干燥，得到化合物4；

[0020] 5)将化合物4、N^N配体和六氟磷酸钾加入到茄形瓶中，除氧，注入二氯甲烷和甲醇，在氮气保护下加热回流，反应完成后，自然冷却至室温，反应液经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到配合物I；

[0021] 6)将3‑溴咔唑、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯加入到茄形瓶中，除氧，注入二氧六环，在氮气保护下进行反应，反应完成后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物5；

[0022] 7)将化合物5、2‑溴吡啶和四(三苯基膦)钯加入到双口瓶中，除氧，注入甲苯、甲醇和饱和碳酸钾混合溶液，在氮气保护下进行反应，反应完成后，自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物6；

[0023] 8)将化合物6、1‑溴‑2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷和氢氧化钾加入到茄形瓶中，注入四氢呋喃进行反应，反应液经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物7；

[0024] 9)将化合物7和三水合三氯化铱加入到反应瓶中，除氧，注入乙二醇乙醚和去离子水混合溶液，在氮气保护下加热回流反应，反应完成后，自然冷却至室温，进行5次水洗、抽滤循环洗涤，在真空干燥箱中干燥得到化合物8；

[0025] 10)将化合物8、N^N配体和六氟磷酸钾加入到茄形瓶中，除氧，注入二氯甲烷和甲醇，在氮气保护下加热回流，反应完成后，自然冷却至室温，反应液经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到配合物II。

[0026] 进一步地，步骤4)和步骤7)中，三水合三氯化铱与化合物3的反应投料摩尔比为1:2～1:3，乙二醇乙醚和去离子水的体积比为3:1～5:1，加热回流温度为110～120℃，在氮气氛围下，回流搅拌时间为24～30h

[0027] 进一步地，步骤9)中，三水合三氯化铱与化合物7的反应投料摩尔比为1:2～1:3，乙二醇乙醚和去离子水的体积比为3:1～5:1，加热回流温度为110～120℃，在氮气氛围下，回流搅拌时间为24～30h

[0028] 进一步地，步骤5)中和步骤10)中，在氮气保护下加热回流温度为40‑50℃，反应时间16‑18h。

[0029] 所述铱配合物中的N^N配体不同时可分别靶向细胞膜和进入细胞质，将连接有不同N^N配体的铱配合物配合使用可实现细胞中氧气浓度的动态检测过程。

[0030] 本发明的有益效果是：

[0031] 1.本申请公开的铱配合物在生理环境中具有良好的稳定性，还具备优异的耐光漂白性质，应用于生物传感中时，对细胞中氧气的响应灵敏度较高，可以在细胞层次进行氧气浓度检测，在氧气传感领域具备较好的应用前景；

[0032] 2.本申请公开的带有两种不同N^N配体的金属铱配合物分别对细胞膜和细胞质有较好的定位能力，配合使用后即可在细胞膜层面进行氧气检测又可在细胞质层面对氧气进行检测，两种物质配合使用可构建一条关于氧气检测的动态检测路径，可提升乏氧环境的检测灵活性，有望成为优良的氧气探针；

[0033] 3.本申请公开的金属铱配合物具有丰富的光物理性质，可使用时间分辨光学成像技术，避免生物成像过程中背景荧光的干扰，提高检测的信噪比与灵敏度。

附图说明

[0034] 图1为实施例一中制备的金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2在不同氧气浓度下的发射光谱；

[0035] 图2为实施例一中制备的金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2在DMSO溶液中的光稳定性测试图象；

[0036] 图3为实施例一中制备的金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2在不同pH值溶液中的寿命衰减曲线；

[0037] 图4为用实施例一中制备的金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2染色的HeLa细胞共聚焦成像图。

具体实施方式

[0038] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

[0039] 实施例1：配体和配合物的制备方法

[0040] (1)配体的合成方法

[0041] 主配体的合成方法：将3‑溴咔唑和溴乙烷溶于四氢呋喃中，在磁力搅拌下加热回流，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到9‑乙基‑3‑溴咔唑(化合物1)；将化合物1、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯加入到茄形瓶中，除氧，注入二氧六环，在氮气保护下，加热回流，反应完成后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到化合物2；将化合物2、2‑溴吡啶和四(三苯基膦)钯溶于甲苯、甲醇和饱和碳酸钾溶液的混合溶液中，在氮气保护下，85℃油浴回流18小时，反应完成后，自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到如下结构的目标产物化合物3。

[0042]

[0043] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82–8.78(m,1H),8.76–8.73(m,1H),8.24–8.21(m,1H),8.19–8.16(m,1H),7.92–8.88(m,1H),7.81–7.79(m,1H),7.54–7.49(m,2H),7.47–7.45(m,
1H),7.31–7.28(m,1H),7.25–7.22(m,1H),4.46–4.42(m,2H),1.49(t,J＝6.0Hz,3H).[0044] 铱配合物Ir‑2中辅助配体的合成：将4‑(羟甲基)‑4’‑甲基‑2,2’‑联吡啶、1‑溴癸烷、氢化钠溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，在氮气氛围下，室温磁力搅拌24小时。反应完成后，利用二氯甲烷和二次去离子水萃取，所得有机相经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到目标产物4‑((癸氧基)甲基)‑4'‑甲基‑2,2'‑联吡啶。

[0045]

[0046] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.63–8.60(m,1H),8.54–8.51(m,1H),8.37–8.33(m,1H),8.24–8.22(m,1H),7.35–7.33(m,1H),7.29–7.26(m,1H),4.57(s,2H),3.47(t,J＝8.0Hz,
2H),2.40(s,3H),1.59–1.52(m,2H),1.22(s,14H),0.83(d,J＝8.0Hz,3H).

