人C11orf86 mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒

摘要

本发明涉及人C11orf86mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒。本发明首次证实了C11orf86mRNA的异常高表达能够促进肺腺癌细胞的增殖与迁移，并且上调的C11orf86mRNA表达水平与肺腺癌患者总生存期的缩短显著相关。因此本发明以C11orf86mRNA为肺腺癌的生物标志物，提出了C11orf86mRNA在肺腺癌中的用途，尤其是在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。

权利要求

1.人C11orf86 mRNA在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中C11orf86 mRNA为肺腺癌预后评估的生物标志物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C11orf86 mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于评估和预测肺腺癌患者总生存期。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌预后评估产品包括特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对；所述特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；或SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌预后评估产品的检测样本选自细胞或组织。

说明书

人C11orf86 mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及人C11orf86 mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

[0002] 肺癌已成为最常见的人类恶性肿瘤，全球每年新增肺癌确诊病例超过200万。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型，约占肺癌确诊病例的85％，包括肺腺癌、肺鳞癌与大细胞
癌，其中肺腺癌约占原发肺癌的40％，是最常见的非小细胞肺癌。近年来，尽管在肺腺癌早
期诊断与个体化治疗方面取得了一定进展，但是肺癌患者预后仍不理想，五年生存率不足
20％。因此，发现新的与肺腺癌发生、发展密切相关的调控基因，对于进一步探究肺腺癌复
杂的肿瘤生物学特性以及促进肺腺癌临床诊疗策略的发展具有重要意义。

[0003] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种利用碱基互补配对原则，体外特异性扩增目的DNA片段的技术。逆转录‑实时荧光定量PCR包括逆转录合成第一条
cDNA链与实时荧光定量PCR两个环节。逆转录是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成与模
板mRNA互补的cDNA链。实时荧光定量PCR是以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下，特异性合成
上、下游引物之间的目的片段，镶嵌在DNA双链中的荧光信号能够对PCR过程进行实时检测，
根据Ct值可以对目的mRNA进行定量。设计出能够识别目的片段的特异性引物序列是保证目
的mRNA定量准确的重要环节。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了人C11orf86 mRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 人C11orf86 mRNA在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。

[0007] 根据本发明优选的，所述应用中C11orf86 mRNA为肺腺癌预后评估的生物标志物。

[0008] 根据本发明优选的，所述C11orf86 mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

[0009] 根据本发明优选的，所述产品用于评估和预测肺腺癌患者总生存期。

[0010] 根据本发明优选的，所述肺腺癌预后评估产品包括特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质。

[0011] 进一步优选的，所述特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

[0012] 进一步优选的，所述特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；或SEQ ID NO.1所示的上游引物
和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

[0013] 根据本发明优选的，所述肺腺癌预后评估产品的检测样本选自细胞或组织。

[0014] 特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质在肺腺癌预后评估产品中的应用。

[0015] 根据本发明优选的，所述特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

[0016] 进一步优选的，所述特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；或SEQ ID NO.1所示的上游引物
和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

[0017] 一种肺腺癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质。

[0018] 根据本发明优选的，所述特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

[0019] 进一步优选的，所述特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；或SEQ ID NO.1所示的上游引物
和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

[0020] 根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

[0021] 有益效果：

[0022] 1、本发明首次证实了C11orf86 mRNA表达上调能够促进肺腺癌细胞的增殖与迁移，并且上调的C11orf86 mRNA表达水平与肺腺癌患者总生存期的缩短显著相关。因此本发
明以C11orf86 mRNA为肺腺癌的生物标志物，提出了C11orf86 mRNA在肺腺癌中的用途，尤
其是在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。

[0023] 2、本发明设计了特异性扩增C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物对，能够有效检测C11orf86 mRNA的表达水平。

附图说明

[0024] 图1是本发明分析TCGA数据库中肺腺癌RNA测序数据，以59例临近正常肺组织中C11orf86 mRNA相对表达水平为标准，计算524例肺腺癌组织中C11orf86 mRNA相对表达水
平，应用Student’s t检验分析表达差异的统计学意义的示意图。

