一种生物活性复合材料在牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生方面的应用转让专利
申请号 : CN202010421207.1
文献号 : CN113679887B
文献日 : 2022-05-27
发明人 : 邱东 , 崔杨
申请人 : 中国科学院化学研究所
摘要 :
本发明公开了一种生物活性复合材料在牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生中的应用。所述生物活性复合材料包括经钙离子表面改性的胶体二氧化硅生物活性纳米颗粒和交联的高分子材料。除了促进成骨细胞的迁移、增殖和矿化之外，本发明的生物活性复合材料还可抑制成纤维细胞的迁移、粘附和增殖，抑制成纤维细胞侵入牙周骨的缺损区，有利于牙周骨组织的快速再生和修复，避免纤维组织的侵入与纤维化的产生。因此，可获得不使用屏障膜抑制成纤维细胞侵袭进入骨缺损区的效果，同时促进骨的再生与骨缺损的修复，可大大方便手术操作，降低治疗的手术成本。
权利要求 :
1.一种生物活性复合材料用于制备牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生的生物医用材料的应用，所述生物活性复合材料包括生物活性纳米颗粒和交联的高分子材料；
所述生物活性纳米颗粒为经钙离子表面改性的胶体二氧化硅纳米颗粒；
所述高分子材料选自明胶、胶原和壳聚糖中的一种、两种或更多种组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述生物活性复合材料是水凝胶形式，即生物活性复合水凝胶，或者是水凝胶经冻干后的支架结构形式，即生物活性复合冻干支架。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述生物活性纳米颗粒为经含钙离子的化合物表面改性的胶体二氧化硅纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述含钙离子的化合物为含钙离子的碱类、盐类化合物或配合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述含钙离子的化合物为Ca(OH)2、CaCl2、CaBr2、CaI2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaSO4、Ca(HSO4)2、CaSO3、Ca(HSO3)2、Ca(NO3)2、Ca(CH3COO)2、Ca(CH3O)2和Ca(C2H5O)2中的一种、两种或更多种的混合物。
6.根据权利要求1‑5中任一项所述的应用，其中所述交联的高分子材料的交联剂为戊二醛、京尼平和纤维蛋白中的一种、两种或更多种组合。
7.根据权利要求2所述的应用，其中，基于生物活性复合水凝胶的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于1wt％且小于等于25wt％，交联高分子材料的重量百分含量为大于等于5wt％且小于等于30wt％；
基于生物活性复合冻干支架的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于10wt％且小于等于60wt％，交联高分子材料的重量百分含量为大于等于40wt％且小于等于90wt％。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，基于生物活性复合水凝胶的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于5wt％且小于等于20wt％，交联高分子材料的重量百分含量为大于等于10wt％且小于等于25wt％；
基于生物活性复合冻干支架的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于10wt％且小于等于50wt％，交联高分子材料的重量百分含量为大于等于50wt％且小于等于90wt％。
9.一种生物活性复合材料的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1）：将高分子材料、生物活性纳米颗粒和水混合，得到分散体系；
步骤2）：将步骤1）的分散体系静置，得到初始复合水凝胶；
步骤3）：将步骤2）的初始复合水凝胶置于含有交联剂的溶液中，浸泡，得到交联的复合水凝胶，即生物活性复合水凝胶；
所述生物活性纳米颗粒为经钙离子表面改性的胶体二氧化硅纳米颗粒；
所述高分子材料选自明胶、胶原和壳聚糖中的一种、两种或更多种组合。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中所述方法还包括如下步骤：步骤4）：将步骤3）制备得到的交联的复合水凝胶进行冷冻干燥，即得生物活性复合冻干支架。
11.根据权利要求9或10的制备方法得到的生物活性复合材料用于制备牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生的生物医用材料的应用。
说明书 :
一种生物活性复合材料在牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生
方面的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种生物活性复合材料在牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生方面的应用。
背景技术
