一种酵母及其应用

摘要

本发明涉及微生物发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一种酵母，其适用于酱油发酵生产，并能显著提高酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或β‑苯乙醇的含量。本发明还涉及所述酵母菌在酱油或酱（例如，低盐或减盐的酱油或酱）生产中的用途。此外，本发明还涉及一种制备酱油或酱（例如，低盐或减盐的酱油或酱）的方法，其包括在酱醪发酵过程中加入本发明的酵母。

权利要求

1.一种Wickerhamiella versatilis菌株ZB435，其于2021年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：61755，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.一种提高低盐或减盐的酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或β‑苯乙醇含量的方法，其包括在酱醪发酵过程中添加权利要求1所述的菌株ZB435。

3.一种制备低盐或减盐的酱油或酱的方法，其包括在酱醪发酵过程中添加权利要求1所述的菌株ZB435。

4.权利要求2或3所述的方法，其中，所述方法为低盐稀态发酵。

5.权利要求4所述的方法，其中，在酱醪发酵的第20‑40天将所述菌株ZB435添加到酱醪中。

6.权利要求4所述的方法，其中，将酱醪在第一温度下进行发酵，并随后在第二温度下进行发酵；其中，所述第一温度为20‑30℃，所述第二温度为25‑35℃。

7.一种培养权利要求1所述的菌株ZB435的方法，其包括将所述菌株ZB435接种于麦芽汁培养基并在有氧条件下进行培养的步骤。

8.权利要求7所述的方法，其中，所述方法包括：将所述菌株ZB435接种于含有5%‑15%的NaCl的麦芽汁培养基，并在25‑40℃的温度及有氧条件下进行培养。

说明书

一种酵母及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一种酵母，其适用于酱油发酵生产，并能显著提高酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或β‑苯乙醇的含量。本发
明还涉及所述酵母菌在酱油或酱（例如，低盐或减盐的酱油或酱）生产中的用途。此外，本发
明还涉及一种制备酱油或酱（例如，低盐或减盐的酱油或酱）的方法，其包括在酱醪发酵过
程中加入本发明的酵母。

背景技术

[0002] 酱油是居家不可或缺的调味品，但饮食中每日摄入盐分的19%左右来自于酱油。由于较高盐分的摄入会引发高血压、心血管疾病等潜在危险，因此随着消费者健康意识增强，
人们对低盐/减盐酱油的消费需求日益增加，可见食用低盐/减盐发酵酱油已成为一种趋
势。

[0003] 目前通常采用低盐固态发酵或高盐稀态发酵降盐的方式来获得低盐/减盐发酵酱油。低盐固态发酵酱油，采用原料总质量的1.1‑1.2倍的10%‑12%盐水落黄，同时保持发酵温
度在40℃以上，发酵周期在1个月以内，生产成本较低，但由于发酵温度较高、发酵时间较
短，微生物无法有效参与到酱油的风味发酵，生产出来的酱油口味单一、风味不佳、鲜味不
足、口感偏酸，酱油风味品质较差，不能满足大众需求。高盐稀态酱油工艺中，采用混合原料
总质量的1.8‑2.2倍的18％‑22％盐水落黄，自然发酵，但由于高盐会极大程度地抑制蛋白
质活性，导致其相较于低盐发酵的周期较长，一般为2‑6个月。在自然温度发酵环境下，酱油
发酵的主要菌群酵母等微生物得到充分生长，使得高盐稀态酱油滋味更加醇厚、味道鲜美、
香气更加丰富，深得大家喜欢。为了获得滋味、风味好的低盐酱油，国内外在以高盐稀态酱
油工艺的基础上进行低盐酱油的开发。

