一株乳酸乳球菌及其在制备植酸酶和动物饲料中的应用

摘要

本发明公开了一株乳酸乳球菌(Lactococcus sp.)，命名为乳酸乳球菌psm16，其于2021年7月21日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22933。本发明还公开了该乳酸乳球菌psm16在制备植酸酶、动物饲料中的应用。该乳酸乳球菌psm16，可以制备高酶活性的植酸酶，可以显著升高肝脏中铜和锌、血清中钙、锰和锌以及肾脏中锰和锌，而肾脏的铜和镁显著降低。在植酸饮食中引入psm16通过刺激乳酸乳球菌psm16水解可以进一步调节肝脏、肾脏和血清中矿物质的吸收来抵消植酸的有害影响，在制备动物饲料领域具有很好的应用前景。

权利要求

1.一株乳酸乳球菌，其特征在于，所述乳酸乳球菌(Lactococcus sp.)菌株命名为乳酸乳球菌psm16，其于2021年7月21日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22933。

2.一种如权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备植酸酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制备植酸酶的方法包括如下步骤：将所述乳酸乳球菌在含有MRS培养基的离心管中进行摇床培养，然后将得到培养基转移至新的MRS培养基中继续培养，在冰箱中冷冻之后进行浓缩，得到的发酵液通过离心后收集上清液，即得到所述的植酸酶。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述摇床培养的温度为30‑37℃，转速为

700‑900rpm，时间为18‑24h；所述继续培养的温度为30‑37℃，转速180‑200rpm，时间为2‑3天。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述冰箱中冷冻的温度为‑70～‑80℃。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液在3‑4℃下以7000rpm‑

8000rpm，8‑10min离心。

7.一种如权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备动物饲料中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物饲料包括动物基础膳食和所述的乳酸乳球菌。

说明书

一株乳酸乳球菌及其在制备植酸酶和动物饲料中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，尤其涉及一株乳酸乳球菌及其在降解植酸领域中的应用。

背景技术

[0002] 微量元素在人和动物的生长、发育和代谢中起着重要作用。微量元素的缺乏和过量会导致病菌过度生长、代谢紊乱和免疫功能障碍。植酸占大多数谷物和蔬菜的种子、根和茎1％‑5％，在畜禽和家禽膳食中，谷物和蔬菜构成了包括矿物质在内的所有营养物质的重要来源。然而，植酸是一种带有六个强负电荷的磷酸糖，由于其具有很强的螯合作用，通常被报道为人和动物的抗营养因子，如植酸具有抑制剂的生物学功能，抑制了钙、镁、锌、铁等微量元素的吸收。此外，植酸还可以与食物蛋白质、消化酶和脂质上的阳离子基团结合，在胃肠道中形成不溶性复合物。由于缺乏肠道植酸酶，内源性分泌的矿物质不能被吸收和重吸收，对单胃动物和人类造成潜在的环境污染和消化问题。

[0003] 为了进一步提高矿物质和蛋白质的生物利用率，植酸水解引起了人们的极大关注。植酸酶，肌醇六磷酸水解酶，是一种能通过五到一磷酸将植酸水解成磷酸盐和肌醇的酶，广泛存在于自然界中，如植物、动物组织和微生物。植酸酶的前两种来源存在活性低和稳定性差的问题，具有植酸酶活性的微生物可能是促进动物矿物质吸收的最有效工具之一。目前的研究发现，产生植酸酶的微生物主要有无花果曲霉、黑曲霉、酵母等真菌和细菌。

[0004] 母乳含有可能影响婴儿终身的生物活性成分，能提供营养，指导婴儿肠道免疫系统的发展，母乳的微生物群是显著影响婴儿健康的因素。而母乳中很少出现产生植酸酶的微生物，在母体饮食中存在的植酸可能会损害母乳中一些矿物质的生物利用率，导致缺乏铁、锌和钙会对婴儿的生长、健康和认知发展产生深远的不利影响。因此，开发寻找一种能够产生植酸酶并有效降解植酸的微生物，对本领域来说具有十分重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一株能够产生植酸酶并有效降解植酸的乳酸乳球菌，并提供该乳酸乳球菌在制备植酸酶中的应用。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

[0007] 一株乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)菌株命名为乳酸乳球菌psm16，其于2021年7月21日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22933。