[0002] 牙周炎是一种非常普遍的疾病，会导致牙周组织包括牙龈、牙骨质、牙周韧带和牙槽骨的恶化。全世界将近90％的人会受到牙周炎的影响。牙槽骨吸收是牙周炎的特征性病理改变。在生理条件下，牙槽骨吸收和再生处于动态平衡状态。当骨吸收增加或骨再生减少或两者同时发生，牙槽骨就会产生缺损。传统的治疗方法，包括拔牙和刨根，对预防牙周炎症的扩展有效，但不能恢复失去的骨组织。牙周骨移植也是传统的治疗方法，利用自体骨、同种异体骨或骨的替代物如脱钙骨基质及其他合成骨支架等修复牙槽骨缺损。自体骨移植因其组织相容性好，成骨能力强，且无传播疾病的危险，一直被视为临床上骨缺损修复材料的“金标准”，但自体骨移植存在需要取骨手术、供骨区感染、疼痛、供骨量有限等问题；同种异体骨移植虽然来源相对广泛，并且具有良好的骨传导性，却不具备骨诱导性，并存在传播疾病及引起免疫排斥反应的潜在危险；异种骨来源于动物，供应丰富，虽经过各种方法去除其内部的抗原性物质，但仍不能完全避免免疫排斥反应的风险，并存在伦理方面的问题。因此，对人工合成的牙周骨缺损修复材料的需求越来越大。
[0003] 然而，成纤维细胞可以更快地迁移到达缺损区域，形成纤维组织，附着在骨缺损表面，从而阻碍成骨细胞向内迁移并干扰缺损愈合。为了解决这个问题，人们发展了引导骨再生技术(GBR)用于牙周骨缺损的治疗。引导骨再生技术在牙龈组织与骨缺损之间建立屏障膜(GBR膜)，防止成纤维细胞进入骨缺损区，给成骨细胞创造优先进入缺损区的机会，以此实现骨缺损区的修复。Geistlich 胶原膜是临床上最常用的GBR膜，它是由双层的Ⅰ型胶原蛋白构成，一面是多孔层，为成骨细胞的生长提供环境，另一面是致密层，防止成纤维细胞的迁入。 胶原膜价格非常昂贵，患者负担较重。除了上述胶原外，聚乳酸(PLA)或聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)也可作为GBR膜材料，但它们在体内降解慢且降解产物呈酸性，易引发炎症，总体效果不如胶原膜。此外，屏障膜单独使用没有促进牙周骨缺损修复的作用，通常需要骨填充物一起使用，这使得手术更加复杂，成本进一步提高。
[0004] 因此，在牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生领域需要一种能够简化手术操作、成本低、效果好的生物医用材料。
发明内容
[0005] 本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物活性复合材料用于制备牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生的生物医用材料的应用。
[0006] 本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0007] 一种生物活性复合材料用于制备牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生的生物医用材料的应用，所述生物活性复合材料包括生物活性纳米颗粒和交联的高分子材料。
[0008] 根据本发明，所述生物活性纳米颗粒为经钙离子表面改性的胶体二氧化硅纳米颗粒。
[0009] 根据本发明，所述生物活性纳米颗粒为经含钙离子的化合物表面改性的胶体二氧化硅纳米颗粒。
[0010] 优选地，所述含钙离子的化合物可以为含钙离子的碱类、盐类化合物或配合物。例如，所述含钙离子的化合物可以为Ca(OH)2、CaCl2、CaBr2、CaI2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaSO4、Ca(HSO4)2、CaSO3、Ca(HSO3)2、Ca(NO3)2、Ca(CH3COO)2、Ca(CH3O)2和Ca(C2H5O)2中的一种、两种或更多种的混合物。
[0011] 根据本发明，所述生物活性纳米颗粒的大小可以通过改变原料胶体二氧化硅纳米颗粒的大小进行调节。所述生物活性纳米颗粒可以为任何形状的，例如不规则颗粒或球形颗粒。
[0012] 根据本发明，所述生物活性纳米颗粒的粒径为1‑900nm，例如10‑800nm，12‑600nm，25‑300nm，40‑100nm。优选地，所述生物活性纳米颗粒的粒径是均匀的，优选地，其粒径多分散指数(polydispersity index,PDI)小于0.2。
[0013] 根据本发明，所述高分子材料选自明胶、胶原和壳聚糖中的一种、两种或更多种的组合。
[0014] 根据本发明，所述交联高分子材料的交联剂为戊二醛、京尼平和纤维蛋白中的一种、两种或更多种的组合。优选地为戊二醛和京尼平中的一种或两种组合。
[0015] 根据本发明，所述生物活性复合材料可以是水凝胶形式，即生物活性复合水凝胶，也可以是冻干后的支架结构形式，即生物活性复合冻干支架。所述水凝胶和支架结构的形状和尺寸没有特别的限定，可根据所需的应用场所进行调整。
[0016] 根据本发明，基于生物活性复合水凝胶的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于1wt％且小于等于25wt％，优选为大于等于5wt％且小于等于20wt％，交联的高分子材料的重量百分含量为大于等于5wt％且小于等于30wt％，优选为大于等于10wt％且小于等于25wt％。
[0017] 根据本发明，基于生物活性复合冻干支架的总重量计，生物活性纳米颗粒的重量百分含量为大于等于10wt％且小于等于60wt％，优选为大于等于10wt％且小于等于50wt％，交联的高分子材料的重量百分含量为大于等于40wt％且小于等于90wt％，优选为大于等于50wt％且小于等于90wt％。
[0018] 根据本发明，所述生物活性复合冻干支架具有连通的孔道结构。
[0019] 根据本发明，所述生物活性复合冻干支架的孔隙率为50‑99％；抗压强度为2‑20MPa，杨氏模量为20‑200MPa；孔径为30‑500μm。
[0020] 本发明还提供所述生物活性复合材料的制备方法，其包括如下步骤：
[0021] 步骤1)：将高分子材料、生物活性纳米颗粒与水混合，得到分散体系；
[0022] 步骤2)：将步骤1)的分散体系静置，得到初始复合水凝胶；
