一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用

摘要

本发明涉及一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用。所构建的重组病毒同时缺失了MDV致病、致肿瘤相关的两个主要基因RLORF6、Meq和CmR基因，相比缺失单一基因，极大增加了疫苗安全性，降低了野外获得缺失基因的能力；重组病毒株基因组没有抗性基因，符合国内外生物制品行业的严格要求；重组病毒具有良好的生物安全性，具有更为有效的抗MDV的免疫保护效果，尤其适用我国鸡群MDV的免疫。重组病毒能够有效的与野毒进行区分，并且其水平传播能力较弱，不仅对鸡群MDV的免疫具有极大的应用价值，更是有利于推进MDV的净化，重组病毒株基因组没有FRT序列，减少了外源基因对病毒生物学活性的影响，避了FRT序列间病毒基因片段的任意剪切，更有利于研制重组活病毒载体疫苗。

权利要求

1.一株重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述病毒是缺失RLORF6、Meq和CmR基因的重组马立克病毒株，该毒株已于2021年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No. 20389。

2.权利要求1所述的重组马立克病毒MDLV21作为生产种毒在制备鸡马立克病毒疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的重组马立克病毒MDLV21作为载体在制备疫苗的应用。

4.用于鉴别根据权利要求1所述的重组马立克病毒MDLV21株与CVI988/Rispens疫苗病毒株的引物对，其特征在于所述引物对为MDV‑F/R和Cam‑F/R ：MDV‑F：5’‑ccgagtctaa gctacacggt aagg‑3’ 24MDV‑R：5’‑tgattcctag gcaggcgtct c‑3’ 21Cam‑F：5’‑tccgcttatt atcacttatt cagg‑3’ 24Cam‑R：5’‑tatgtcccat caggctttgc‑3’ 20。

说明书

一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用，属于兽用生物制品分子生物学领域。【背景技术】

[0002] 鸡马立克病(Marek’s disease，MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV) 感染雏鸡引发的一种重要的免疫抑制与肿瘤病。MDV感染宿主后引起免疫抑制是导致其它疾病疫苗免疫失败的重要因素。疫苗的使用能够有效的预防鸡群MDV肿瘤的发生，但是随着免疫压力选择及MDV自身演化，目前临床广泛使用的商品化MDV疫苗CVI988/Rispens呈现不能完全保护的趋势。近年来，即使免疫MDV疫苗的鸡场也时常爆发MD疫情，表明我国鸡群 MDV野生毒株的毒力在不断增强。因此，研制免疫效果更好的MDV疫苗成为养禽业的迫切需求。

[0003] 然而，利用传统的细胞传代致弱毒力的方法研制的MDV疫苗无法提供比现有的 CVI988/Rispens更好的免疫效果。现代分子生物学技术的快速发展，有效的推进了MDV基因功能的研究。美国禽病学专家利用黏粒构建了MDV rMd5的Meq基因缺失株，研究结果证实 Meq基因是MDV主要的致肿瘤基因，Meq基因缺失株对商品代蛋鸡具有良好的免疫保护效果。病毒普遍存在“准种”，MDV也不例外，英国学者证实同一株MDV毒株的两个克隆虽然基因组高度相似，但是病毒毒力差异显著。因此，构建MDV的感染性克隆具有非常重要的科研和应用价值，其中利用细菌人工染色体(BAC)技术构建MDV感染性克隆对于研究其基因功能以及生物学活性具有无可比拟的优势。构建的MDV感染性克隆可以在氯霉素抗性的液体细菌培养基里进行稳定的复制，对于维持MDV基因组的稳定以及大量保存具有重要意义。
【发明内容】

[0004] 本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株免疫效果优于CVI988/Rispens的重组马立克病毒株，并且具有良好的生物安全性，并确认该重组病毒能够作为重组活载体疫苗的良好疫苗株。

[0005] 本发明的思路是通过完全缺失MDV两个拷贝的致病、致肿瘤相关基因RLORF6和Meq 基因，并确保没有外源基因的残留。进一步地，还缺失MDV基因组中的抗氯霉素基因(CmR)，确保重组病毒的全基因组DNA能够在细菌中复制。

[0006] 基于以上思路，本发明为：提供一株重组马立克病毒MDLV21，所述病毒是RLORF6、 Meq和CmR基因缺失的重组马立克病毒株。

[0007] 本发明的技术方案为：

[0008] 1.一株重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述病毒是缺失RLORF6、Meq和CmR基因的重组马立克病毒株，该株病毒已于2021年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.20389。