[0004] 目前围绕高盐稀态工艺进行低盐酱油的开发，主要是从以下几个方面展开：1）利用电渗析设备脱盐，可获得低盐酱油，但成本较高，同时电渗析会带走部分酱油的风味及香
气物质，品质稍有降低；2）利用常温浓缩设备对高盐酱油进行浓缩，使得酱油盐分在饱和状
态下析出，然后将析出盐分除去后，补加一定水量获得低盐酱油，同样是成本高，且酱油风
味发生较大改变，品质下降；3）直接对高盐酱油加水稀释获得低盐酱油，此方法成本较低，
但酱油的口感及风味发生明显改变，品质显著下降；4）对高盐稀态工艺进行改进，降低发酵
酱油盐分到12%及以下（以下称为低盐稀态），此工艺控制不佳会导致发酵获得的低盐酱油
口感偏酸、风味单薄、香气偏弱、鲜味不足，但相对而言该种方式获得的酱油，成本较低、整
体质量较佳。因此，为了获得高品质的低盐发酵酱油，需要重点解决低盐酱油风味、香气及
鲜味不足的问题。

发明内容

[0005] 本申请的发明人经过大量筛选获得了一种Wickerhamiella versatilis菌株ZB435，该菌株能够显著提升酱油或酱中的4‑乙基愈创木酚含量，提升愉悦香气物质诸如β‑
苯乙醇、乙酸异戊酯、3‑甲硫基丙醇等的比例，并能提升酱油中的谷氨酸的含量进而提升酱
油鲜味，其对酸味也有一定的改善效果。此外，该菌株发酵过程中会提升酱油中乙醇含量，
从而提升酱油香气及防腐力，因此其对提高酱油或酱的整体香气及风味有良好的应用效
果。基于此，本发明人开发了新的用于制备酱油或酱的菌株以及基于该菌株的制备酱油或
酱的方法。

[0006] 本申请提供的Wickerhamiella versatilis菌株ZB435耐盐范围广，不仅在5%低盐分的环境中具有较好的生长能力，而且在高盐环境如在20%盐分的环境中仍可正常生长，甚
至在25%盐分的环境中仍有一定的生长能力，不仅适用于低盐或减盐酱油的发酵生产，也适
用于常规的高盐酱油的发酵生产。通过在酱醪发酵时添加ZB435，能显著提升酱油中包括4‑
乙基愈创木酚、醇类、谷氨酸等物质的含量，改善酱油香气浓郁度低、鲜味口感缺失、酱香风
味不足的问题，其对乙醇含量的提升，除了能够改善酱油香气，对酱油防腐力的提升也有一
定的助益。此外，ZB435的添加对酱油鲜味的提升和咸味的缓和也有显著的效果。

[0007] 因此，在一个方面，本发明提供了一种Wickerhamiella versatilis菌株ZB435，其于2021年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61755，保藏地址
为广州市先烈中路100号大院59号楼。

[0008] 在另一个方面，提供了本发明的菌株ZB435在制备酱油或酱中的用途，还提供了菌株ZB435用于提高酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或β‑苯乙醇含量的用途。

[0009] 在另一个方面，提供了本发明的菌株ZB435在制备低盐或减盐的酱油或酱中的用途，还提供了菌株ZB435用于提高低盐或减盐的酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或
β‑苯乙醇含量的用途。

[0010] 在另一个方面，本发明提供了一种提高酱油或酱中4‑乙基愈创木酚、谷氨酸和/或β‑苯乙醇含量的方法，以及一种制备酱油或酱的方法。所述方法包括在酱醪发酵过程中加
入本发明的菌株ZB435。在某些实施方案中，所述酱油或酱是低盐或减盐的酱油或酱。

[0011] 在某些实施方案中，所述方法为低盐固态发酵、高盐稀态发酵或低盐稀态发酵。

[0012] 在某些实施方案中，所述方法包括将原料与盐水混合以落黄，将盐水落黄后的酱醪进行发酵，并在发酵过程向所述酱醪中加入所述菌株ZB435。

[0013] 在某些实施方案中，所述方法为低盐稀态发酵，其中采用混合原料总质量的1.8‑2.2倍的盐水（例如食盐含量低于18%，例如12%‑18%，12%‑15%，15%‑18%，14%‑16%，例如约
15%）落黄并发酵，经所述低盐稀态发酵获得的酱油的食盐含量不高于12%。