[0047] (2)铱配合物的合成方法

[0048] 1、将三水合三氯化铱(IrCl3·3H2O)和C^N配体小分子反应，反应投料摩尔比为1:2。反应溶剂为乙二醇乙醚和水的混合溶剂，其体积比为4:1。反应温度为120℃，在氮气氛围下，回流搅拌28小时，反应完成后，自然冷却至室温，经过水洗、抽滤循环洗涤后得到产物。

[0049]

[0050] 2、将所制得的二聚体铱配合物、4,4'‑二甲基‑2,2'‑联吡啶配体或4‑((癸氧基)甲基)‑4'‑甲基‑2,2'‑联吡啶配体以及六氟磷酸钾反应，在氮气氛围下，溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，反应温度40℃，反应时间18h，反应完成后，自然冷却至室温，反应液经无水硫酸镁除水后减压旋干，硅胶柱层析得到金属铱配合物Ir‑1或Ir‑2，Ir‑1中的N^N配体为4,4'‑二甲基‑2,2'‑联吡啶，Ir‑2中的N^N配体为4‑((癸氧基)甲基)‑4'‑甲基‑2,2'‑联吡啶。

[0051]

[0052] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.78(d,J＝6.4Hz,4H),8.44–8.40(m,2H),8.10–8.07(m,2H),8.03–7.98(m,2H),7.79–7.77(d,J＝5.6Hz,2H),7.69–7.66(m,2H),7.48–7.46(m,2H),
7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.36–7.32(m,2H),7.17–7.11(m,4H),6.15(s,2H),3.99–3.93(m,
4H),2.52(s,6H),1.04(t,J＝7.2Hz,6H)；

[0053] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.80(s,2H),8.77(d,J＝5.2Hz,2H),8.44–8.42(m,2H),8.09(d,J＝7.6Hz,2H),8.04–7.99(m,2H),7.92(d,J＝5.6Hz,1H),7.79(d,J＝5.6Hz,1H),
7.70–7.67(m,2H),7.59–7.58(m,1H),7.50–7.49(m,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.37–7.32(m,2H),7.18–7.12(m,4H),6.16(d,J＝6.8Hz,2H),4.68(s,2H),4.00–3.94(m,4H),3.52(t,J＝6.4Hz,2H),2.53(s,3H),1.60–1.53(m,2H),1.23(s,14H),1.06–1.02(m,6H),0.81(t,J＝6.8Hz,3H).

[0054] 相关性能测试

[0055] 1.金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2对氧浓度响应研究

[0056] 在二甲基亚砜(DMSO)中研究了10μM金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2对氧气浓度的响应情况。

[0057] 结果如图1所示，从图1中可以看出，当溶液中的氧气浓度由0逐渐增加至100％时，所述金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2的磷光发光强度随之减弱，表现出了长寿命磷光铱(III)配合物对氧气分子敏感的特性。

[0058] 2.金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2的光稳定性检测

[0059] 探针发光强度的稳定性决定了配合物探针能否较好的应用于氧气检测中。与小分子荧光探针相比，铱配合物具有较好的光稳定性。由此，测试了所述金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2的发射强度在长时间光漂白情况下的稳定性，从图2可以看出，在长达15分钟的光漂白过程中，两个配合物几乎没有发射强度的衰减，具有很好的光稳定性。

[0060] 3.金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2在不同pH值溶液中的稳定性测试

[0061] 生理pH范围通常分布在4‑8，在该范围内本申请制备的铱配合物能否保持稳定且不受pH波动的干扰，对于其在生物成像中的稳定应用至关重要。为了验证Ir‑1和Ir‑2在不同pH条件下能否保持稳定，测试了所述配合物在pH＝4‑8范围内的寿命衰减曲线。从图3可以看出，两个配合物的寿命在不同pH值下没有发生明显变化，说明Ir‑1和Ir‑2不受pH值变化的干扰而稳定存在。

[0062] 4.金属铱配合物Ir‑1和Ir‑2在细胞中标记位置的确定

[0063] 将HeLa细胞培养在35mm的玻璃底组织培养皿中，在37℃、5％CO2气氛下孵育48h，取出培养基，代之以含有配合物Ir‑1或Ir‑2的培养基/二甲基亚砜(99：1，v/v)溶液，配合物浓度为5μM，在5％CO2气氛中孵育0.5h后，去掉培养基，用1mL×3的PBS轻轻冲洗细胞层。为了研究所合成的探针的标记位置，我们对它们进行共聚焦扫描成像，激发光源均为405nm，磷光通道收集波段为550‑650nm。从图4可以看出，金属铱配合物Ir‑1顺利进入细胞质，而Ir‑2则成功地靶向细胞膜。

[0064] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。