[0023] 步骤3)：将步骤2)的初始复合水凝胶置于含有交联剂的溶液中浸泡，得到交联的复合水凝胶，即得生物活性复合水凝胶。
[0024] 其中，步骤1)中，所述高分子材料和生物活性纳米颗粒的重量比可以为2:3‑9:1。所述生物活性纳米颗粒和水的重量比可以为1:100‑1:3。
[0025] 所述方法还可包括如下的步骤4)：将步骤3)制备得到的复合水凝胶再经过冷冻干燥，即得生物活性复合冻干支架。
[0026] 所述生物活性纳米颗粒可以通过如下方法制备得到：
[0027] (1)将胶体二氧化硅纳米颗粒在水中分散，形成均匀的分散体系；
[0028] (2)将钙离子(例如含钙离子的化合物的水溶液)加入步骤(1)所得的均匀的分散体系中，于一定温度下磁力或机械搅拌进行混合，离心，洗去未反应的钙离子(例如含钙离子的化合物)，干燥后可获得生物活性纳米颗粒。优选地，所述颗粒的粒径多分散指数小于0.2。
[0029] 本发明还提供通过上述制备方法获得的生物活性复合材料用于制备牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生的生物医用材料的应用。
[0030] 根据本发明，所述牙周骨是哺乳动物、尤其是人的牙周骨。
[0031] 本发明的有益效果
[0032] 目前，常将GBR膜和骨填充材料一起用于牙周骨缺损的修复和/或牙周骨再生，其中GBR膜防止成纤维细胞进入骨缺损区，给成骨细胞创造优先进入缺损区的机会，以此实现骨填充材料对缺损区的修复。但这种方法使得手术操作复杂，治疗成本高。
[0033] 本发明的生物活性复合材料可用于牙周骨缺损修复和/或牙周骨再生领域，生物学实验结果表明，在本发明的生物活性复合材料的存在下，成纤维细胞L929在12小时的迁移率为10‑15％，在24小时的迁移率增长为12‑25％；成纤维细胞GF在12小时的迁移率为5‑15％，在24小时的迁移率增长为10‑20％。在本发明的生物活性复合材料的存在下，成骨细胞MC3T3在12小时的迁移率为70‑150％，在24小时的迁移率增长为180‑250％。在本发明的生物活性复合材料的存在下，成骨细胞MC3T3在7天后的碱性磷酸酶蛋白的表达增长为140‑
180％，14天后的碱性磷酸酶蛋白的表达增长为160‑230％。当水凝胶形式的生物活性复合材料与细胞共培养时，成纤维细胞的存活率为30‑50％，成骨细胞存活率为120‑130％。当支架结构形式的生物活性复合材料与细胞共培养时，成纤维细胞的存活率为10‑40％，成骨细胞存活率为130‑160％。
180％，14天后的碱性磷酸酶蛋白的表达增长为160‑230％。当水凝胶形式的生物活性复合材料与细胞共培养时，成纤维细胞的存活率为30‑50％，成骨细胞存活率为120‑130％。当支架结构形式的生物活性复合材料与细胞共培养时，成纤维细胞的存活率为10‑40％，成骨细胞存活率为130‑160％。
[0034] 可见，除了能够促进成骨细胞的迁移、增殖和矿化之外，本发明的生物活性复合材料还可抑制成纤维细胞的迁移、粘附和增殖。因此，当应用于牙周骨缺损的修复时，本发明的生物活性复合材料能够有效抑制成纤维细胞侵入骨缺损区，避免纤维组织的侵入与纤维化成骨，非常有利于骨组织的快速再生和骨缺损的修复。本发明所提供的生物活性复合材料具有GBR膜和骨填充材料二者组合的功效，不仅能够促进牙槽骨的再生与修复，还可起到抑制成纤维细胞侵袭进入牙周骨缺损区的效果。
[0035] 此外，本发明的生物活性复合材料的制备过程简单，成本低廉，能够显著简化手术操作步骤，缩短手术时间，降低手术的治疗费用，在牙周骨缺损修复和/或再生领域具有良好的前景。
附图说明
[0036] 图1：细胞增殖实验结果：生物活性纳米颗粒的浸提液培养小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)1、3和7天的CCK‑8结果。
[0037] 图2：细胞增殖实验结果：对比例1(非生物活性纳米颗粒)的浸提液培养小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)1、3和7天的CCK‑8结果。
[0038] 图3：细胞迁移实验结果：Transwell方法评估小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)在不同材料趋化作用下迁移12小时后DAPI染色的荧光图像，标尺＝200μm。对照组1为空白对照组，对照组2为对比例2制备的明胶水凝胶材料，对照组3为对比例3制备的非生物活性复合冻干支架材料。实验组1为实施例1制备得到的生物活性复合水凝胶材料，实验组2为实施例3制备得到的生物活性复合冻干支架材料。
[0039] 图4：细胞迁移实验结果：Transwell方法评估小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)在不同材料趋化作用下迁移24小时后DAPI染色的荧光图像，标尺＝200μm。对照组1为空白对照组，对照组2为对比例2制备的明胶水凝胶材料，对照组3为对比例3制备的非生物活性复合冻干支架材料。实验组1为实施例1制备得到的生物活性复合水凝胶材料，实验组2为实施例3制备得到的生物活性复合冻干支架材料。
[0040] 图5：细胞粘附与增殖实验结果：在材料表面接种小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)培养1天的活/死细胞荧光染色激光共聚焦显微图像，标尺＝200μm。对照组1为对比例2制备的明胶水凝胶材料，对照组2为对比例3制备的非生物活性复合冻干支架材料。实验组1为实施例1制备得到的生物活性复合水凝胶材料，实验组2为实施例3制备得到的生物活性复合冻干支架材料。