[0025] 图2是本发明试剂盒检测15对肺腺癌组织与临近正常肺组织中C11orf86 mRNA表达水平，以GAPDH为内参，以临近正常肺组织中C11orf86 mRNA相对表达水平为标准，按照2
‑△△CT
计算癌组织中C11orf86 mRNA相对表达水平，应用Student’s t检验分析组间差异的统
计学意义的示意图。

[0026] 图3是本发明试剂盒检测正常支气管上皮细胞(BEAS‑2B)与3株肺腺癌细胞系(A549、H1650、H1975)中C11orf86 mRNA表达水平，以GAPDH为内参，以BEAS‑2B细胞中
‑△△CT
C11orf86mRNA相对表达水平为标准，按照2 计算3株肺腺癌细胞系中C11orf86 mRNA相
对表达水平，应用Student’s t检验分析组间差异的统计学意义的示意图。

[0027] 图4是应用CCK‑8实验和Transwell实验检测外源性C11orf86 mRNA表达对BEAS‑2B细胞增殖与迁移的影响，应用Student’s t检验分析组间差异的统计学意义的折线图(左)
和柱状图(右)。

[0028] 图5是应用CCK‑8实验和Transwell实验检测siRNA特异性敲低C11orf86 mRNA表达水平对A549细胞增殖与迁移能力的影响，应用Student’s t检验分析组间差异的统计学意
义的折线图(左)和柱状图(右)。

[0029] 图6是应用Kaplan‑Meier Plotter数据库分析C11orf86 mRNA表达水平对肺腺癌患者预后的影响，应用Log‑rank检验C11orf86 mRNA高表达与低表达肺腺癌患者之间预后
差异是否具有统计学意义的示意图。

具体实施方式

[0030] 下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

[0031] 实施例内容是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。

[0032] 人源肺腺癌细胞系A549、H1650、H1975和正常人支气管上皮细胞系BEAS‑2B均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

[0033] 实施例1

[0034] 本发明利用RNA‑seq(Ribo‑free)对肺腺癌组织以及临近正常肺组织标本(各7例)中mRNA进行测序，结果显示在4例肺腺癌肿瘤组织中检测到C11orf86 mRNA表达，在7例临近
正常肺组织中均未检测到C11orf86 mRNA表达，发明人进一步分析了TCGA数据库中肺腺癌
患者RNA测序数据，发现肺腺癌组织中C11orf86 mRNA表达水平相比于临近正常组织显著升
高，具体分析结果如图1所示。

[0035] 具体实施过程如下：

[0036] (1)收集组织样本：收集7对手术切除的肺腺癌标本，肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，液氮速冻，‑80℃保存。7例患者术前
均未接受放化疗，术后病理结果证实为肺腺癌。上述病例收集经过山东大学第二医院医学
伦理委员会批准，并且得到患者知情同意；

[0037] (2)RNA测序：使用Trizol试剂将上述液氮冻存组织裂解，应用苯酚‑氯仿‑异丙醇法提取RNA，使用NanoDrop2000检测所提RNA的浓度与纯度，通过琼脂糖凝胶电泳评估所提
RNA的完整性，取RIN>7的RNA样品进行建库测序，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司用
RNA‑seq(Ribo‑free)技术进行测序；

[0038] (3)生物信息学分析：分析测序所得原始数据，依次进行质量评估，剔除低质量序列，与参考基因组进行比对，进行差异表达分析，按照(Log2 Fold change>2，p value<
0.05)或者(Log2 Fold change<‑2，p value<0.05)标准筛选差异表达mRNA；

