一种治疗肝纤维化的中药组合物、其制备方法和应用

摘要

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种治疗肝纤维化的中药组合物、其制备方法和应用。组合物经各原料的合理配伍、相互作用，能够显著抑制促纤维化因子COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因的表达，从而抑制HSC的活化并减少细胞外基质的生成，发挥抗肝纤维化的功效，可应用于肝纤维化、肝硬化疾病的治疗或辅助治疗。

权利要求

1.一种治疗肝纤维化的中药组合物，其特征在于，由绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸和椿皮组成；

各原料的重量份数为：

绵马贯众10‑15份、洋金花3‑10份、丁香3‑10份、鸦胆子3‑10份、山白芷10‑40份，猪牙皂

3‑10份，木蝴蝶3‑10份，零陵香10‑20份，吴茱萸5‑10份和椿皮10‑15份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，各原料的重量份数为选自以下其中一种：绵马贯众10份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷10份，猪牙皂10份，木蝴蝶

10份，零陵香10份，吴茱萸10份和椿皮10份；

或绵马贯众11份、洋金花9份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷35份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香20份，吴茱萸5份和椿皮12份；

或绵马贯众10份、洋金花3份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷10份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香10份，吴茱萸5份和椿皮10份；

或绵马贯众15份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷40份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香20份，吴茱萸10份和椿皮15份。

3.一种用于治疗肝纤维化的中药提取物，由权利要求1 2任一项所述的中药组合物提~取获得。

4.权利要求3所述的中药提取物的制备方法，其特征在于，包括：将绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸和椿皮以乙醇水溶液进行回流提取，提取液浓缩、干燥，得到所述中药提取物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述回流提取为索氏回流提取。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积分数为90%。

7.权利要求1 2任一项所述的中药组合物、权利要求3所述的中药提取物或权利要求4~ ~

6任一项所述的制备方法制得的中药提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化的药物中的应用。

8.一种用于治疗肝纤维化的药物，其特征在于，包括权利要求1 2任一项所述的中药组~合物、权利要求3所述的中药提取物或权利要求4 6任一项所述的制备方法制得的中药提取~物。

说明书

一种治疗肝纤维化的中药组合物、其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种治疗肝纤维化的中药组合物、其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 肝纤维化是多种慢性肝病进展过程中的重要病理阶段，是肝脏对各种慢性损伤后持续进行伤口愈合反应的结果，主要表现为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)异常增生与沉积，伴随肝实质细胞的坏死和凋亡。持续存在的肝损伤导致肝脏结构异常，肝实质被瘢痕组织取代，形成肝硬化，甚至发展成为肝癌、肝衰竭。这不仅严重影响患者的生存质量和预后水平，同时加重了社会经济负担，是不可忽视的公共卫生问题。目前，西医学抗肝纤维化的治疗主要是针对原发病病因治疗和抗炎保肝类治疗，尚无明确可用于临床的抗肝纤维化化学或生物药物。

[0003] 肝星形细胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)的活化是肝纤维化发生发展的核心环节，肝脏在受到持续的损伤后，HSC被激活并转化成为肌成纤维样细胞。α‑平滑激动蛋白(α‑Smooth Muscle Actin,α‑SMA)被认为是肌成纤维细胞的特异性标志物，激活的HSC显著表达α‑SMA，同时分泌和释放大量的促纤维化细胞因子，如转化生长因子β‑1(Transforming GrowthFactorβ1,TGFβ1)、Toll样受体等，这些细胞因子进一步刺激了HSC的激活和增殖，合成并分泌大量ECM，ECM的主要成分是胶原蛋白，纤维化发生时过度沉积的ECM中以Ⅰ型胶原蛋白(Type Ⅰ Collagen,COLⅠ)、III型胶原蛋白(Type III Collagen,COL III)为主。ECM的产生远远大于降解并在窦间隙沉积，导致肝窦内皮窗口消失，形成肝窦毛细血管化，肝细胞与血流之间的营养物质交换不能正常进行，肝细胞凋亡，肝小叶内炎性坏死，继而发生肝纤维化。

[0004] 现有中药抗肝纤维化的研究方剂虽较多，但方剂作用研究机制阐述不够清晰，且研究往往针对于某单味药，存在一定局限性，整体研究不够系统与深入，而且治疗肝纤维化的效果也不理想。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种抗肝纤维化的中药组合物、其制备方法和应用。该中药组合物能够显著抑制促肝纤维化因子COL1A1，COL3A1，TGFβ1基因的表达，具有潜在抗肝纤维化的功效，以期应用于肝纤维化、肝硬化疾病的治疗或辅助治疗。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供一种治疗肝纤维化的中药组合物，包括绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸和椿皮。

[0008] 一些实施方案中，所述中药组合物中各原料的重量份数为：

[0009] 绵马贯众10‑15份、洋金花3‑10份、丁香3‑10份、鸦胆子3‑10份、山白芷10‑40份，猪牙皂3‑10份，木蝴蝶3‑10份，零陵香10‑20份，吴茱萸5‑10份和椿皮10‑15份。