[0041] 图6：细胞粘附与增殖实验结果：在材料表面接种小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)培养3天的活/死细胞荧光染色激光共聚焦显微图像，标尺＝200μm。对照组1为对比例2制备的明胶水凝胶材料，对照组2为对比例3制备的非生物活性复合冻干支架材料。实验组1为实施例1制备得到的生物活性复合水凝胶材料，实验组2为实施例3制备得到的生物活性复合冻干支架材料。
[0042] 图7：细胞矿化实验结果：(A)MC3T3与复合材料共培养7天和14天的碱性磷酸酶ALP活性。(B)在复合材料上培养MC3T3 14天(a‑e)和21天(f‑j)后的茜素红S染色。(a,f：空白对照组；b,g：对比例2制备的明胶水凝胶材料；c,h：对比例3制备的非生物活性复合冻干支架材料；d,i：实施例1制备得到的生物活性复合水凝胶材料；e,j：实施例3制备得到的生物活性复合冻干支架材料)，标尺＝500μm。
具体实施方式
[0043] 下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 生物学测试方法如下：
[0046] 1.细胞培养
[0047] 为了评价生物活性纳米颗粒对成骨细胞和成纤维细胞的作用，我们选择小鼠成骨细胞系MC3T3‑El，小鼠成纤维细胞系L929和小鼠牙龈成纤维细胞GF作为模型细胞。MC3T3‑E1细胞的培养基包括α‑MEM基础培养基，10％(v/v)胎牛血清，100μg/mL链霉素和100IU/mL青霉素。L929细胞和GF细胞的培养基在DMEM基础培养基上加入10％(v/v)胎牛血清，100μg/mL链霉素和100IU/mL青霉素。细胞均在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
[0048] 当培养瓶中的细胞贴壁生长至融合度80‑90％时，开始传代。弃去原来的培养基，使用2mL缓冲液PBS清洗细胞2次，轻轻摇晃培养瓶，充分洗去细胞废液及漂浮细胞。加入0.25％含有EDTA的胰酶消化培养瓶中的细胞，在显微镜下观察细胞形态变圆，弃去胰酶，加入2mL培养基，将细胞充分吹打至完全脱落下来。按照1:3的比例传代，重新加入5mL新鲜的培养基。将培养瓶放入37℃，含5％CO2的培养箱中培养。每间隔2或3天更换一次培养基。
[0049] 2.细胞毒性测试
[0050] 采用CCK‑8法检测不同浓度纳米颗粒与细胞共培养后细胞的存活率。使用多模式微孔板分析仪测量样品在450nm处的吸光度(O.D.)值。样品分别用紫外灯灭菌，再与完全培养基混合，按照不同浓度制备颗粒的浸提液，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中浸提72h。待4
细胞消化后，按每毫升3×10个细胞的细胞悬浮液密度，取100μL细胞悬浮液接种在96孔板中，在细胞培养箱中培养1、3和7天。培养基每2天更换一次。与此同时，以未加任何干预的新鲜完全培养基作为对照。将CCK‑8按照1:10的比例加入各孔中，37℃孵育2小时。测试每组四个样品的结果取平均值。将对照组的细胞活性设为100％，其他孔的细胞活性计算如下：
细胞消化后，按每毫升3×10个细胞的细胞悬浮液密度，取100μL细胞悬浮液接种在96孔板中，在细胞培养箱中培养1、3和7天。培养基每2天更换一次。与此同时，以未加任何干预的新鲜完全培养基作为对照。将CCK‑8按照1:10的比例加入各孔中，37℃孵育2小时。测试每组四个样品的结果取平均值。将对照组的细胞活性设为100％，其他孔的细胞活性计算如下：
[0051]
[0052] 3.细胞迁移测试
[0053] 利用transwell小室研究成骨细胞和成纤维细胞在材料诱导下的细胞的迁移。利用24孔板transwell小室(8.0μm聚碳酸酯膜)建立了材料与细胞的间接共培养模型。每组3个平行样本。不同的材料分别放置在每个实验组的下室。对照组不放入材料。每一个小室的5
上室添加200μL细胞密度为1×10 /mL的细胞悬液，下室加入500μL的α‑MEM或DMEM完全培养基。在37℃下细胞迁移12小时和24小时后，用棉棒小心擦除未迁移的细胞，使用2.5％的戊二醛固定细胞30分钟。然后用10μg/mL的DAPI染色液在室温下避光染色30分钟。在倒置激光共聚焦显微镜下，在10倍镜下并随机选择8‑10个视野范围观察，统计细胞向下室迁移的细胞数量。细胞迁移率的计算公式如下：
上室添加200μL细胞密度为1×10 /mL的细胞悬液，下室加入500μL的α‑MEM或DMEM完全培养基。在37℃下细胞迁移12小时和24小时后，用棉棒小心擦除未迁移的细胞，使用2.5％的戊二醛固定细胞30分钟。然后用10μg/mL的DAPI染色液在室温下避光染色30分钟。在倒置激光共聚焦显微镜下，在10倍镜下并随机选择8‑10个视野范围观察，统计细胞向下室迁移的细胞数量。细胞迁移率的计算公式如下：
[0054]
[0055] 4.细胞矿化与成骨能力测试
[0056] 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞矿4
化是骨形成的重要过程。为了测定MC3T3的细胞外基质矿化情况，将MC3T3以每孔2×10 个细胞的密度接种于样品上。实验样品都经过紫外线灭菌处理后置于24孔板中。不同材料培养MC3T3细胞，无干扰的完全培养基作为对照组。培养基每2天更换一次。细胞与不同样品组共培养14天和21天后，用2.5％的戊二醛固定30分钟，PBS洗涤3次，在室温下用0.2％的茜素红S溶液染色30分钟。茜素红S染色图像在倒置显微镜10倍镜下拍摄。
化是骨形成的重要过程。为了测定MC3T3的细胞外基质矿化情况，将MC3T3以每孔2×10 个细胞的密度接种于样品上。实验样品都经过紫外线灭菌处理后置于24孔板中。不同材料培养MC3T3细胞，无干扰的完全培养基作为对照组。培养基每2天更换一次。细胞与不同样品组共培养14天和21天后，用2.5％的戊二醛固定30分钟，PBS洗涤3次，在室温下用0.2％的茜素红S溶液染色30分钟。茜素红S染色图像在倒置显微镜10倍镜下拍摄。