[0014] 在某些实施方案中，在酱醪发酵第20‑40天（例如第25‑35天，例如第30天），将所述菌株ZB435添加到上述酱醪中并继续发酵。

[0015] 在某些实施方案中，酱醪发酵持续80‑100天（例如85‑95天，例如90天）。

[0016] 在某些实施方案中，所述菌株ZB435的加入量为104 106 个/g（例如 105 个/g）。~

[0017] 在某些实施方案中，所述低盐稀态发酵包括：将盐水落黄后的酱醪在第一温度下进行发酵，随后在第二温度下继续发酵。在某些实施方案中，在第二温度下发酵的过程中加
入所述菌株ZB435。

[0018] 在某些实施方案中，所述第一温度和第二温度选自25‑40°C（例如25‑35°C），并且所述第二温度高于第一温度。在某些实施方案中，所述第一温度为20‑30℃（例如，25°C）。在
某些实施方案中，所述第二温度为25‑35℃（例如，30°C）。

[0019] 在某些实施方案中，在第一温度下发酵持续10‑30天，例如15‑25天，例如20天。在某些实施方案中，在第二温度下发酵持续60‑100天，60‑90天，60‑80天，65‑75天，例如70天。

[0020] 在某些实施方案中，落黄温度为15‑25℃（例如15‑20°C；例如，18°C）。

[0021] 在某些实施方案中，所述菌株ZB435经预培养。在某些实施方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述菌株ZB435接种于麦芽汁培养基并在有氧条件下进行培养。在某些实施
方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述菌株ZB435接种于含有5%‑15%（例如10%）的NaCl
的麦芽汁培养基，并在25‑40°C（例如28‑35°C；例如，30°C）的温度及有氧条件下进行培养。

[0022] 在某些实施方案中，所述方法包含下列步骤中的一项或多项：

[0023] 预处理豆类原料；

[0024] 预处理淀粉质辅料；

[0025] 将预处理后的豆类原料和淀粉质辅料混合，添加曲种，制备成曲；

[0026] 将成曲和盐水混合制成酱醪（即，落黄）；

[0027] 发酵酱醪；

[0028] 发酵完成后，从发酵产物中分离发酵完成的酱汁和/或酱醅；

[0029] 对发酵完成的酱汁进行调配、杀菌、灌装或其任意组合，获得酱油；或者，对发酵完成的酱醅进行调配、杀菌、灌装或其任意组合，获得酱。

[0030] 在另一个方面，本发明提供了一种酱油或酱，其由上文中所述的方法制备获得。在某些实施方案中，所述酱油或酱是低盐或减盐的酱油或酱。

[0031] 在另一个方面，本发明提供了一种培养本发明的菌株ZB435的方法，其包括将所述菌株ZB435接种于麦芽汁培养基并在有氧条件下进行培养的步骤。在某些实施方案中，所述
方法包括：将所述菌株ZB435接种于含有5%‑15%（例如10%）的NaCl的麦芽汁培养基，并在25‑
40°C（例如28‑35°C；例如，30°C）的温度及有氧条件下进行培养。