[0008] 基于一个总的技术构思，本发明还提供一种乳酸乳球菌在制备植酸酶中的应用。

[0009] 在上述的应用中，所述制备植酸酶的方法包括如下步骤：将所述乳酸乳球菌在含有MRS培养基的离心管中进行摇床培养，然后将得到培养基转移至新的MRS培养基中继续培养，在冰箱中冷冻之后在超低温冷冻机上进行浓缩，得到的发酵液通过离心后收集上清液，即得到所述的植酸酶。

[0010] 优选的，所述摇床培养的温度为30‑37℃，转速为700‑900rpm，时间为18‑24h；所述继续培养的温度为30‑37℃，转速180‑200rpm，时间为2‑3天。

[0011] 优选的，所述冰箱中冷冻的温度为‑70～‑80℃。

[0012] 优选的，所述发酵液在3‑4℃下以7000rpm‑8000rpm，8‑10min离心。

[0013] 基于一个总的技术构思，本发明还提供一种乳酸乳球菌在制备动物饲料中的应用，所述动物饲料包括动物基础膳食和所述的乳酸乳球菌。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0015] 1、本发明的乳酸乳球菌psm16，可以制备高酶活性的植酸酶，可以显著升高肝脏中铜(P＝0.021)和锌(P＝0.017)、血清中钙(P＝0.000)、锰(P＝0.000)和锌(P＝0.000)以及肾脏中锰(P＝0.010)和锌(P＝0.022)，而肾脏的铜(P＝0.007)和镁(P＝0.001)显著降低。

[0016] 2、在植酸饮食中引入psm16通过刺激乳酸乳球菌psm16水解可以进一步调节肝脏、肾脏和血清中矿物质的吸收来抵消植酸的有害影响，在制备动物饲料领域具有很好的应用前景。

附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0018] 图1是邻接法构建的相对进化树。

[0019] 图2是四种酸降解菌在改良MRS平板中的应用结果。

[0020] 图3是四株植酸降解菌植酸酶活性的检测。

[0021] 图4是乳酸乳球菌psm16通过结晶紫染色在油镜下状态图。

[0022] 图5是乳酸乳球菌psm16在不同发酵时长的pH值变化图。

[0023] 图6是小鼠盲肠内容物的酸碱度检测结果。

具体实施方式

[0024] 为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

[0025] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

[0026] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

[0027] 以下实施例的乳酸乳球菌(Lactococcus sp.)psm16，其分类命名为乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，其于2021年7月21日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22933。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

[0028] 实施例1：

[0029] 一株乳酸乳球菌(Lactococcus sp.)，命名为乳酸乳球菌psm16，其于2021年7月21日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22933。该乳酸乳球菌psm16的获得过程如下：

[0030] 1、乳酸乳球菌psm16的分离与鉴定

[0031] 1.1化学品和试剂

[0032] 蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、无水乙酸钠、柠檬酸三铵、七水合物硫酸镁水氯化钙、植物钠盐水合物、偏钒酸铵、四水钼酸铵从上海生工生物有限公司购买。植酸、植酸酶从合肥博美生物技术有限公司购买，一水合硫酸锰、六水氯化钴从上海国药化学试剂有限公司购买，D‑(+)‑葡萄糖、3‑(N‑吗啉基)丙磺酸(MOPS)从西格玛奥德里奇购买(美国圣路易斯、密苏里州、美国)。

[0033] 1.2乳酸菌的分离、培养

[0034] 所有母猪乳样品采用富集法和直接平板法分离，接种于De Man、Rogosa和Sharpe(MRS)肉汤(中国海博)中，37℃厌氧培养72h。然后将所有样品进一步划线到MRS琼脂平板上，37℃厌氧培养24h‑48h。挑选白色菌落和球菌菌落，并取100μL细菌涂布在MRS琼脂上以获得纯培养物。MRS培养液在37℃中培养并储存于‑80℃，以50％(v/v)甘油作为冷冻保护剂。

[0035] 根据QIAamp DNA提取试剂盒(Qiagen,Gaithersburg,MD,USA)提供的方案，提取30株菌株的细菌DNA，并使用通用引物27F(5’‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3’)和1492R(5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3')扩增部分16s rRNA基因。获得的聚合酶链反应产物由Sanger公司(中国Sangon生物技术有限公司)测序，并使用基本局部比对搜索工具核苷酸(BLASTN)和对照NCBI核苷酸收集(nr/nt)数据库进行搜索。在物种水平上提取和分类最接近匹配的每个序列。利用MEGA7软件和邻接法构建了该菌株的16s rRNA序列进化树，并进行了进化分析。