[0010] 一些具体实施例中，所述中药组合物中各原料的重量份数为：

[0011] 绵马贯众10份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷10份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香10份，吴茱萸10份和椿皮10份。

[0012] 一些具体实施例中，所述中药组合物中各原料的重量份数为：

[0013] 绵马贯众11份、洋金花9份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷35份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香20份，吴茱萸5份和椿皮12份。

[0014] 一些具体实施例中，所述中药组合物中各原料的重量份数为：

[0015] 绵马贯众10份、洋金花3份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷10份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香10份，吴茱萸5份和椿皮10份。

[0016] 一些具体实施例中，所述中药组合物中各原料的重量份数为：

[0017] 绵马贯众15份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷40份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香20份，吴茱萸10份和椿皮15份。

[0018] 本发明还提供一种中药提取物，由本发明所述的中药组合物提取获得。

[0019] 所述中药提取物的制备方法，包括：将绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸和椿皮以乙醇水溶液进行回流提取，提取液浓缩、干燥，得到所述中药组合物。

[0020] 在上述中药提取物的制备方法中，各原料可以先混合再提取，也可分别提取后再混合，对此没有特殊要求。

[0021] 所述回流提取为索氏回流提取。

[0022] 所述乙醇水溶液的体积分数为90％。

[0023] 本发明还提供了所述中药组合物、所述中药提取物或所述的制备方法制得的中药提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化的药物中的应用。

[0024] 本发明还提供了所述中药组合物、所述中药提取物或所述的制备方法制得的中药提取物在制备调控肝纤维化因子基因表达、抑制HSC活化、减少细胞外基质生成的制剂中的应用。

[0025] 具体的，所述调控纤维化因子基因表达具体为：COL1A1,COL3A1,TGFβ1为促肝纤维化因子，本发明中药组合物能够通过下调COL1A1,COL3A1,和TGFβ1基因的表达，从而抑制HSC活化、减少细胞外基质生成。

[0026] 本发明还提供一种药物，包括本发明所述的中药组合物、所述中药提取物或所述的制备方法制得的中药提取物。

[0027] 所述药物还包括药学上可接受的辅料。本领域技术人员可加入制备不同剂型所需的各种常用辅料，以常规制剂的制备方法，制成常用的各种制剂，如注射剂、汤剂、丸剂或片剂。

[0028] 本发明中药组合物由绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸和椿皮组成。所述组合物经各原料的合理配伍、相互作用，能够显著抑制促纤维化因子COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因的表达，从而抑制HSC的活化并减少细胞外基质的生成，发挥抗肝纤维化的功效，可应用于肝纤维化、肝硬化疾病的治疗或辅助治疗。

附图说明

[0029] 图1示各单药对TGFβ1基因表达的影响；

[0030] 图2示实施例1的中药组合物对关键基因表达的调控结果；

[0031] 图3示实施例2的中药组合物对关键基因表达的调控结果；

[0032] 图4示对比例1与实施例1的中药组合物对关键基因表达的调控结果。

具体实施方式

[0033] 本发明提供了一种治疗肝纤维化的中药组合物，其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0034] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0036] 实施例1

[0037] 该中药组方由如下重量的组分组成：

[0038] 绵马贯众10份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷10份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香10份，吴茱萸10份和椿皮10份。

[0039] 中药组方的制备方法：将配方绵马贯众、洋金花、丁香、鸦胆子、山白芷、猪牙皂、木蝴蝶、零陵香、吴茱萸、椿皮，粉碎各称10份粉末，加15倍体积的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液浓缩20min至体积为2mL，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于DMSO中制成提取物母液，‑20℃保存。

[0040] 实施例2

[0041] 该中药组方由如下重量的组分组成：

[0042] 绵马贯众11份、洋金花9份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷35份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香20份，吴茱萸5份和椿皮12份。

[0043] 中药组方的制备方法：将配方分别称量绵马贯众11份、洋金花9份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷35份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香20份，吴茱萸5份和椿皮12份粉末，加15倍体积的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液浓缩20min至体积为2mL，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于DMSO中制成提取物母液，‑20℃保存。

[0044] 实施例3

[0045] 该中药组方由如下重量的组分组成：

[0046] 绵马贯众10份、洋金花3份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷10份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香10份，吴茱萸5份和椿皮10份。

[0047] 中药组方的制备方法：将配方分别称量绵马贯众10份、洋金花3份、丁香3份、鸦胆子3份、山白芷10份，猪牙皂3份，木蝴蝶3份，零陵香10份，吴茱萸5份和椿皮10份粉末，加15倍体积的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液浓缩20min至体积为2mL，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于DMSO中制成提取物母液，‑20℃保存。

[0048] 实施例4

[0049] 该中药组方由如下重量的组分组成：

[0050] 绵马贯众15份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷40份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香20份，吴茱萸10份和椿皮15份。

