SARS-CoV-2 N蛋白抗体及其应用

摘要

本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2N蛋白抗体及其应用。本发明所提供的两个抗体具有互补的表位，二者能够互相配合，有效提供改善灵敏度，提高检出率；又可以提高特异性，降低假阳性。

权利要求

1.抗体，其能够特异性结合SARS‑CoV‑2 N蛋白，选自a或b；

a）包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1 3所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑~CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4 6所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑~CDR3；

b）包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7 9所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑~CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:10 12所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑~CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体，a和b独立的选自小鼠来源抗体、人‑小鼠嵌合抗体以及人源化抗体。

3. 根据权利要求1所述的抗体，a的重链可变区如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区如SEQ ID NO:14所示；

和/或；

b的重链可变区如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区如SEQ ID NO:16所示。

4.根据权利要求1 3任一项所述的抗体，a和b具有恒定区。

~

5.根据权利要求4所述的抗体，a的恒定区为IgG1或IgM，b的恒定区为IgG1或IgM。

6.核酸，其编码权利要求1 5任一项所述的抗体。

~

7.载体，其包含权利要求6所述的核酸。

8.宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的核酸或被权利要求7所述的载体所转化。

9. 生产权利要求1 5任一项所述的抗体的方法，包括：~

在合适的培养条件下培养权利要求8所述的宿主细胞；以及从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体。

10.固相载体，其表面包被有权利要求4或5所述的抗体，且同时具有a和b。

11.试剂盒，其包含权利要求10所述的固相载体。

12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其还包含特异性识别SARS‑CoV‑2 N蛋白、且能够与a和b配对使用的第二抗体。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，所述第二抗体为多克隆抗体。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，所述第二抗体的种属来源非人，且与a和b的种属来源也不同。

15.根据权利要求12 14任一项所述的试剂盒，其还包含特异性识别所述第二抗体Fc段~的第三抗体，所述第三抗体缀合有可检测的信号物质。

16.试剂、试剂盒或试纸条，其包含权利要求1 5任一项所述的抗体。

~

说明书

SARS‑CoV‑2 N蛋白抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2 N蛋白抗体及其应用。

背景技术

[0002] 冠状病毒(CoVs；冠状病毒科亚科，冠状病毒科，病毒目)是一组高度多样性，有包膜的，正义链，单链RNA病毒，在多种动物中引起不同严重程度的呼吸道，肠道，肝和神经系统疾病，包括人类。冠状病毒分为四个属：α冠状病毒，β冠状病毒(βCoV)，γ冠状病毒和δ冠状病毒。在过去的12年中，出现了两种新型的β‑冠状病毒，即严重的急性呼吸道综合症(SARS‑CoV)和中东呼吸道综合症(MERS‑CoV)，这两种病毒会引起严重的人类疾病。

[0003] 2019新型冠状病毒，被世界卫生组织命名为“2019‑nCoV”，后被国际病毒分类委员会命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)”。SARS‑CoV‑2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。其同源性与急性呼吸道综合症(SARS‑CoV)达到80％以上，其中的两者的结构蛋白Nucleocapsid protein同源性为94.1％，两者的Spike protein同源性为84.1％。

[0004] 抗原检测指的是应用SARS‑CoV‑2特异性抗体直接检测样本中的病原体上的结构蛋白，该检测结果可直接显示机体是否感染病原体，具有操作简便、报告时间段等优势。SARS‑CoV‑2结构蛋白有刺突蛋白(Spike protein,跨膜蛋白，同源三聚体结构，如“冠状”分布于病毒表面，是介导病毒感染细胞的核心组分)、核衣壳蛋白(Nucleoprotein，是新冠病毒结构蛋白中表达丰度最高的组分)、包膜蛋白(Envelope Protein)和膜蛋白(Membrane Protein)。其中刺突蛋白和核衣壳蛋白是最常用的两种抗原检测靶标。由于刺突蛋白与病毒逃逸免疫机体相关，容易突变，而核衣壳蛋白(N蛋白)的保守性较强、丰度较高，具有较强的抗原性，其抗原决定簇是特异性抗体结合的主要位点。因此选择以核衣壳蛋白(N蛋白)作为抗原检测的靶点。

[0005] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明涉及抗体，其能够特异性结合SARS‑CoV‑2 N蛋白，选自a和/或b；

[0007] a)包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑CDR3；

[0008] b)包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7～9所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:10～12所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑CDR3。

[0009] 本发明还涉及核酸，其编码如上所述的抗体。

[0010] 本发明还涉及载体，其包含如上所述的核酸。

[0011] 本发明还涉及宿主细胞，其包含如上所述的核酸或被如上所述的载体所转化。

[0012] 本发明还涉生产如上所述的抗体的方法，包括：

[0013] 在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及

[0014] 从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体。

[0015] 本发明还涉及固相载体，其表面包被有如上所述的抗体，且同时具有a和b。

[0016] 本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的固相载体。

[0017] 本发明还涉及试剂、试剂盒或试纸条，其包含如上所述的抗体。

[0018] 本发明的有益效果为：

[0019] 本发明所提供的两个抗体具有互补的表位，二者能够互相配合，有效提供改善灵敏度，提高检出率；又可以提高特异性，降低假阳性。

附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0021] 图1为本发明一个实施例中新型冠状病毒N蛋白抗原的SDS‑PAGE结果图；