[0057] 碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞成熟的特异性标志物，是成骨细胞分泌功能和骨代谢的重要指标。ALP对骨矿化有重要影响，与成骨能力相关。4
将灭菌后的样品置于24孔板中。然后，将MC3T3以每孔2×10 个细胞的密度接种在24孔板中，使用材料培养MC3T3细胞，对照组为细胞的完全培养基。培养基每2天更换一次。在培养7天或14天之后，使用ALP检测试剂盒评估各组细胞的ALP活性。使用BCA蛋白检测试剂盒测定细胞总蛋白量。ALP活性以胞内总蛋白含量进行归一化。
将灭菌后的样品置于24孔板中。然后，将MC3T3以每孔2×10 个细胞的密度接种在24孔板中，使用材料培养MC3T3细胞，对照组为细胞的完全培养基。培养基每2天更换一次。在培养7天或14天之后，使用ALP检测试剂盒评估各组细胞的ALP活性。使用BCA蛋白检测试剂盒测定细胞总蛋白量。ALP活性以胞内总蛋白含量进行归一化。
[0058] 5.细胞粘附和增殖测试
[0059] 为了评价材料上的细胞粘附和增殖，将材料(d＝12mm,h＝2mm)置于24孔板上，在4
紫外线照射下灭菌24小时。将MC3TC‑E1、L929和GF细胞分别以每毫升3×10 细胞的密度接种在材料表面，在细胞培养箱中培养1和3天。培养基更换为由calcein‑AM(2μmol/L)和碘化丙啶(4μmol/L)组成的活/死染色液，每孔加入500μL的活/死染色液浸没材料，在室温避光孵育30分钟。用PBS洗涤三次。然后在倒置激光共聚焦显微镜下观察材料上细胞的粘附情况，放大倍数为10倍，激发光波长为488nm和561nm。
紫外线照射下灭菌24小时。将MC3TC‑E1、L929和GF细胞分别以每毫升3×10 细胞的密度接种在材料表面，在细胞培养箱中培养1和3天。培养基更换为由calcein‑AM(2μmol/L)和碘化丙啶(4μmol/L)组成的活/死染色液，每孔加入500μL的活/死染色液浸没材料，在室温避光孵育30分钟。用PBS洗涤三次。然后在倒置激光共聚焦显微镜下观察材料上细胞的粘附情况，放大倍数为10倍，激发光波长为488nm和561nm。
[0060] 制备例1：生物活性纳米颗粒的制备及生物学测试结果
[0061] 将0.2mL 3‑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和0.6mL乙酸异戊酯加入到40mL纯水中。溶液的pH调节至10。超声15分钟后，通入氮气20分钟，去除反应瓶中的氧气。将混合物体系加热至70℃，加入10mg过硫酸钾，聚合反应持续20小时后终止反应。然后离心机以10000rpm的转速离心15分钟，收集得到白色沉淀，用乙醇洗涤沉淀三次。将纳米颗粒分散在水中形成胶体溶液。将300mL饱和Ca(OH)2溶液加入到上述颗粒的胶体溶液中，Ca(OH)2与纳米颗粒的摩尔比50:1。该体系在25℃搅拌24小时之后，通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到生物活性纳米颗粒。
[0062] 将不同浓度的上述制备得到的生物活性纳米颗粒浸泡在细胞的培养基中72小时后得到的生物活性纳米颗粒的溶出产物，即为生物活性纳米颗粒的浸提液，并用该浸提液培养小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)1、3和7天，观察CCK‑8结果。结果如图1所示。图1中的5mg/mL的含义是生物活性纳米颗粒的浓度，即每1mL培养基含有5mg颗粒。对照的含义是不加入生物活性纳米颗粒即正常的细胞培养基。
[0063] 结果表明，生物活性纳米颗粒在低浓度范围能够促进成骨细胞的增殖，随着颗粒浓度的增加，成纤维细胞的抑制增殖效果逐渐显著，同时也能促进成骨细胞的增殖。
[0064] 制备例2：生物活性纳米颗粒的制备
[0065] 在室温下将4.48mL固含量为40％的二氧化硅分散液(Ludox TM40)和4mL3‑异丁烯酰氧丙基三甲氧基硅烷加入到150mL纯水中，搅拌24小时形成乳液。向乳液中通入氮气，除氧30分钟后，将体系升温到70℃，加入25mg过硫酸钾引发聚合，聚合反应持续24小时。将乳液在11000rpm下离心15分钟，收集得到白色沉淀，用乙醇洗涤沉淀三次。将100mL饱和CaCl2溶液加入到上述颗粒的胶体溶液中，CaCl2与纳米颗粒的摩尔比100:1。该体系在15℃搅拌48小时之后，通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到生物活性纳米颗粒。
[0066] 制备例3：生物活性纳米颗粒的制备
[0067] 在室温下将0.56mL固含量为40％的二氧化硅分散液(Ludox TM40)加入到40mL纯水中，随后加入0.5mL硅烷偶联剂KH570与1.5mL乙酸异戊酯的混合物，搅拌12小时形成乳液。向乳液中通入氮气，除氧30分钟后，将体系升温到70℃，加入10mg过硫酸钾引发聚合，聚合反应持续12小时。将乳液在12000rpm下离心10分钟，收集得到白色沉淀，用乙醇洗涤沉淀三次。将纳米颗粒分散在水中形成胶体溶液。将纳米颗粒分散在水中形成胶体溶液。将150mL Ca(OH)2溶液加入到上述颗粒的胶体溶液中，Ca(OH)2与纳米颗粒的摩尔比30:1。该体系在30℃搅拌12小时之后，通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到生物活性纳米颗粒。
[0068] 制备例4：生物活性纳米颗粒的制备
[0069] 在室温下将1mL 3‑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷加入到350mL纯水中，溶液的pH调节至10.1，在搅拌下加入3mL乙酸异戊酯。超声15分钟后，通入氮气15分钟。将混合物体系加热至70℃，加入0.05g过硫酸钾引发聚合反应，反应持续8小时后终止反应。然后离心机以10000rpm的转速离心15分钟，收集得到白色沉淀，用乙醇洗涤沉淀三次。将纳米颗粒分散在水中形成胶体溶液。将80mL饱和Ca(OH)2与CaCl2的混合溶液，Ca(OH)2与CaCl2的摩尔比为2:1，加入到上述颗粒的胶体溶液中，Ca(OH)2与纳米颗粒的摩尔比60:1。该体系在20℃搅拌