[0032] 在本文中，所使用的技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

[0033] 酱醪：成曲与盐水混合后形成的半流动状态混合物。

[0034] 酱醅：成曲与盐水混合后因自然分层形成的多孔固态物，处于上层。

[0035] 酱汁：成曲与盐水混合后因自然分层形成的液态物，处于下层。

[0036] 低盐或减盐：食盐含量不高于12%。

[0037] 低盐稀态发酵（本文也称低盐稀醪发酵）：采用混合原料总质量的1.8‑2.2倍的盐水落黄并发酵。经所述低盐稀态发酵获得酱油的食盐含量不高于12%。

[0038] 发明的有益效果

[0039] 本发明的菌株ZB435能够显著提升酱油或酱中的4‑乙基愈创木酚含量，提升愉悦香气物质例如β‑苯乙醇的组成比例，减少醛类刺激性气味，改善酸味，从而提高酱油或酱的
香气及风味，同时不影响酱油或酱中的总酸、氨基酸态氮等营养成分的含量，并且能显著提
高酱油或酱中谷氨酸的含量。并且，本发明的菌株ZB435耐盐范围广，并且发酵过程中会提
升酱油中乙醇含量，从而提升酱油香气及防腐力，可改善低盐稀醪发酵防腐能力弱的现状。
因此，本发明的菌株不仅适用于常规的高盐酱油的发酵生产，也适用于低盐或减盐酱油的
发酵生产，以获得香气浓郁、酱香明显、口感柔和的低盐或减盐酱油或酱。此外，本发明的菌
株ZB435源自天然酱醅，安全性好。

[0040] 序列信息

[0041] 表1：本申请涉及的序列的信息描述于下面的表中。

[0042]

附图说明

[0043] 图1为菌株ZB435（7号菌株）在含PDA固体培养基上的菌落形态图。

[0044] 图2显示了菌株ZB435（7号菌株）在不同含盐量培养基中的生长情况。

[0045] 关于生物材料保藏的说明

[0046] 本发明涉及下列已在广东省微生物菌种保藏中心（广州市先烈中路100号大院59号楼）进行保藏的生物材料：

[0047] Wickerhamiella versatilis ZB435，其具有保藏号GDMCC NO：61755，且保藏日期为2021年6月29日。

具体实施方式

[0048] 现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。

[0049] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0050] 除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

[0051] 培养基配方：

[0052] 含8%NaCl PDA固体培养基：30%马铃薯浸出粉，8%NaCl，2%葡萄糖，1.5%琼脂，0.1‰氯霉素。

[0053] 麦芽糖培养基：5%麦芽糖，1%酪蛋白，0.2%酵母膏，0.2%KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，18%NaCl，2%琼脂，pH4.8。

[0054] TTC下层培养基：5%葡萄糖，1%胰蛋白胨，0.8%酵母膏，0.5% KH2PO4，0.2% MgSO4·7H2O，0.15%柠檬酸，2%琼脂。

[0055] TTC上层培养基：0.05%TTC，0.5%葡萄糖，2%琼脂。

[0056] 实施例1. 目标菌株的筛选

[0057] 1.1 菌株的耐盐性筛选

[0058] 选取具有特殊香气的酱醪，用无菌生理盐水将酱醪逐级稀释到10‑1、10‑2、10‑3、10‑4浓度，制成酱醪稀释液。取0.1 mL酱醪稀释液均匀涂布于添加了8%NaCl的PDA固体培养基
上，30℃倒置培养48 72 h，挑选平板上长出的大小、颜色及形态不同的单菌落，依次编号为
~
1 8。挑取1 8的单菌落，分别继续划线于含8%NaCl的PDA固体培养基上，直至获取纯的单菌
~ ~
落为止。1‑8号菌株在含8%NaCl的PDA固体培养基上的生长特性和菌落形态如表2所示。7号
菌株在PDA固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈圆形，其边缘整齐，表面平滑，乳白
色，不透明。

[0059] 表2 各菌株生长特性和菌落形态

[0060]

[0061] 1.2 菌株的生长特性筛选

[0062] 1.2.1麦芽糖同化能力

[0063] 将上一步划线得到的单菌落1 8以点接的方式依次接种于麦芽糖培养基（含18%食~
盐）上，30℃倒置培养48 72 h，挑选出能在麦芽糖培养基上生长的单菌落1、3、6、7、8共计5
~
株菌用于后续筛选。

[0064] 1‑8号菌株各自的麦芽糖同化能力如表3所示。

[0065] 表3 麦芽糖培养基筛选结果

[0066]

[0067] 1.2.2筛选酵母产酒能力的初步判断

[0068] 将上述5株菌（1号、3号、6号、7号和8号）以点接的方式接种于TTC下层培养基中，30℃倒置培养48 h后，在此TTC下层培养基上倒入约12 mL的TTC上层培养基，待其凝固后，30
℃避光培养3 5 h，观察菌落颜色。各菌株菌落变色情况如表4所示。
~