[0036] 1.3植酸降解细菌的筛选和鉴定

[0037] 基于之前两步植酸酶法以及适当的修改，在改良的MRS(mMRS)琼脂培养基上筛选植酸降解能力强的菌株。培养基含有1.5％琼脂、1％蛋白胨、0.4％牛肉提取物、0.2％酵母提取物、1％D‑(+)‑葡萄糖、0.82％乙酸钠酐、0.2％柠檬酸铵、0.02％七水硫酸镁、0.0025％一水硫酸锰、2％MOPS、0.2％无水氯化钙和0.25％植酸钠盐水合物作为唯一磷源。后两种盐用0.2μm过滤器无菌过滤后在55℃时加入高压灭菌培养基中。由于植酸沉淀和培养基不透明，透明带的形成是植酸水解的指标。

[0038] 收集上述菌株，并取细胞悬液(8μL of 107‑108CFU/mL)点在mMRS琼脂表面，并在37℃孵育24h‑72h。为了避免酸溶解引起清除区域的假阳性结果，孵育后用双蒸馏水从琼脂表面清洗菌落，并用2％(w/v)氯化钴水溶液浸没平板。在室温下温育5min后，用等体积的6.25％(w/v)钼酸铵溶液和0.42％(w/v)偏钒酸铵溶液代替六水氯化钴。5min后移除钼酸铵和钒酸铵溶液，并检查水解区面积。

[0039] 总共从猪奶样品中获得30株细菌，并在MRS培养基上培养。根据它们的菌落形态和16SrRNA基因序列，尽可能覆盖物种水平的多样性。用MEGA‑X邻接法构建系统进化树(见图
1)，将分离到的30株菌株与BLASTN的参考菌株进行比较，确定相对遗传关系。

[0040] 如图1中，对应于在少于50％的引导复制中再现的分区的分支被折叠(在自举试验中相关分类群聚集在一起的复制树的百分比(1000次重复)显示在分支旁边，而BLAST比对结果显示在旁边，分离细菌的丰度显示在最后一栏)。乳杆菌(11/30)、戊糖片球菌(9/30)和乳球菌(8/30)是分离微生物区系中最丰富的物种，反映了在母猪乳中的主体地位。小种群菌株如乳酸片球菌(1/30)和乳酸明串珠菌(1/30)也显示在系统发育树中。

[0041] 1.4植酸酶的制备与活性测定

[0042] 为进一步鉴定植酸降解菌产酶活性，初步筛选出的各分离物在含有1mLMRS培养基的不同离心管中37℃、900rpm培养24h，然后将50μL培养基转移至10mLMRS培养基中，在37℃、200rpm条件下培养3天。‑80℃冰箱中冷冻过夜，然后在超低温冷冻机上浓缩3倍，发酵液在4℃下以1000g，10min离心，得到的上清液即为植酸酶。

[0043] 测定上清液，每个样品重复三次。在MRS液体培养基中加入商业植酸酶进行相同的操作。植酸酶活性采用植酸酶检测试剂盒(苏州Comin生物技术有限公司)检测。通过测量游离无机磷酸盐来测定植酸酶活性。选择植酸酶产量最高的菌株进行下一步研究。

[0044] 这些菌株通过平板筛选法筛选产生胞外植酸酶，四个菌株显示出降解植酸的能力。如图2所示，菌株psm16降解透明圈最大。如图3所示，植酸酶试剂盒检测到的植酸酶活性最强。通过16S rRNA基因序列与BLASTN参考序列比较，该菌株被命名为乳酸乳球菌psm16。如图4所示，菌株通过结晶紫染色在油镜下为蓝紫色，圆球状。如图5所示，在发酵24h、48h、
72h时，pH值不断降低。

[0045] 2、乳酸乳球菌psm16的动物实验

[0046] 为了评估从母乳筛选的乳酸乳球菌psm16是否可以促进矿物元素的吸收，本实验基于添加和不添加1％植酸的对照组，通过电感耦合等离子体发射光谱仪测定肝脏、肾脏和血浆中的矿物质元素，评价植酸降解细菌有利于小鼠中矿物元素的消化和吸收。