15小时之后，通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到生物活性纳米颗粒。
15小时之后，通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到生物活性纳米颗粒。
[0070] 实施例1：生物活性复合水凝胶的制备及生物学测试结果
[0071] 将4g明胶分散于10mL去离子水中，在60℃下搅拌1小时，得到明胶溶液。1g上述制备例1制备的生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声5分钟。在磁力搅拌下，向上述明胶溶液中加入生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在20℃下保持2小时，形成初始复合水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶在质量分数1％京尼平水溶液中浸泡20小时，得到交联的复合水凝胶，即生物活性复合水凝胶。将交联后的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中3天，每隔6小时更换一次甘氨酸水溶液。
[0072] 将制备得到的生物活性复合水凝胶材料与细胞共培养，成纤维细胞L929的存活率为36.6％，成骨细胞MC3T3的存活率为123.7％。说明该复合材料能够抑制成纤维细胞增殖与生长，促进成骨细胞的增殖与生长。成纤维细胞L929在12小时的迁移率为11.2％，在24小时的迁移率增长为21.2％。成纤维细胞GF在12小时的迁移率为11.6％，在24小时的迁移率增长为16.9％。成骨细胞MC3T3在12小时的迁移率为85.4％，在24小时的迁移率增长为194.9％。说明所述复合水凝胶材料能够抑制成纤维细胞的迁移，促进成骨细胞的迁移。将制备得到的生物活性复合水凝胶与成骨细胞MC3T3共培养7天和14天，碱性磷酸酶(ALP)的活性相较空白对照组的ALP活性分别增长至143％和163％，说明所述复合水凝胶能够促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶蛋白。将制备得到的生物活性复合水凝胶与成骨细胞MC3T3共培养14天和21天，茜素红S染色的钙矿化结节面积明显增加，说明所述复合水凝胶材料能够促进成骨细胞的矿化。
[0073] 实施例2：生物活性复合水凝胶的制备及生物学测试结果
[0074] 将2g胶原分散于10mL浓度为0.5mol/L的醋酸水溶液中，在30℃下搅拌2小时得到胶原溶液。0.5g上述制备例2制备的生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声3分钟。在磁力搅拌下，向上述胶原溶液中加入生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在10℃下保持3小时，形成初始复合水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶浸泡在质量分数1％戊二醛水溶液中24小时，得到交联的复合水凝胶。将交联后的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中2天，每隔4小时更换一次甘氨酸水溶液。
[0075] 将制备得到的生物活性复合水凝胶材料与细胞共培养，成纤维细胞L929的存活率为38.8％，成骨细胞MC3T3的存活率为122.6％。说明所述复合水凝胶材料能够抑制成纤维细胞增殖与生长，促进成骨细胞的增殖与生长。
[0076] 实施例3：生物活性复合冻干支架的制备及生物学测试结果
[0077] 将1g明胶分散于10mL去离子水中，在50℃下搅拌2小时，得到明胶溶液。0.5g上述制备例3制备的生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声5分钟。在磁力搅拌下，向上述明胶溶液中加入生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在10℃下保持1小时，形成初始复合水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶浸泡在质量分数2％的戊二醛水溶液中12小时，得到交联的复合水凝胶。将交联后的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中3天，每隔6小时更换一次甘氨酸水溶液。将浸泡后的复合水凝胶放入‑20℃冰箱中12小时，放入冷冻干燥机中‑60℃冻干2天，得到冻干的复合支架，即生物活性复合冻干支架。该冻干支架的压缩强度为11.4±0.7MPa，杨氏模量为137.2±17.0MPa，孔隙率为87.4±1.4％。
[0078] 将制备得到的生物活性复合冻干支架材料与细胞共培养，成纤维细胞的存活率L929为12.2％，成骨细胞MC3T3的存活率为158.1％。说明所述复合冻干支架材料能够抑制成纤维细胞增殖与生长，促进成骨细胞的增殖与生长。成纤维细胞L929在12小时的迁移率抑制为10.2％，在24小时的迁移率抑制为14.4％。成纤维细胞GF在12小时的迁移率抑制为7.6％，在24小时的迁移率抑制为11.6％。成骨细胞MC3T3在12小时的迁移率为131％，在24小时的迁移率增长为226.5％。说明所述复合冻干支架材料能够抑制成纤维细胞的迁移，促进成骨细胞的迁移。将制备得到的生物活性复合冻干支架与成骨细胞MC3T3共培养7天和14天，碱性磷酸酶(ALP)的活性相较空白对照组的ALP活性分别增长至179％和221％，说明所述复合冻干支架能够促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶蛋白。将制备得到的生物活性复合冻干支架与成骨细胞MC3T3共培养14天和21天，茜素红S染色的钙矿化结节面积明显增加，说明所述复合冻干支架材料能够促进成骨细胞的矿化。