[0051] 中药组方的制备方法：将配方分别称量绵马贯众15份、洋金花10份、丁香10份、鸦胆子10份、山白芷40份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香20份，吴茱萸10份和椿皮15份粉末，加15倍体积的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液浓缩20min至体积为2mL，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于DMSO中制成提取物母液，‑20℃保存。

[0052] 对比例1

[0053] 该中药组方由如下重量的组分组成：

[0054] 绵马贯众10份、洋金花10份、丁香10份、山白芷10份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香10份和吴茱萸10份。

[0055] 中药组方的制备方法：将配方分别称量绵马贯众10份、洋金花10份、丁香10份、山白芷10份，猪牙皂10份，木蝴蝶10份，零陵香10份和吴茱萸10份粉末，加15倍体积的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液浓缩20min至体积为2mL，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于DMSO中制成提取物母液，‑20℃保存。

[0056] 实施例5

[0057] 利用HTS2(High‑Throughput Screening by High‑Throughput Sequencing,HTS2)技术，基于LX‑2细胞检测各单药提取物对TGFβ1基因的表达影响，具体实验过程为：

[0058] 1.LX‑2细胞以2500个/孔铺于384孔板中，待24h细胞贴壁生长后，药物处理孔加入终浓度为100μg/mL的中药提取物，空白对照组加入相应体积溶剂，每组均设置3个复孔。37℃孵育24h后，细胞被裂解处理；

[0059] 2.利用高通量移液平台，在细胞裂解液中，进行RNA退火反应，使探针结合到mRNA上，通过磁珠捕获法获得相应的mRNA，使用T4连接酶将互补至mRNA的成对探针连接起来，洗脱后进行PCR扩增建库，最后于Illumina Xten平台完成测序。

[0060] 3.数据处理：运用R包DESeq2计算基因的P值和差异表达倍数值(Fold Change,FC)，对FC值取log2对数，|log2FC|>0.58且P<0.05的基因被认为是差异表达基因。log2FC＞0，为基因表达上调，log2FC＜0为基因表达下调，实验结果见表1和图1。

[0061] 表1中药组合物中各单药对TGFβ1基因表达的影响

[0062]

[0063] 结果显示，中药组合物中各数单药的提取物均能显著下调TGFβ1基因表达。肝纤维化发生发展的关键环节是HSC的活化，TGFβ1是能够反应HSC活化的典型基因。实验结果提示中药组合物各单药能够通过下调TGFβ1基因的表达，从而发挥抑制HSC活化的功能。

[0064] 实施例6

[0065] 利用qPCR技术，考察实施例1、2和对比例1的中药组合物对COL1A1，COL3A1和TGFβ1基因的表达影响，具体实验过程为：(以LX‑2细胞为例)

[0066] 1.LX‑2细胞以20万/孔铺于12孔板中，待24h细胞贴壁生长后，加入终浓度为10ng/μl TGFβ1与50μg/mL的中药组合物提取物，同时设置溶剂对照组，共处理细胞48h；

[0067] 2.利用试剂盒提取RNA并反转为cDNA。

[0068] 3.qPCR反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。

[0069] 其中，引物序列为：

[0070]

[0071] 4.数据处理：以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。qPCR六次实验结果见表2和图2～4(**，为与诱导组相比p<0.01；#，为与实施例1组相比p＜0.05；##，为与实施例1组相比p＜0.01。)

[0072] 表2中药组合物的qPCR结果

[0073]

[0074] qPCR结果显示，本发明中药组合物抗纤维化方能够下调COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因的表达。肝星形细胞的活化是肝纤维化发生的关键环节，活化的肝星形细胞会转化为肌成纤维样细胞并高表达TGFβ1。细胞外基质的主要成分是胶原蛋白，肝纤维化发生时，过度沉积的细胞外基质中胶原蛋白主要为I型和III型胶原蛋白，检测基因COL1A1,COL3A1够反应I型和III型胶原蛋白的表达情况。实验结果提示，本发明中药组合物能够通过下调COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因的表达，从而抑制肝星形细胞的活化，减少细胞外基质的生成。

[0075] 本发明中药组合物抗纤维化方实施例1～2组与对比例1组均能够下调COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因的表达。实施例1～2组为中药组合物完整方，对比例1为中药组合物缺君药鸦胆子、佐药椿皮，实验结果提示实施例组1～2对COL1A1,COL3A1,TGFβ1基因表达的调控效果优于对比例1，体现了中药组合物中药配伍、协调发挥抗肝纤维化、肝硬化作用的特点。

[0076] 以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明所保护的中药组合物均可以达到以上相同或相近的肝纤维化、肝硬化疾病的治疗或辅助治疗的效果。在不脱离本发明原理的前提下，在本发明中药组合物的基础上还可以作出若干改进、调整或润饰，这些也应视为本发明的保护范围。