[0009] 2.一株马立克病毒MDLV21的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

[0010] (1)构建用于取代RLORF6和Meq基因的重组穿梭质粒——根据马立克病毒标准株Md5 全基因序列(GeneBank登录号为No.NC002229)，针对RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6‑F/R和Meq‑F/R，并设计扩增EGFP蛋白表达盒的引物 EGFP‑F/R，以利用马立克病毒SCA13(已于2018年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC No.15285)全基因组DNA作为模板， RLORF6‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP，Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，以PHA2质粒为模板利用引物EGFP‑F/R 扩增EGFP蛋白表达盒，将扩增得到的上下游同源臂片段和EGFP蛋白表达盒进行连接克隆进 HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑UGFPD；

[0011] (2)构建用于缺失替代RLORF6和Meq基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒——针对 RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6‑F/R1和Meq‑F/R，利用马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，RLORF6‑F/R1引物扩增靶标基因RLORF6、Meq 基因上游同源臂片段UP；Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，将扩增得到的上下游同源臂片段克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进 DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑UD；

[0012] (3)构建用于取代氯霉素抗性基因(CmR)的重组穿梭质粒——以马立克病毒SCA13 株全基因组DNA作为模板，设计引物CamUP‑F/R并扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段 Cam‑UP，设计引物CamDO‑F/R并扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO；以PHA2 质粒为模板利用引物EGFP‑F1/R1扩增EGFP蛋白表达盒；将扩增得到的上下游同源臂片段、EGFP蛋白表达盒克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑CamUGFPD；

[0013] (4)构建用于缺失替代CmR基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒——针对靶标基因，设计扩增作为同源臂的旁侧序列引物CamUP‑F/R1、CamDO‑F1/R，以马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，引物CamUP‑F/R1扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段Cam‑UP，引物CamDO‑F1/R扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO，将扩增的上下游同源臂片段克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑CamUD；

[0014] (5)通过细胞内重组构建缺失RLORF6和Meq基因的重组病毒——利用QIAGEN质粒提取试剂盒大量提取马立克病毒SCA13全基因组，与步骤(1)得到的质粒PUC‑UGFPD利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6和Meq基因的重组病毒；

[0015] 提取所述缺失RLORF6和Meq基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(2)得到的 PUC‑UD质粒利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的负筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6与Meq 基因的重组病毒；所得重组病毒鉴定正确后，通过在鸡胚成纤维细胞内的两次重组，结合绿色荧光蛋白的筛选，得到完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒；

[0016] (6)对完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒敲除CmR基因——提取步骤(5)得到的完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(3)得到的 PUC‑CamUGFPD利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的筛选对病毒进行纯化，得到缺失CmR基因的重组病毒；

[0017] 提取所述缺失CmR基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(4)得到的PUC‑CamUD 质粒利用磷酸钙共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的负筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6、Meq基因和CmR基因的重组马立克病毒MDLV21。

[0018] 3.如权利要求1‑2所述的重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述重组马立克病毒 MDLV21株作为生产种毒在制备鸡马立克病毒疫苗中的应用。

[0019] 4.如权利要求1‑2所述的重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述重组马立克病毒MDLV21株作为载体在疫苗的应用。

[0020] 5.如权利要求1‑2所述的重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述重组马立克病毒 MDLV21株与CVI988/Rispens疫苗病毒株鉴别方法所用的引物对为MDV‑F/R和Cam‑F/R：

[0021] MDV‑F：5’‑ccgagtctaa gctacacggt aagg‑3’24

[0022] MDV‑R：5’‑tgattcctag gcaggcgtct c‑3’21。

[0023] Cam‑F：5’‑tccgcttatt atcacttatt cagg‑3’24

[0024] Cam‑R：5’‑tatgtcccat caggctttgc‑3’20。

[0025] 本发明的具体描述：

[0026] 本发明所述重组马立克病毒MDLV21的构建方法包括以下步骤：

[0027] (1)构建用于取代RLORF6和Meq基因的重组穿梭质粒

[0028] 根据马立克病毒标准株Md5全基因序列(GeneBank登录号为No.NC002229)，针对 RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6‑F/R和Meq‑F/R，并设计扩增EGFP蛋白表达盒的引物EGFP‑F/R，以利用马立克病毒SCA13(已于2018年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC No.15285。)全基因组DNA作为模板，RLORF6‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP，Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，以 PHA2质粒为模板利用引物EGFP‑F/R扩增EGFP蛋白表达盒，将扩增得到的上下游同源臂片段和EGFP蛋白表达盒进行连接克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进 DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑UGFPD；

[0029] (2)构建用于缺失替代RLORF6和Meq基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒

[0030] 针对RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6‑F/R1和 Meq‑F/R，利用马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，RLORF6‑F/R1引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP；Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，将扩增得到的上下游同源臂片段克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18 载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑UD；

[0031] (3)构建用于取代氯霉素抗性基因(CmR)的重组穿梭质粒

[0032] 以马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，设计引物CamUP‑F/R并扩增靶标基因 CmR基因上游同源臂片段Cam‑UP，设计引物CamDO‑F/R并扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO；以PHA2质粒为模板利用引物EGFP‑F1/R1扩增EGFP蛋白表达盒；将扩增得到的上下游同源臂片段、EGFP蛋白表达盒克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑CamUGFPD；

[0033] (4)构建用于缺失替代CmR基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒

[0034] 针对靶标基因CmR基因CmR，设计扩增作为同源臂的旁侧序列引物CamUP‑F/R1、 CamDO‑F1/R，以马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，引物CamUP‑F/R1扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段Cam‑UP，引物CamDO‑F1/R扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO，将扩增的上下游同源臂片段克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC‑CamUD；

[0035] (5)通过细胞内重组构建缺失RLORF6和Meq基因的重组病毒

[0036] 利用QIAGEN质粒提取试剂盒大量提取马立克病毒SCA13全基因组，与步骤(1)得到的质粒PUC‑UGFPD利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6和Meq 基因的重组病毒；

[0037] 提取所述缺失RLORF6和Meq基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(2)得到的 PUC‑UD质粒利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的负筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6与Meq 基因的重组病毒；所得重组病毒鉴定正确后，通过在鸡胚成纤维细胞内的两次重组，结合绿色荧光蛋白的筛选，得到完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒；

[0038] (6)对完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒敲除CmR基因

[0039] 提取步骤(5)得到的完全敲除RLORF6和Meq基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(3)得到的PUC‑CamUGFPD利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的筛选对病毒进行纯化，得到缺失CmR 基因的重组病毒；

[0040] 提取所述缺失CmR基因的重组病毒的全基因组DNA，与步骤(4)得到的PUC‑CamUD 质粒利用磷酸钙共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒；在观察到细胞出现马立克病毒蚀斑后，通过绿色荧光蛋白的负筛选对病毒进行纯化，得到缺失RLORF6、Meq基因和CmR基因的重组马立克病毒MDLV21。

[0041] 基于此，本发明还提供所述重组马立克病毒MDLV21在制备鸡马立克病毒疫苗中的应用，以及所述构建方法得到的重组马立克病毒MDLV21在制备鸡马立克病毒疫苗中的应用。

[0042] 本发明还提供用于鉴定所述重组马立克病毒MDLV21的引物MDV‑F/R，序列如下：

[0043] MDV‑F：5‘‑ccgagtctaa gctacacggt aagg‑3’24

[0044] MDV‑R：5‘‑tgattcctag gcaggcgtct c’‑3’21

[0045] 该引物用于鉴定MDLV21株重组病毒时，以MDLV21株病毒DNA为模板能够扩增出 194bp条带，而CVI988/Rispens病毒DNA为模板能够扩增出1461bp条带，Md5病毒DNA为模板能够扩增出1283bp条带。

[0046] 针对重组病毒MDLV21缺失的CamR基因，在其两侧设计引物Cam‑F/R，序列如下：

[0047] Cam‑F：5’‑tccgcttatt atcacttatt cagg‑3’24

[0048] Cam‑R：5’‑tatgtcccat caggctttgc‑3’20

[0049] 以MDLV21病毒DNA为模板能够扩增出554bp条带，而CVI988/Rispens、Md5病毒DNA 为模板不能能够扩增出条带(图2)。

[0050] 因此，利用引物MDV‑F/R和Cam‑F/R可以鉴别重组病毒MDLV21与疫苗株 CVI988/Rispens以及野毒Md5。

[0051] 本发明以我国分离的MDV流行毒株SCA13株出发，在其BAC感染性克隆的基础上，利用分子生物学和细胞生物学技术，通过同源重组方法获得重组病毒MDLV21株。经实验确认，重组病毒MDLV21具有良好的生物安全性，具有有效性更高的抗MDV的免疫保护效果，尤其适用我国鸡群MDV的免疫。作为基因缺失株，MDLV21疫苗能够有效的与野毒进行区分，并且其横向传播能力较弱，不仅对鸡群MDV的免疫具有极大的应用价值，更是有利于推进 MDV的净化。另外，MDLV21疫苗基因组能够在细菌里复制，因此具有作为研制重组活病毒载体疫苗的先决优势。