[0079] 实施例4：生物活性复合冻干支架的制备及生物学测试结果
[0080] 将1g胶原分散于10mL浓度为0.1mol/L的醋酸水溶液中，在20℃下搅拌3小时，得到胶原溶液。0.3g上述制备例4制备的生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声2分钟。在磁力搅拌下，向上述胶原溶液中加入生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在15℃下保持2小时，形成初始复合水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶浸泡在质量分数0.5％京尼平水溶液中48小时，得到交联的复合水凝胶。将交联后的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中3天，每隔6小时更换一次甘氨酸水溶液。将浸泡后的复合水凝胶放入‑20℃冰箱中24小时，放入冷冻干燥机中‑60℃冻干3天，得到冻干的复合支架，即生物活性复合冻干支架。该冻干支架的压缩强度为12.8±0.4MPa，杨氏模量为
144.0±19.8MPa，孔隙率为85.1±1.2％。
144.0±19.8MPa，孔隙率为85.1±1.2％。
[0081] 将制备得到的生物活性复合冻干支架材料与细胞共培养，成纤维细胞L929的存活率为36.8％，成骨细胞MC3T3的存活率为138.2％。说明所述复合冻干支架材料能够抑制成纤维细胞增殖与生长，促进成骨细胞的增殖与生长。
[0082] 实施例5：生物活性复合水凝胶的制备及生物学测试结果
[0083] 将0.2g壳聚糖和2.2g明胶分散于10mL质量分数1％的醋酸水溶液中，在65℃下搅拌3小时，得到高分子溶液。0.4g上述制备例1制备的生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声5分钟。在磁力搅拌下，向上述高分子溶液中加入生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在25℃下保持2小时，形成初始复合水凝胶。随后，将预成型的水凝胶浸泡在质量分数1％戊二醛水溶液中24小时，得到交联的复合水凝胶，即生物活性复合水凝胶。将交联后的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中2天，每隔4小时更换一次甘氨酸水溶液。
[0084] 将制备得到的生物活性复合水凝胶材料与细胞共培养，成纤维细胞L929的存活率为49.6％，成骨细胞MC3T3的存活率为122.1％。说明该复合水凝胶材料能够抑制成纤维细胞增殖与生长，促进成骨细胞的增殖与生长。
[0085] 对比例1：非生物活性纳米颗粒的制备及生物学测试结果
[0086] 将0.2mL 3‑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和0.6mL乙酸异戊酯加入到40mL纯水中。溶液的pH调节至10。超声30分钟后，通入氮气20分钟，去除反应瓶中的氧气。将混合物体系加热至70℃，加入10mg过硫酸钾，聚合反应持续20小时后终止反应。然后离心机以10000rpm的转速离心15分钟，收集得到白色沉淀，用乙醇洗涤沉淀三次。通过离心收集沉淀并用纯水洗涤，干燥后得到非生物活性纳米颗粒。
[0087] 将不同浓度的上述制备得到的非生物活性纳米颗粒浸泡在细胞的培养基中72小时后得到的非生物活性纳米颗粒的溶出产物，即为非生物活性纳米颗粒的浸提液，并用该浸提液培养小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)1、3和7天，观察CCK‑8结果。结果如图2所示。图2中的5mg/mL的含义是非生物活性纳米颗粒的浓度，即每1mL培养基含有5mg颗粒。对照的含义是不加入非生物活性纳米颗粒即正常的细胞培养基。
[0088] 结果显示，所制备的非生物活性纳米颗粒在低浓度下对成纤维细胞和成骨细胞的增殖没有显著影响，既不能抑制成纤维细胞的增殖，也不能促进成骨细胞的增殖。而随着非生物活性纳米颗粒浓度的增加，成骨细胞和成纤维细胞的增殖都得到了抑制。更具体地，非生物活性纳米颗粒在5‑25mg/mL范围内对成纤维细胞和成骨细胞的增殖没有不良影响，而随着非生物活性颗粒浓度增加至50‑75mg/mL，成骨细胞和成纤维细胞的增殖都得到了抑制，成纤维细胞的存活率为52.8％，成骨细胞的存活率为43.7％，牙龈成纤维细胞的存活率为37.9％。说明所述非生物活性纳米颗粒不能在同一浓度下同时实现促进成骨细胞增殖和抑制成纤维细胞增殖的双重效果。
[0089] 对比例2：明胶水凝胶的制备及生物学测试结果
[0090] 将2g明胶分散于10mL去离子水中，在60℃下搅拌1小时。搅拌混合均匀后，将透明溶液倒入聚四氟乙烯模具中，在室温下保持1小时，形成初始水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶在质量分数1％戊二醛水溶液中浸泡48小时，得到交联的明胶水凝胶。将交联后的明胶水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中3天，每隔6小时更换一次甘氨酸水溶液。