[0039] 结果显示，在7例临近正常肺组织中均未检测到C11orf86 mRNA表达，但是在4例肺腺癌肿瘤组织中检测到C11orf86 mRNA表达；

[0040] 鉴于上述发现，本发明人继续分析了TCGA数据库中肺腺癌RNA测序数据，其中肺腺癌组织524例，临近正常肺组织59例，生物信息学分析结果显示，与临近正常肺组织相比，肺
腺癌组织中C11orf86 mRNA表达水平显著升高。

[0041] 实施例2

[0042] 收集15对手术切除的肺腺癌组织与临近正常组织标本，提取总RNA，应用本发明中特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物序列进行实时荧光定量PCR检测上述样
本中C11orf86 mRNA表达水平，结果显示，肺腺癌组织中C11orf86 mRNA表达水平与临近正
常组织相比显著升高，具体分析结果如图2所示。

[0043] 具体实施过程如下：

[0044] (1)收集组织样本：收集15对手术切除的肺腺癌标本，肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常肺组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，液氮速冻，‑80℃保存。15例患者
术后病理结果证实为肺腺癌，且术前均未接受放化疗。上述病例收集经过山东大学第二医
院医学伦理委员会批准，并且得到患者知情同意。

[0045] (2)提取组织总RNA：使用RNA‑Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)从肺腺癌组织及临近正常肺组织中提取总RNA，提取方法严格按照说明书内所述步骤进行，通过琼
脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，使用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度。

[0046] (3)RT‑qPCR：使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)先去TM
除基因组DNA，再逆转录合成cDNA，具体按照说明书步骤进行，使用Power SYBR  Green PCR
预混液(Thermo Fisher Scientific，4367659)以及本发明中如SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ 
‑ΔΔCT
NO.3的特异性引物分别进行荧光定量PCR，以GAPDH为内参，使用2 方法计算C11orf86 
mRNA相对表达水平，结果显示，相比于临近正常肺组织，肺腺癌组织中C11orf86mRNA表达水
平显著升高。

[0047] 其中，引物对的核苷酸序列如下：

[0048] 上游引物#1：5’‑CACAGAGCAGCTGATCCAA‑3’(SEQ ID NO.1)

[0049] 下游引物#1：5’‑GCTCTCCCACCTTCTTCTTAC‑3’(SEQ ID NO.2)

[0050] 下游引物#2：5’‑CACCTTCTTCTTACCTGCTGT‑3’(SEQ ID NO.3)

[0051] 基因组DNA去除体系：RNA(250ng/μL)2μL，5×gDNA Buffer 2μL，RNase‑Free ddH2O6μL；反应条件：42℃孵育3分钟，置于冰上备用。

[0052] 逆转录PCR体系：10×lnR RT Buffer 2μL，lnR RT Enzyme Mix 1μL，lnR‑RT Primer Mix2μL，RNase‑Free ddH2O 5μL，基因组DNA去除体系产物10μL；反应条件：42℃孵
育15分钟，95℃孵育3分钟，4℃保存备用。

[0053] 实时荧光定量PCR体系：逆转录体系产物1μL，Power SYBRTM Green PCR预混液5μL，引物稀释液(1μM)1μL，RNase‑Free ddH2O 3μL。反应条件：95℃孵育10分钟；95℃孵育15秒，
60℃孵育30秒，共40循环；95℃孵育15秒，60℃孵育60秒，95℃孵育15秒。

[0054] 上述试剂均来自lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)与TM
Power SYBR  Green PCR预混液试剂盒(Thermo Fisher Scientific，4367659)。

[0055] 实施例3

[0056] 应用本发明中如SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3所示的特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物序列，分别检测正常支气管上皮细胞(BEAS‑2B)与3株肺腺癌细
胞系(A549、H1650、H1975)中C11orf86 mRNA的表达水平，结果显示，与BEAS‑2B细胞相比，
A549、H1650以及H1975细胞中C11orf86 mRNA表达水平显著上调，具体分析结果如图3所示。

[0057] 具体实施过程如下：

[0058] (1)提取细胞总RNA：使用RNA‑Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)，从正常人气管上皮细胞(BEAS‑2B)与3株肺腺癌细胞(A549、H1650、H1975)中提取总RNA，通过琼
脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，使用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度。