[0052] 本发明的重组马立克病毒MDLV21同时缺失了MDV致病、致肿瘤相关的两个主要基因 RLORF6和Meq，与现有技术的缺失单一基因相比，极大增加了疫苗安全性，降低了野外获得缺失基因的能力。另一方面，本发明的重组病毒相比其它BAC克隆，本发明的重组病毒缺失了CmR基因，基因组不含抗性基因，更有利于临床使用，符合国内外生物制品行业的严格要求。此外，传统利用BAC克隆以及同源重组技术缺失MDV基因是利用带有FRT序列的卡那霉素抗性基因取代目的基因，然后再诱导敲除掉卡那霉素抗性基因，缺失基因处残留包含FRT 序列在内的84bp碱基的外源基因。MDLV21疫苗基因组没有FRT序列，减少了外源基因对病毒生物学活性的影响，重要的是避免了FRT序列间病毒基因片段的任意剪切，更有利于研制重组活病毒载体疫苗。

[0053] FRT序列：5′‑gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc‑3′34

[0054] 本发明涉及的微生物资源信息

[0055] 鸡马立克病病毒SCA13株(已于2018年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15285；重组马立克病病毒(Marek’s disease virus)MDLV21株(已于2021年08月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.20389。

[0056] 本发明取得的新技术效果

[0057] 本发明涉及一种缺失基因的重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用。所构建的重组病毒同时缺失了MDV致病、致肿瘤相关的两个主要基因RLORF6、meq和CmR基因，相比缺失单一基因，极大增加了疫苗安全性，降低了野外获得缺失基因的能力；该重组病毒株基因组没有抗性基因，符合国内外生物制品行业的严格要求；重组病毒具有良好的生物安全性，具有更为有效的抗MDV的免疫保护效果，尤其适用我国鸡群MDV的免疫。重组病毒能够有效的与野毒进行区分，并且其水平传播能力较弱，不仅对鸡群MDV的免疫具有极大的应用价值，更是有利于推进MDV的净化，该重组病毒基因组没有FRT序列，减少了外源基因对病毒生物学活性的影响，重要的是避了FRT序列间病毒基因片段的任意剪切，更有利于研制重组活病毒载体疫苗。【附图说明】

[0058] 图1MDV MDLV21在鸡胚成纤维细胞的复制曲线，图中1：MDV MDLV21株感染CEF 引起的细胞病变；2：间接免疫荧光鉴定MDV MDLV21株感染CEF引起的细胞病变。

[0059] 图2重组MDV MDLV21株的PCR检测图中1：MDLV21 DNA作为模板(MDV‑F/R 引物)；2：Md5 DNA作为模板(MDV‑F/R引物)；3：CVI988 DNA作为模板(MDV‑F/R引物)； 4：MDLV21 DNA作为模板(Cam‑F/R引物)；5：Md5 DNA作为模板(Cam‑F/R引物)；6： CVI988 DNA作为模板(Cam‑F/R引物)。

[0060] 图3MDV MDLV21免疫SPF鸡后不同时间对体重的影响。

[0061] 图4重组MDV MDLV21株接种鸡的存活率。

[0062] 图5重组MDV MDLV21株接种鸡的体重。

[0063] 图6重组MDV MDLV21株接种鸡免疫灭活苗抗体水平。【实施例】

[0064] 以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

[0065] 在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为重量百分比，用于说明比例的“：”均为重量比。

[0066] 实施例1——构建重组马立克病毒MDLV21株：

[0067] 1.构建用于取代RLORF6、Meq基因的重组穿梭质粒

[0068] 参照发表的MDV标准株Md5全基因序列(GeneBank登录号为No.NC002229)，针对 RLORF6、Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计了引物RLORF6‑F/R和Meq‑F/R，同时设计了EGFP‑F/R扩增EGFP蛋白表达盒：

[0069] RLORF6‑F：5’‑acgacggcca gtgccaagct tagttctctt cccctactta ccatttc‑3’47[0070] RLORF6‑R：5’‑gccaaaaccg catcactagt tttcatagtt tcgggaagat ca‑3’42[0071] Meq‑F：5’‑ctctttacac ctgtaccgtg ccc‑3’23