[0047] 2.1实验方法

[0048] 从湖南斯莱克景达实验动物有限公司(中国湖南长沙)购买4周龄雄性昆明小鼠(初始体重，18‑21g)。将小鼠置于受控的环境条件下(温度22±2℃，相对湿度55±2％)，光照/黑暗循环12h。在实验前，所有的动物都适应三天，并且可以自由饮用小鼠饲料和水。给它们喂食标准的商业饲料(江苏协同医药生物工程有限公司)，并显示具体的营养指标(表1)。实验方案由湖南师范大学实验动物管理和使用委员会审查和批准。所有实验均按照相关指南和规定进行。

[0049] 表1.基础饲料的营养指标

[0050]

[0051] 将小鼠(n＝32)随机分成四组，每组8只小鼠，用不同的饮食喂养28天。基础组(BD)饲喂基础膳食，植酸组(PA)饲喂基础膳食并加入1％植酸，植酸酶组(PHY)饲喂基础膳食并加入1％植酸和500U/kg商品植酸酶，菌株组(PA+psm16)饲喂基础膳食并添加1％植酸和1*8 8
10‑2*10CFU乳酸乳球菌psm16，前18天连续灌胃，然后每3天灌胃一次，共21次，直至取样。
在整个实验期间，动物可以自由摄入水和饲料。28天后，将动物禁食12h并处死用于取样。

[0052] 将血样置于含有肝素的塑料管中至少3h，然后在4℃下4000g离心15min以回收血清，并在‑80℃下储存，直到用于矿物平衡测定。采血后，也取出肝脏、肾脏、盲肠(盲肠总重量)称重，并在使用前保存在‑80℃。将盲肠壁冲洗干净、吸干并称重(盲肠壁重量)，盲肠内容物用于短链脂肪酸分析和pH测量。然后在实验期的最后三天，每天收集粪便进行SCFA分析。

[0053] 2.2小鼠生长参数分析

[0054] 测量小鼠的肝、肾、盲肠、盲肠内容物的重量以及大肠(LIL)和小肠(SIL)的长度，并与动物的最终重量进行比较。结果见表3，每天在饮食中添加植酸和饲喂菌株对小鼠的最终体重没有影响。与添加和不添加1％植酸的对照组相比，小鼠口服psm16菌株后的大肠重量、肝脏重量、肾脏重量、盲肠重量和盲肠内容物重量无显著差异。相比之下，psm16菌株的刺激显著增加了盲肠内容物的重量(P<0.045)，添加商品植酸酶对盲肠壁重有深远的影响(P<0.010)(表2)。

[0055] 表2.膳食中添加植酸和菌株对小鼠生长参数的影响(平均值±标准误)

[0056]

[0057] 注：BW组为体重；KW为肾重；LIL组为大肠长度；SIL为小肠长度；CW组为盲肠重；CWW为盲肠壁重；CCW为盲肠内容物重；同一行中不共享同一上标的a‑b值差异显著(p<0.05)。

[0058] 2.3短链脂肪酸和pH分析

[0059] 本发明使用气相色谱法测定短链脂肪酸(SCFA)的浓度。通过在盲肠内容物和粪便上清液(4℃下15000rpm离心15min)、上清液和25％偏磷酸溶液(1∶9)中静置过夜来测定SCFA。然后，混合溶液以15000rpm离心10min，并通过膜过滤器(孔径0.45μm)过滤。使用气相色谱仪(安捷伦科技公司7890B系统，安捷伦，美国)测量SCFA，该系统配备有DB‑FFAP色谱柱(30m×250μm×0.25μm)。载气是氦气(流量0.8mL/min，分流比50:1，取样体积1μL)。烘箱温度、检测器温度和进样器温度分别为220℃、280℃和250℃。聚集扫描为全波扫描，用外标法制作标准曲线，根据标准曲线计算SCFA浓度(mg/g样品)。

[0060] 结果见表3，与基础饮食相比，饲喂植酸的小鼠盲肠和粪便中的SCFA水平发生了变化。食用植酸饲料的小鼠盲肠中丙酸盐、丁酸盐、异戊酸盐、戊酸盐和总SCFA值低于基础组，乙酸显著减少。此外，当小鼠口服psm16菌株时，小鼠盲肠中乙酸盐(P<0.015)、丙酸盐(P<0.014)、丁酸盐(P<0.036)和总SCFA(P<0.009)的浓度显著升高。与植酸组相比，粪便中饲喂植酸和菌株饲料组具有较高的乙酸盐(P<0.034)、丙酸盐(P<0.000)、丁酸盐(P<0.000)和总SCFA(P<0.009)水平。同时，植酸酶组的乙酸盐和总SCFA水平显著增加。