[0059] (2)RT‑qPCR：使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)，先去除基因组DNA，再逆转录合成cDNA，具体按照说明书步骤进行，使用本发明中如SEQ NO.1、
TM
SEQ NO.2和SEQ NO.3所示的特异性引物以及Power SYBR  Green PCR预混液(Thermo 
‑ΔΔCT
Fisher Scientific，4367659)分别进行荧光定量PCR，以GAPDH为内参，使用2 方法计算
C11orf86 mRNA相对表达水平，结果显示，3株肺腺癌细胞系中C11orf86 mRNA表达水平相比
于BEAS‑2B细胞显著上调。

[0060] 具体PCR体系同实施例2。

[0061] 实施例4

[0062] 应用慢病毒构建外源性C11orf86 mRNA稳定表达的BEAS‑2B细胞株，应用CCK‑8实验和Transwell实验检测外源性C11orf86 mRNA表达对BEAS‑2B细胞增殖与迁移的影响，结
果显示，增加C11orf86 mRNA表达能够显著增强BEAS‑2B细胞的增殖与迁移能力，具体结果
如图4所示。

[0063] 具体实施过程如下：

[0064] (1)构建外源性C11orf86 mRNA稳定表达的BEAS‑2B细胞株：C11orf86质粒及空载体质粒由北京擎科生物科技公司合成。使用Lipo293转染试剂(Beyotime，C0521)将PMD2G、
PSPAX2以及C11orf86质粒或者空载体质粒转染到293T细胞中，48小时后收集培养基，使用
0.45μm滤膜进行过滤，向滤液中加入5×PEG8000溶液，4℃放置过夜后离心，保留沉淀，使用
无血清DMEM培养基重悬慢病毒沉淀。用所得慢病毒感染BEAS‑2B细胞，并用含嘌呤霉素(1μ
g/mL)的培养基筛选耐药细胞株，即可获得外源性C11orf86 mRNA稳定表达的BEAS‑2B细胞
株(BEAS‑2B‑C11orf86)与稳定表达空载体细胞株(BEAS‑2B‑Vector)。

[0065] (2)验证BEAS‑2B‑C11orf86与BEAS‑2B‑Vector细胞中C11orf86 mRNA表达水平：使用RNA‑Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)提取上述细胞总RNA，使用lnRcute 
TM
lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)进行逆转录合成cDNA，使用Power SYBR  
Green PCR预混液(Thermo Fisher Scientific，4367659)以及本发明中如SEQ NO.1、SEQ 
NO.2和SEQ NO.3所示特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物序列分别进行荧光
‑ΔΔCT
定量PCR，以GAPDH为内参，使用2 方法计算C11orf86 mRNA相对表达水平。

[0066] (3)CCK‑8实验：当细胞生长密度达到约80％时，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，离心保留细胞沉淀，加入新鲜培养基重悬细胞，细胞计数并调整细胞浓度至15,000个/mL培养
基，吸取100μL上述细胞悬液加入到每个培养孔(96孔板)，每种细胞设置6个复孔，每隔24小
时向每孔加入10μL CCK‑8试剂(TargetMol，C0005)，将96孔板置于37℃孵箱内孵育1小时，
使用酶标仪测量并记录450nm的吸光度值。

[0067] (4)Transwell实验：当细胞生长密度达到约80％时，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用无血清DMEM培养基制备细胞悬液，细胞计数并调整细胞浓度至100,000个/mL培养
基,向24孔板中的每孔加入600μL完全培养基，并且将Transwell小室(Corning，3422)置于
24孔板内，避免产生气泡，吸取200μL上述细胞悬液加入到小室内，将小室内的细胞置于37
℃孵育箱培养48小时，弃掉培养基，使用4％多聚甲醛室温下固定小室外侧面穿孔细胞15分
钟，PBS清洗一遍，使用甲醇室温下处理细胞25分钟，使用0.1％的结晶紫染色30分钟，用棉
签仔细刮掉小室内面未穿孔的细胞，使用倒置显微镜观察穿孔细胞并计数。