[0072] Meq‑R：5’‑tatgaccatg attacgaatt cccgcccccg aacactttc‑3’39[0073] EGFP‑F:5‘‑actagtgatg cggttttggc agtac‑3’25

[0074] EGFP‑R:5’‑cacggtacag gtgtaaagag taagatacat tgatgagttt ggacaaac‑3’48[0075] 以MDV SCA13株(该毒株已于2018年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15285)全基因组DNA作为模板，RLORF6‑F/R 引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP；Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO。以PHA2质粒(购自Addgene，货号85710)为模板利用引物EGFP‑F/R扩增EGFP蛋白表达盒。

[0076] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各2μL，2xMax Master Mix buffer 25μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足50μL。95℃30s，95℃15s，65℃15s，72℃2min，72℃5min。30个循环。

[0077] 将扩增的上下游同源臂片段、EGFP蛋白表达盒克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18 载体，连接体系如下：2xClonExpress Mix 5μL，片段UP、DO、EGFP各1μL，酶切后的PUC18 载体1μL，ddH2O补足10μL。50℃，15min；立即置于冰上冷却，42℃热击转化进DH5a大肠杆菌。

[0078] 挑取单个菌落，经PCR鉴定后，提取质粒经上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，成功构建了重组穿梭质粒命名PUC‑UGFPD。

[0079] 2.构建用于缺失替代RLORF6、Meq基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒

[0080] 针对上述RLORF6、Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计了引物RLORF6‑F/R1和 Meq‑F/R：

[0081] RLORF6‑F：5‘‑acgacggcca gtgccaagct tagttctctt cccctactta ccatttc‑3’47[0082] RLORF6‑R1：5‘‑cacggtacag gtgtaaagag tagttttcat agtttcggga agatca‑3’46[0083] Meq‑F：5‘‑ctctttacac ctgtaccgtg ccc‑3’23

[0084] Meq‑R：5'‑tatgaccatg attacgaatt cccgcccccg aacactttc‑3’39

[0085] 以MDV SCA13株全基因组DNA作为模板，RLORF6‑F/R1引物扩增靶标基因RLORF6、 Meq基因上游同源臂片段UP；Meq‑F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO。

[0086] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各2μL，2xMax Master Mix buffer 25μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足50μL。95℃30s，95℃15s，65℃15s，72℃2min，72℃5min。30个循环。

[0087] 将扩增的上下游同源臂片段、克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，连接体系如下：2xClonExpress Mix 5μL，片段UP、DO各1μL，酶切后的PUC18载体1μL，ddH2O补足 10μL。50℃，15min；立即置于冰上冷却，42℃热击转化进DH5a大肠杆菌。

[0088] 挑取单个菌落，经PCR鉴定后，提取质粒经上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，成功构建了重组穿梭质粒命名PUC‑UD。

[0089] 3.构建用于取代氯霉素抗性基因的重组穿梭质粒

[0090] 针对细菌人工染色体序列中氯霉素抗性基因CmR，分别设计了扩增作为同源臂的旁侧序列引物CamUP‑F/R、CamDO‑F/R，并且设计了EGFP‑F1/R1扩增EGFP蛋白表达盒：

[0091] CamUP‑F:5‑acgacggcca gtgccaagct tttaattaag ggccggccg‑3 39

[0092] CamUP‑R:5’‑cttagatttt tttaaggcag ttattggtgc‑3’30

[0093] CamDO‑F：5’‑ccgcatcact aaatagctcc tggttttagc ttttg‑3’35

[0094] CamDO‑R：5’‑tatgaccatg attacgaatt ccaacacctt ctctagaacc agcatg‑3’46[0095] EGFP‑F1：5’‑ctgccttaaa aaaatctaag atacattgat gagtttggac aaac‑3’44[0096] EGFP‑R1：5’‑ggagctattt agtgatgcgg ttttggcagt ac‑3’32

[0097] 以MDV SCA13株全基因组DNA作为模板，CamUP‑F/R引物扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段Cam‑UP；CamDO‑F/R引物扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO。以PHA2质粒为模板利用引物EGFP‑F1/R1扩增EGFP蛋白表达盒。

[0098] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各2μL，2xMax Master Mix buffer 25μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足50μL。95℃30s，95℃15s，65℃15s，72℃1min，72℃5min。30个循环。

[0099] 将扩增的上下游同源臂片段、EGFP蛋白表达盒克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18 载体，连接体系如下：2xClonExpress Mix 5μL，片段Cam‑UP、Cam‑DO、EGFP各1μL，酶切后的PUC18载体1μL，ddH2O补足10μL。50℃，15min；立即置于冰上冷却，42℃热击转化进DH5a大肠杆菌。