[0069] 表4 TTC培养基筛选结果

[0070]

[0071] TTC (2,3,5‑氯化三苯基四氮唑)是一种显色剂，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低，其中产酒精能力强的酵母会显现深红色，次之粉红
色。根据TTC显色筛选结果，所筛选出的酵母均具有产酒能力，其中1、3号在筛选酵母中具有
较强的产酒能力，而7号、8号次之，6号产酒能力相对较弱。

[0072] 1.3酵母形态镜检

[0073] 在载玻片中央滴1 2滴无菌生理盐水，用无菌牙签挑取小块酵母菌落，于生理盐水~
中涂抹均匀，盖上盖玻片后进行镜检，镜检目镜放大倍数为10×，物镜为20×。镜检结果如
表5所示。

[0074] 表5 镜检形态结果

[0075]

[0076] 镜检结果表明，1号、3号、6号、7号和8号共计5株菌的酵母细胞形态均有所不同，其中1、3酵母细胞形态较为接近，而7、8较为接近，7号、8号酵母细胞形态为圆形，但个体相对
较小。

[0077] 实施例2. 菌株在酱油发酵中的应用与筛选

[0078] 2.1低盐稀态发酵工艺

[0079] 采用低盐稀态发酵技术，以浓度为15%的盐水落黄，具体落黄温度和前期发酵温度如表6。在低盐稀态发酵工艺中，酱醪中杂菌如乳酸菌容易快速生长，导致酱醪中总酸过高，
进而影响酵母等微生物的生长。为此，发明人检测了发酵过程中酱醪中的乳酸菌数和总酸
含量变化，结果见表7。

[0080] 表6 低盐稀态发酵工艺温度控制方案

[0081]

[0082] 表7发酵过程中酱醪乳酸菌含量和总酸含量的变化

[0083]

[0084] 从表7的检测结果可以看出，表6所提供的温度控制方案能有效抑制杂菌如产酸菌的快速增殖，从而改善常温低盐稀醪发酵过程中总酸快速提升的现象，避免酱醪pH显著下
降，使得前期酱醪发酵过程中各类酶（如中性蛋白酶）虽作用缓慢但仍可顺利进行发酵，从
而为低盐稀醪发酵打下良好的基础，改善低盐稀醪发酵防腐能力弱的现状。

[0085] 2.2 筛选菌株在酱油发酵中的效果

[0086] 将实施例1中筛选出的酵母菌株（1号、3号、6号、7号和8号菌株）和球拟酵母沪酿2.14接种到酱醪中进行发酵，其具体操作步骤为：将1号、3号、6号、7号、8号菌株、沪酿2.14
分别进行液体培养，液体培养基为添加10% NaCl的商品化麦芽汁培养基（购自广东环凯微
生物科技有限公司，货号：021120）。按照1%接种量进行接种，30℃、150 rpm震荡培养36‑48 
8 
h，待酵母浓度达到10 个/ml时接入酱醪中。接入酱醪的时间为发酵第30天接入，酵母液接
5 
种量为10 个/g，发酵方案使用上述2.1中所述的低盐低温工艺方案，直至酱醪发酵成熟。使
用还原糖测定仪、GC‑MS等仪器分别对发酵酱油的理化指标和香气成分进行测定，结果发现
各试验组酱油中的4‑乙基愈创木酚含量相较于对照组均有提升，其中7号菌株（将其命名为
ZB435）发酵酱油的风味改善效果最明显，有较好的应用效果，具体数据见表8。

[0087] 表8 各酵母菌发酵酱油4‑乙基愈创木酚相关指标

[0088]