[0068] 实施例5

[0069] 使用siRNA技术特异性敲低A549细胞中C11orf86 mRNA表达水平，应用CCK‑8实验和Transwell实验检测C11orf86 mRNA表达水平下调对A549细胞增殖与迁移的影响，结果显
示，C11orf86 mRNA表达下调显著抑制了A549细胞的增殖与迁移能力，具体结果如图5所示。

[0070] 具体实施过程如下：

[0071] (1)使用siRNA技术特异性敲低A549细胞C11orf86 mRNA表达水平：使用RNAi Designer网站设计特异性干扰C11orf86 mRNA表达的C11orf86 siRNA并由北京擎科生物科
技公司合成。

[0072] 其中，所述C11orf86 siRNA靶向核苷酸序列为：5’‑atgattctatgaaggtttaga‑3’；

[0073] (2)将C11orf86 siRNA或者阴性对照(si‑NC)转染到A549细胞中并检验其敲低效率：使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778‑150)转染试剂将
C11orf86siRNA或者si‑NC转染到A549细胞中，转染后24小时，使用RNA‑Quick 
Purification Kit(上海奕杉，RN001)提取上述细胞总RNA，使用lnRcute lncRNA cDNA第一
TM
链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)进行逆转录合成cDNA，使用Power SYBR  Green PCR预混液
(Thermo Fisher Scientific，4367659)以及本发明中如SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3所
示特异性识别C11orf86 mRNA逆转录产物cDNA的引物序列分别进行荧光定量PCR，以GAPDH
‑ΔΔCT
为内参，使用2 方法计算C11orf86相对表达水平。

[0074] (3)CCK‑8实验：使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778‑150)转染试剂将C11orf86 siRNA或者si‑NC转染到A549细胞中，24小时后收集细胞
并制备细胞悬液，调整细胞浓度至20,000个/mL培养基,吸取上述细胞悬液(100μL/孔)加入
96孔板中，每种细胞设置6个复孔，每隔24小时向每孔加入10μL CCK‑8试剂(TargetMol，
C0005)，在37℃孵箱中放置1小时，使用酶标仪测量并记录450nm的吸光度值。

[0075] (4)Transwell实验：使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778‑150)转染试剂将C11orf86 siRNA或者si‑NC转染到A549细胞中，转染后24小时，使用
胰蛋白酶消化收集细胞，使用无血清培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至100,000个/mL
培养基，将Transwell小室(Corning，3422)放入24孔板中(含600μL完全培养基/孔)，吸取
200μL上述细胞悬液加入到小室内，37℃孵箱培养48小时，使用4％多聚甲醛室温下固定细
胞15分钟，甲醇处理细胞25分钟，然后使用0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签小心刮掉小室
内面未穿孔的细胞，显微镜下观察穿孔细胞并记计数。

[0076] 实施例6

[0077] 应用Kaplan‑Meier Plotter数据库分析C11orf86 mRNA表达水平对肺腺癌患者预后的影响，结果显示：与C11orf86 mRNA低表达的肺腺癌患者预后相比，C11orf86 mRNA高表
达的肺腺癌患者的总生存期显著缩短，具体结果如图6所示。

[0078] 具体实施过程如下：

[0079] 在Kaplan‑Meier Plotter数据库中下载肺腺癌患者预后信息以及C11orf86 mRNA相对表达水平，肺腺癌患者共672例，应用Kaplan‑Meier法分析C11orf86 mRNA高、低表达患
者的预后差异，其中C11orf86 mRNA高表达242例，中位生存期79.87个月；C11orf86 mRNA低
表达430例，中位生存期119.87个月，应用Log‑rank检验分析组间生存差异的统计学意义，
显示P值小于0.0001。

[0080] 以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护
范围之内。