[0100] 挑取单个菌落，经PCR鉴定后，提取质粒经上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，成功构建了重组穿梭质粒命名PUC‑CamUGFPD。

[0101] 4.构建用于缺失替代CmR基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒

[0102] 针对细菌人工染色体序列中氯霉素抗性基因CmR，分别设计了扩增作为同源臂的旁侧序列引物CamUP‑F/R1、CamDO‑F1/R：

[0103] CamUP‑F:5’‑acgacggcca gtgccaagct tttaattaag ggccggccg‑3’39[0104] CamUP‑R1:5’‑ccaggagcta tttagatttt tttaaggcag ttattggtgc‑3’40[0105] CamDO‑F1：5’‑aaaatctaaa tagctcctgg ttttagcttt tg‑3’32

[0106] CamDO‑R:5’‑tatgaccatg attacgaatt ccaacacctt ctctagaacc agcatg‑3’46[0107] 以MDV SCA13株全基因组DNA作为模板，CamUP‑F/R1引物扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段Cam‑UP；CamDO‑F1/R引物扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam‑DO。

[0108] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各2μL，2xMax Master Mix buffer 25μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足50μL。95℃30s，95℃15s，65℃15s，72℃1min，72℃5min。30个循环。

[0109] 将扩增的上下游同源臂片段、克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，连接体系如下：2xClonExpress Mix 5μL，片段Cam‑UP、Cam‑DO各1μL，酶切后的PUC18载体1μL，ddH2O 补足10μL。50℃，15min；立即置于冰上冷却，42℃热击转化进DH5a大肠杆菌。

[0110] 挑取单个菌落，经PCR鉴定后，提取质粒经上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，成功构建了重组穿梭质粒命名PUC‑CamUD。

[0111] 5.利用细胞内重组，构建缺失RLORF6、Meq基因的重组病毒

[0112] 利用QIAGEN质粒提取试剂盒大量提取MDV SCA13全基因组，与PUC‑UGFPD利用磷酸钙转染法共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒。具体方法如下：

[0113] 将2μg MDV SCA13基因组DNA、5μg重组质粒PUC‑UGFPD加入到10Mm Tris‑Cl，总体积为50μL，加入388μL的ddH2O。加入2M CaCl2，混合均匀，4℃过夜；同时将鸡胚成纤维细胞传至6孔培养板上。第二天将上述DNA‑Cacl2混合物中再加入等体积的2×HBS，混匀后室温下作用15min；将已长成单层的鸡胚成纤维细胞，加入500μL含5％血清的生长液，将上述转染混合物加入到培养板的2孔内，将转染后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，4h后弃掉其上清，PBS洗一次，加入15％甘油作用2min，PBS洗一次，加入生长液，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养5‑7天，观察马立克病毒引起的细胞病变。

[0114] 细胞出现马立克病毒蚀斑后，在荧光显微镜下观察能够发出绿色荧光的蚀斑，即为表达 EGFP蛋白的重组MDV，用记号笔进行标记。制备2％的低熔点琼脂糖溶液与2x细胞维持液按1:1的比例混匀后，加入各培养孔中，冷却后凝固成覆盖层，在记号笔标记处打洞，利用胰酶消化收集病变细胞，以10倍倍比稀释接种到预先培养成单层的鸡胚成纤维细胞6孔培养板中，继续挑取绿色荧光噬斑重复至所有蚀斑均发出绿色荧光。经过6轮纯化后，所有病毒均表达EGFP蛋白，即缺失RLORF6与Meq基因。

[0115] 提取重组病毒的全基因组DNA，按照上述方法与PUC‑UD质粒利用磷酸钙共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒。细胞出现马立克病毒蚀斑后，进行荧光蚀斑的逆向筛选，在荧光显微镜下观察没有发出绿色荧光的蚀斑，即为缺失EGFP蛋白的重组MDV，用记号笔进行标记。按照上述方法对缺失EGFP蛋白的重组MDV进行纯化，经过6轮纯化后，所有病毒蚀斑在荧光显微镜下均不发出亮绿色荧光，即重组病毒缺失RLORF6与Meq基因。