[0089] 注：香气占比为某一风味物质峰面积积分值之和占总风味物质峰面积积分值之和的比例。

[0090] 表8结果显示，酵母菌株ZB435发酵制得的酱油中4‑乙基愈创木酚含量明显优于未添加酵母组和其他筛选酵母，其相对于未添加酵母的阴性对照组，4‑乙基愈创木酚的香气
占比提升约6.8倍。并且，与目前工业上普遍使用的球拟酵母沪酿2.14（购自上海迪发酿造
生物制品有限公司）相比，其在提升酱油中4‑乙基愈创木酚含量上也具有明显优势。因此将
酵母菌株ZB435应用于酱油发酵中，可有效提升酱油中4‑乙基愈创木酚含量，改善酱油风
味。

[0091] 本发明的7号菌株（ZB435）经26S rDNA基因鉴定，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。将上述序列在NCBI上进行BLAST同源序列比对，结果表明，菌株ZB435属于
Wickerhamiella versatilis，Wickerhamiella versatilis与Torulopsis versatilis、
Candida versatilis属于同物异名。

[0092] 本实施例选育获得的7号菌株已经由本发明人于2021年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为Wickerhamiella versatilis菌株ZB435，保藏编号为GDMCC NO：
61755，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

[0093] 2.3筛选菌株的耐盐性测试

[0094] 使用商品化麦芽汁液体培养基（购自广东环凯微生物科技有限公司，货号：021120），加入不同比例的食盐制备不同含盐量的培养基，在不同培养时间取样检测细胞数
量，以验证该菌株的耐盐能力。结果如图2所示。

[0095] 图2的结果表明筛选菌株ZB435对食盐浓度具有较宽的适应范围，且具有较强的耐8
盐能力，其在食盐浓度达到20%的条件下仍可正常生长，36 h时酵母浓度即可达到10 个/
8
mL，25%时对其生长开始出现明显抑制作用，培养60 h酵母浓度可达到10 个/mL，而28%盐分
时仍有一定的存活和生长能力。因此，筛选出的ZB435具有较强的耐盐性，对盐浓度的适应
范围宽，不仅具备应用于低盐酱醪发酵环境以获得低盐或减盐酱油，也适用于常规的高盐
酱醪发酵环境。

[0096] 实施例3 筛选菌株对酱油香气成分的影响

[0097] 将Wickerhamiella versatilis ZB435菌株按照实施例2 2.2中所述的方法应用在低盐酱醪发酵中，经发酵酱油的香气及理化指标的检测结果见表9‑12。

[0098] 表9 发酵酱油理化指标

[0099]

[0100] 由表9可知，在低盐酱醪中添加酵母菌ZB435进行发酵，整体来看，其对酱油的总酸、氨氮等基础理化指标未产生明显影响，但是能明显提升酱油中谷氨酸的含量，ZB435试
验组谷氨酸含量相较于对照组提升约14%，酱油鲜味主要来源于氨基酸中的谷氨酸，谷氨酸
含量越高，酱油的鲜味也越好。添加沪酿2.14的发酵酱油与对照组相比，酱油的理化指标基
本无变化，对谷氨酸含量也无明显提升效果。

[0101] 表10 发酵酱油香气组成及占比

[0102]

[0103] 注：种类占比的计算方式为，某一类风味物质峰面积积分值之和占总风味物质峰面积积分值之和的比例。

[0104] 酱油中所含的醇类、有机酸以及酯类是酱油香气的重要组成部分。表10的结果表明，在酱醪中添加ZB435酵母菌株发酵，酱油中香气物质提升最为显著的物质种类为醇类，
而醛类物质有显著降低，其中ZB435对酚类物质提升效果更显著，且对酯类也有小幅提升效
果。沪酿2.14对酱油香气的整体改善程度明显逊色于ZB435，且特征香气4‑乙基愈创木酚明
显低于ZB435。

[0105] 表11 发酵酱油不同香气类别组成成分

[0106]

[0107] 表12 发酵酱油中不同特征香气成分的变化

[0108]