[0091] 将制备得到的明胶水凝胶与细胞共培养，成纤维细胞的存活率L929为95.2％，成骨细胞MC3T3的存活率为98.8％。说明所述明胶水凝胶不能抑制成纤维细胞增殖，也不能促进成骨细胞的增殖。将制备得到的明胶水凝胶材料与细胞共培养，成纤维细胞L929在12小时的迁移率为92.7％，在24小时的迁移率增长为258.8％。成纤维细胞GF在12小时的迁移率为69.2％，在24小时的迁移率增长为122.6％。成骨细胞MC3T3在12小时的迁移率为40.9％，在24小时的迁移率增长为136.9％。与空白对照相比没有显著变化，说明所述明胶水凝胶材料不能够抑制成纤维细胞增殖与迁移。将制备得到的明胶水凝胶与成骨细胞MC3T3共培养7天和14天，碱性磷酸酶(ALP)的活性相较空白对照组的ALP活性没有增加，说明所述明胶水凝胶不能促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶蛋白。将制备得到的明胶水凝胶与成骨细胞MC3T3共培养14天和21天，茜素红S染色的钙矿化结节面积相较空白对照组的面积没有增多，说明所述明胶水凝胶不能促进成骨细胞的矿化。
[0092] 对比例3：非生物活性复合冻干支架的制备及生物学测试结果
[0093] 将2g明胶分散于10mL去离子水中，在60℃下搅拌1小时，得到明胶溶液。0.5g上述对比例1制备的非生物活性纳米颗粒分散在2mL去离子水中，超声5分钟。在磁力搅拌下，向上述明胶溶液中加入非生物活性纳米颗粒悬浮液，搅拌混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中，在室温下保持1小时，形成初始水凝胶。随后，在室温下将预成型的水凝胶在质量分数1％戊二醛水溶液中浸泡48小时，得到交联的复合水凝胶。将制备得到的复合水凝胶浸泡在质量分数1％甘氨酸水溶液中3天，每隔6小时更换一次甘氨酸水溶液。将浸泡后的复合水凝胶放入‑20℃冰箱中12小时，放入冷冻干燥机中‑60℃冻干2天，得到冻干的复合支架，即非生物活性复合冻干支架。
[0094] 将制备得到的非活性复合冻干支架材料与细胞共培养，成纤维细胞的存活率L929为94.9％，成骨细胞MC3T3的存活率为95.2％。说明所述复合冻干支架材料不能抑制成纤维细胞增殖，也不能促进成骨细胞的增殖。将制备得到的非活性复合冻干支架材料与细胞共培养，成纤维细胞L929在12小时的迁移率为96.5％，在24小时的迁移率增长为265.3％。成纤维细胞GF在12小时的迁移率为64.6％，在24小时的迁移率增长为112.4％。成骨细胞MC3T3在12小时的迁移率为38.4％，在24小时的迁移率增长为135.3％。与空白对照相比没有显著变化，说明所述非生物活性复合冻干支架材料不能够抑制成纤维细胞增殖与迁移。将制备得到的非生物活性复合冻干支架与成骨细胞MC3T3共培养7天和14天，碱性磷酸酶(ALP)的活性相较空白对照组的ALP活性没有增加，说明所述非生物活性复合冻干支架不能促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶蛋白。将制备得到的非生物活性复合冻干支架与成骨细胞MC3T3共培养14天和21天，茜素红S染色的钙矿化结节面积相较空白对照组的面积没有增多，说明所述非生物活性复合冻干支架不能促进成骨细胞的矿化。
[0095] 上述实施例和对比例的实验结果如图3‑7所示。
[0096] 图3：细胞迁移实验结果：Transwell方法评估小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)在不同材料趋化作用下迁移12小时后DAPI染色的荧光图像，标尺＝200μm。结果表明实施例1和实施例3的复合材料能够促进小鼠成骨细胞MC3T3‑E1的迁移，同时抑制小鼠成纤维细胞L929和小鼠牙龈成纤维细胞GF的迁移。
[0097] 图4：细胞迁移实验结果：Transwell方法评估小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)、小鼠成纤维细胞(L929)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)在不同材料趋化作用下迁移24小时后DAPI染色的荧光图像，标尺＝200μm。结果表明实施例1和实施例3的复合材料能够促进小鼠成骨细胞MC3T3‑E1的迁移，同时抑制小鼠成纤维细胞L929和小鼠牙龈成纤维细胞GF的迁移。且随着作用时间的延长效果愈加明显。
[0098] 图5：细胞粘附与增殖实验结果：在材料表面接种小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)培养1天的活/死细胞荧光染色激光共聚焦显微图像，标尺＝200μm。结果表明实施例1和实施例3的复合材料能够促进小鼠成骨细胞MC3T3‑E1的粘附和增殖，同时抑制小鼠成纤维细胞L929和小鼠牙龈成纤维细胞GF的粘附和增殖。
[0099] 图6：细胞粘附与增殖实验结果：在材料表面接种小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠成骨细胞(MC3T3‑E1)和小鼠牙龈成纤维细胞(GF)培养3天的活/死细胞荧光染色激光共聚焦显微图像，标尺＝200μm。结果表明实施例1和实施例3的复合材料能够促进小鼠成骨细胞MC3T3‑E1的粘附和增殖，同时抑制小鼠成纤维细胞L929和小鼠牙龈成纤维细胞GF的粘附和增殖。且随着作用时间的延长效果愈加明显。
[0100] 图7：细胞矿化实验结果：(A)MC3T3与复合材料共培养7天和14天的碱性磷酸酶ALP活性。(B)在复合材料上培养MC3T3 14天(a‑e)和21天(f‑j)后的茜素红S染色。结果表明实施例1和实施例3的复合材料能够促进小鼠成骨细胞MC3T3‑E1的矿化。且随着作用时间的延长效果愈加明显。
[0101] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。