[0116] 提取重组病毒全基因组DNA，利用MDV‑F/R引物进行PCR鉴定，经上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，成功敲除了MDV的RLORF6与Meq基因。由于所有MDV均各含有两个拷贝的RLORF6与Meq基因，PCR检测已经成功敲除其中一个拷贝的RLORF6与Meq 基因。因此，按照上述方法，利用在鸡胚成纤维细胞内的两次重组，结合绿色荧光蛋白的筛选，成功敲除另一个拷贝的RLORF6与Meq基因，最终利用引物进行PCR鉴定，成功获得完全敲除RLORF6与Meq基因的重组病毒。

[0117] 6.利用细胞内重组，进一步敲除缺失RLORF6、Meq基因的重组病毒的CmR基因[0118] 提取完全敲除RLORF6与Meq基因的重组病毒全基因组DNA，与PUC‑CamUGFPD利用磷酸钙共转染进鸡胚成纤维细胞，拯救病毒。具体方法如下：

[0119] 将2μg病毒基因组DNA、5μg重组质粒PUC‑CamUGFPD加入到10Mm Tris‑Cl，总体积为50μL，加入388μL的ddH2O。加入2M CaCl2，混合均匀，4℃过夜；同时将鸡胚成纤维细胞传至6孔培养板上。第二天将上述DNA‑Cacl2混合物中再加入等体积的2×HBS，混匀后室温下作用
15min；将已长成单层的鸡胚成纤维细胞，加入500μL含5％血清的生长液，将上述转染混合物加入到培养板的2孔内，将转染后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养， 4h后弃掉其上清，PBS洗一次，加入15％甘油作用2min，PBS洗一次，加入生长液，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养5‑7天，观察马立克病毒引起的细胞病变。

[0120] 细胞出现马立克病毒蚀斑后，在荧光显微镜下观察能够发出绿色荧光的蚀斑，即为表达 EGFP蛋白的重组MDV，用记号笔进行标记。按照上述方法对重组病毒进行纯化。经过6轮纯化后，所有病毒均表达EGFP蛋白，即缺失CmR基因。

[0121] 提取重组病毒的全基因组DNA，按照上述方法与PUC‑CamUD质粒利用磷酸钙共转染进鸡胚成纤维细胞，再次拯救病毒。细胞出现马立克病毒蚀斑后，进行荧光蚀斑的逆向筛选，在荧光显微镜下观察没有发出绿色荧光的蚀斑，即为缺失EGFP蛋白的重组MDV，用记号笔进行标记。按照上述方法对缺失EGFP蛋白的重组MDV进行纯化，经过6轮纯化后，所有病毒蚀斑在荧光显微镜下均不发出亮绿色荧光。提取重组病毒的DNA，经PCR测序鉴定，成功构建了缺失RLORF6、Meq基因与CmR基因的重组病毒MDLV21(图1)。

[0122] 实施例2——重组病毒MDLV21与疫苗株CVI988/Rispens、野生型毒株Md5的鉴别诊断针对重组病毒MDLV21缺失的RLORF6、Meq基因，在其两侧设计引物MDV‑F/R：

[0123] MDV‑F：5‘‑ccgagtctaa gctacacggt aagg‑3’24

[0124] MDV‑R：5‘‑tgattcctag gcaggcgtct c’‑3’21

[0125] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各1μL，2xMax Master Mix buffer 12.5μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足25μL。95℃30s，95℃15s，57℃15s，72℃1min，72℃5min。25个循环。

[0126] 以MDLV21病毒DNA为模板能够扩增出194bp条带，而CVI988/Rispens病毒DNA为模板能够扩增出1461bp条带，Md5病毒DNA为模板能够扩增出1283bp条带(图2)。

[0127] 针对重组病毒MDLV21缺失的CamR基因，在其两侧设计引物Cam‑F/R，序列如下：

[0128] Cam‑F：5’‑tccgcttatt atcacttatt cagg‑3’24

[0129] Cam‑R：5’‑tatgtcccat caggctttgc‑3’20

[0130] PCR扩增体系如下：引物(10μM)各1μL，2xMax Master Mix buffer 12.5μL，模板DNA 1μL， ddH2O补足25μL。95℃30s，95℃15s，55℃15s，72℃0.5min，72℃5min。25个循环。