[0109] 根据表11‑12可知，与未添加酵母发酵的对照组相比，ZB435能明显提升酱油香气中醇类物质的含量，其检出种类也从未添加酵母时的12种提升为15种，其中变化最显著的
为乙醇、β‑苯乙醇，其含量均有显著提升，其中乙醇含量的提升，除了可以改善酱油风味，对
低盐稀醪发酵过程防腐能力的提升也有一定的助益。此外，添加ZB435发酵酱油中3‑甲硫基
丙醇的香气含量提升约为5.8倍。3‑甲硫基丙醇存在于番茄、葡萄酒及酱油的挥发性成分
中，低浓度时表现为酱香及肉香，也是酱油中的典型香气物质。因此，添加ZB435对酱油中醇
类物质的影响整体表现为高级醇种类和丰度增加。

[0110] 此外，添加ZB435发酵的酱油香气中，酯类丰度相较于对照组提升3.7%，其发酵产生的乙酸异戊酯是常见于发酵产品中的风味物质，它的存在使酱油香气更加柔和。酯类作
为基本的香味物质，可使麦芽酚、β‑苯乙醇等关键风味化合物的气味更醇厚，缓冲酱油中盐
分的咸味。而其醛类香气含量的降低主要是2‑甲基丁醛含量的降低引起的，2‑甲基丁醛具
有强烈的窒息性气味，稀释后有独特的可可和咖啡的香气。酮类物质则主要是种类丰度降
低，表现为辛酮、辛二酮、丁烯酮等物质的减少，丁烯酮具有刺激的腥臭味；酸类物质中则主
要是乙酸含量出现显著降低，且酸类物质由10种降低为6种。

[0111] 从香气分析数据来看，添加ZB435后，酱油香型向浓香型调整，即除了能明显提升酱油中4‑乙基愈创木酚的含量外，其醛类刺激性气味减少，酸味有所改善，具有愉悦香气的
物质的组成比例有所提升，整体香气有所改善。

[0112] 实施例4. 酵母ZB435发酵酱油的感官鉴评效果

[0113] 召集20名有丰富经验的鉴评人员分别对是否添加酵母ZB435发酵的酱油进行感官鉴评，感官鉴评方法参照GB 2717‑2018，感官鉴评的评价指标包括鲜味、浓厚感、综合口感、
色泽和香气，分值为0～5分，平均分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表13中。

[0114] 表13 酱油感官鉴评结果

[0115]

[0116] 表13的结果表明，在感官评价中，酵母菌ZB435发酵酱油的鲜味较对照组有明显提升，这与其能提升酱油中谷氨酸含量可能有一定的关系。且在食盐含量指标未受到影响的
情况下，添加ZB435发酵的酱油入口咸味更轻，鉴评者表示其口感柔和度优于对照组，浓厚
感较好，酸味也有所改善，这可能得益于ZB435能显著提升4‑乙基愈创木酚含量及酯类物质
的含量，并对乙酸有一定降低效果。综合口感评价，添加ZB435发酵的酱油在口感方面有较
好的改善效果，主要体现在咸味降低、鲜味的提升及酸味的改善。

[0117] 此外，表13结果还表明添加ZB435对酱油香气具有较大改善，其得分显著高于未添加酵母发酵的酱油。鉴评人员表示添加酵母发酵的酱油香气浓郁，酱香明显，香气持久。综
合来看，在酱醪中添加酵母菌ZB435进行发酵，可以显著改善发酵酱油的口感与香气。

[0118] 实施例5.酵母菌ZB435的遗传稳定性检测

[0119] 将上述实施例中筛选出的酵母菌ZB435接种于YPD斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按实施例2 2.2中所述的方法接
种于酱醪中进行发酵培养，发酵结束后采用高效液相色谱法测定其发酵液中4‑乙基愈创木
酚、谷氨酸的含量，判断其遗传稳定性。若10代菌株发酵所得发酵液中测定的4‑乙基愈创木
酚、谷氨酸的含量误差在10%误差范围内，则表明该菌株遗传稳定性良好，检测结果见表14。
表14的结果表明菌株ZB435具有良好的遗传稳定性。

[0120] 表14 酵母菌ZB435传代稳定性检测结果

[0121]

[0122] 备注：以酵母菌ZB435第1代各项指标为1.00，第5代，第10代分别换算成相应比值。

[0123] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保
护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。