[0061] 表3.菌株和PA对盲肠和粪便中SCFA水平的影响(平均值±标准误，n＝7)

[0062]

[0063]

[0064] 注：同一行中不共享同一上标的a‑c值差异显著(p<0.05)

[0065] 测定盲肠内容物的pH。将样品在4℃下以8000rpm离心1min，然后取0.8μL上清液滴到酸碱度指示剂纸上(pH 5‑9)观察颜色变化。结果见图6，与基础组相比，植酸组盲肠的pH值相对较低，添加psm16菌株后恢复到基础组水平，呈酸性，添加植酸酶后pH值呈弱碱性。

[0066] 2.4矿物质的测量

[0067] 通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP‑OES 5110，安捷伦，美国)研究了小鼠肝脏、肾脏和血清中铜、铁、锌、锰、镁、磷和钙的浓度。公司(SGS‑CSTC标准技术服务有限公司)测定不同膳食组饲料中的微量元素(表4)。如表4所示，不同膳食中的矿物质元素之间没有差异。

[0068] 表4.不同膳食处理组饲料中矿物质元素含量

[0069]

[0070] 用超纯水和超强酸(硝酸、高氯酸)稀释样品，制备标准品。用1mL过氧化氢对肝肾进行脱色。样品在预处理炉中消化后，取约0.2g冷冻碎组织和约0.2mL血浆样品用于实验。分析肝脏、血清和肾脏中钙、镁、锌、磷、铜、锰、铁的水平(见表5、表6、表7)。检测波长分别为Ca(λ＝317.933nm)、Cu(λ＝324.754nm)、Fe(λ＝238.204nm)、Mg(λ＝279.553nm)、Mn(λ＝
257.610nm)、P(λ＝213.618nm)和Zn(λ＝206.200nm)。肝脏、血清和肾脏中金属和微量元素含量的数据以ppm表示。

[0071] 表5.菌株和植酸(PA)对肝脏中微量元素状况的影响(平均值±标准误)

[0072]

[0073]

[0074] 注：同一行中不共享同一上标的a‑b值差异显著(p<0.05)

[0075] 表6.菌株和植酸(PA)对肾脏中微量元素状况的影响(平均值±标准误)

[0076]

[0077] 注：同一行中不共享同一上标的a‑c值差异显著(p<0.05)。

[0078] 表7.菌株和植酸(PA)对血清中微量元素状态的影响(平均值±标准误)

[0079]

[0080]

[0081] 注：同一行中不共享同一上标的a‑c值差异显著(p<0.05)。

[0082] 由表5‑7可知，在饲喂植酸饲料的小鼠肝脏中，铁(P<0.048)和锌的水平低于基础组，而铜(P<0.021)和锌(P<0.017)在口服PSM16菌株时显著上调，植酸酶组铁的含量增加；在肾组织中，植酸显著降低铁(P<0.002)和锰(P<0.010)的含量，灌胃给予psm16也改变了肾脏的矿物质状态：小鼠体内Mn、Zn(P<0.022)显著增加，而Cu(P<0.034)和Mg(P<0.001)的含量显著降低，植酸膳食中添加植酸酶增加了Mn(P<0.010)的含量，降低了Cu(P<0.01)的含量；从血浆中观察到的数据来看，钙(P<0.000)、锰(P<0.000)、锌(P<0.000)的含量因灌胃16而显著增加。同样，植酸酶组钙、锰、锌含量高于植酸组，铜(P<0.040)明显高于基础组。此外，添加植酸后，肾脏和血浆中的P含量较低，添加psm16菌株和植酸酶后，P含量恢复到基本水平，但差异无统计学意义。

[0083] 综上所述，植酸由于其螯合作用而抑制矿物元素的吸收，而添加psm16植酸降解菌可以进一步提高肝脏、肾脏和血浆中矿物质元素的吸收。因此，乳酸乳球菌psm16在制备动物饲料领域具有很好的应用前景。