[0131] 以MDLV21病毒DNA为模板能够扩增出554bp条带，而CVI988/Rispens、Md5病毒DNA 为模板不能能够扩增出条带(图2)。

[0132] 因此，利用引物MDV‑F/R和Cam‑F/R可以鉴别重组病毒MDLV21与疫苗株CVI988/Rispens以及野毒Md5。

[0133] 本方法在缺失基因两侧设计引物，有效避免了在缺失基因内部设计引物不能有效区分是由于基因缺失还是PCR反应无效导致无法扩增出条带引起毒株误判的可能性。

[0134] 实施例3——重组病毒MDLV21在鸡胚成纤维细胞的增殖与稳定性

[0135] 将实施例1的MDLV21与SCA13按100PFU/孔的剂量分别接种长满单层CEF细胞的6 孔板中，放置在含有5％CO2、37℃的细胞培养箱内培养。分别在接种后0、24、48、72、96、 120、144h计算MDV蚀斑数。绘制MDV的增殖曲线，分析MDLV21的增殖情况。培养3‑5d，待出现MDV特异的蚀斑后，用胰酶消化传至铺满单层鸡胚成纤维细胞的6孔细胞培养板上，依次传代培养15代，观察蚀斑形态。每培养5代，提取病毒DNA，利用引物MDV‑F/R进行 PCR扩增鉴定MDLV21的稳定性。PCR扩增体系如下：引物(10μM)各1μL，2xMax Master Mix buffer 12.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足25μL。95℃30s，95℃15s，57℃15s，72℃1min， 72℃5min。25个循环。

[0136] 结果如图3所示表明，重组病毒MDLV21株与亲本病毒SCA13株在鸡胚成纤维细胞的增殖曲线相似，两株病毒在鸡胚成纤维细胞上的增殖能力差异不显著。通过对5代、10代以及 15代重组病毒MDLV21株全基因组的PCR检测，缺失RLORF6、Meq基因位点处依然没有任何碱基插入或者丢失，证实MDLV21株具有稳定性。

[0137] 实施例4——重组病毒MDLV21对鸡的安全性以及免疫保护效果研究

[0138] 将30只SPF鸡随机分为2组，每组15只，分别饲养在消毒隔离罩内。1日龄时，第1组鸡以6000PFU/只的剂量腹腔接种MDLV21，第2组鸡不做任何处理作为空白对照组。接种后每天观察各组鸡的临床症状。试验期间，如果有鸡只死亡，记录死亡数量并对各组死亡鸡进行剖检，并取脏器做石蜡切片，HE染色后进行病理组织学观察，判定是否由MDV引起的死亡。在接种MDV 90天后，所有存活鸡均被处死并剖检，观察记录鸡的病变。分别在接种MDV后 7d、14d、21d称量各组鸡的体重，评价MDLV21对SPF鸡生长性能的影响。7日龄，各组鸡均分别接种NDV灭活油乳苗、AIV‑H9灭活油乳苗各0.3mL。免疫后21d、28d采集血液分离血清，通过血凝血抑试验检测各组鸡经灭活苗诱导产生的新城疫和禽流感抗体滴度，评价 MDLV21对SPF鸡体液免疫应答的影响。整个试验期间，接种MDLV21株疫苗鸡没有出现死亡，存活率为
100％(图4)。相比空白对照鸡，接种MDLV21株疫苗鸡大小均一，生长良好，体重没有显著差异(图5)。通过比较灭活苗诱导产生的新城疫和禽流感抗体滴度，结果表明接种MDLV21株疫苗鸡与空白对照鸡抗体水平相似，没有差异，表明MDLV21株疫苗没有免疫抑制(图6)。

[0139] 将1日龄SPF鸡80只，随机分为4组，每组20只，分别饲养于3个消毒的隔离罩内。1 日龄时，第1组鸡以1000PFU/只的剂量腹腔接种MDLV21，第2组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔免疫CVI988/Rispens疫苗株。第3组作为攻毒对照组，第4组鸡不做任何处理作为空白对照组。接种7天后，第1、2、3组分别以1000PFU/只的剂量接种MDV超强毒Md5。攻毒后每天观察各组鸡的临床症状并记录鸡的死亡数。饲养90天后，所有存活鸡均被处死并剖检观察其病变。疫苗免疫保护效果由保护指数(protective index,PI)来评价，免疫组PI计算方法为攻毒对照组的鸡产生MD病变百分数(MD病变百分数由病变鸡除以每组总鸡数乘以100)减去免疫组鸡产生MD病变百分数再除以攻毒对照组鸡产生MD病变百分数乘以100。结果如下表 1：

[0140] 表1 MDV MDLV21对SPF鸡感染MDV超强毒株Md5的免疫保护效果

[0141]

[0142] 以上结果显示，本发明的重组马立克病毒MDLV21具有更好的疫苗安全性以及有效性，降低了野外获得缺失基因的能力，有利于重组活病毒载体疫苗的应用。