[0022] 图2为本发明一个实施例中所制备的抗体的SDS‑PAGE结果图；

[0023] 图3为本发明一个实施例中pFUSE‑CHIg‑mG1的载体图谱；

[0024] 图4为本发明一个实施例中pFUSE2‑CLIg‑mk的载体图谱；

[0025] 图5为本发明一个实施例中pFUSE‑CHIgM的载体图谱；

[0026] 图6为本发明一个实施例中制备的IgG1嵌合抗体SDS‑PAGE电泳图；

[0027] 图7为本发明一个实施例中IgM嵌合抗体SDS‑PAGE电泳图。

具体实施方式

[0028] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0029] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0030] 本发明涉及一种抗体，其能够特异性结合SARS‑CoV‑2 N蛋白，选自a和/或b；

[0031] a)包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑CDR3；

[0032] b)包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7～9所示的重链互补决定区H‑CDR1、H‑CDR2、H‑CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:10～12所示的轻链互补决定区L‑CDR1、L‑CDR2、L‑CDR3。

[0033] 术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，如Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest,5th Ed"US Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在另一具体实施方式中，CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。

[0034] 术语“重链”在本文中理解为包括全长重链，该重链包含具有决定抗原特异性的氨基酸序列的可变区(VH)和具有三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)的恒定区，以及它们的片段。同样，术语“轻链”在本文中包括全长轻链，该轻链包含具有决定抗原特异性的氨基酸序列的可变区(VL)，还包含恒定区(CL)，以及它们的片段。此外，在本发明中，若非特别强调，可变区从由如下顺序串联得到FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4。

[0035] 术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑8对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10 M、10 M、10 M、10 M、10 M、‑9 ‑10
10 M或10 M或更小的亲和力(KD)结合。靶向通常是特异性结合。

[0036] 抗体的变体也在本发明范围内，例如各自与本发明所述的各个CDR或FR、或可变区VL和/或VH、或抗体全长的氨基酸或核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％同一性的序列。在一些情况下，抗体的变体至少包括上述6个CDR；在一些情况下，抗体的变体至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。在一些情况下，抗体的变体是在本发明所提供的抗体序列上发生保守修饰或保守置换或取代所得到的。“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。所属领域技术人员将能够使用熟知的技术确定如本文所阐明的抗原结合分子的合适变体。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“同一性”表明当具有适当的插入或缺失的情况下最佳比对和比较时两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。

[0037] 在一些实施方式中，a和b独立的选自小鼠来源抗体、人‑小鼠嵌合抗体以及人源化抗体。

[0038] 术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。

[0039] 术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR‑grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库
(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。

[0040] 在一些实施方式中，a的重链可变区如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区如SEQ ID NO:14所示。

[0041] 在一些实施方式中，b的重链可变区如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区如SEQ ID NO:16所示。

[0042] 在一些实施方式中，a和b具有恒定区。

[0043] 在一些实施方式中，a和b的重链恒定区分别独立的选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的恒定区。

[0044] 在一些实施方式中，a的恒定区为IgG1或IgM，b的恒定区为IgG1或IgM。

[0045] 在一些实施方式中，a的恒定区为IgG1，b的恒定区为IgM。

[0046] 在一些实施方式中，a的恒定区为IgM，b的恒定区为IgG1。

[0047] 在一些实施方式中，a的恒定区为IgM，b的恒定区为IgM。

[0048] 在一些实施方式中，a的恒定区为IgG1，b的恒定区为IgG1。

[0049] 在一些实施方式中，a和b至少一种的恒定区为IgM。

[0050] 在最优选的实施方式中，a的恒定区为IgM，b的恒定区为IgG1。

[0051] 通过使用IgM嵌合抗体作为捕获抗体，增加抗原结合位点，提高反应灵敏度。

[0052] 在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人，优选为人。

[0053] 在一些实施方式中，所述抗体还可以包括分泌信号序列。

[0054] 分泌信号序列是指，通过连接至编码序列位于细胞膜外侧或细胞外侧的N端而诱导所表达的蛋白或肽的分泌的序列，所述信号序列可以是由约18～30个氨基酸组成的肽序列。所有能转运到细胞膜外侧的蛋白有不同的信号序列，所述信号序列被细胞膜上的信号肽酶切割。通常，对于并非宿主细胞天然表达的外来蛋白而言，可以采用能将该蛋白分泌到细胞周质或培养基中的分泌信号序列，或采用修饰的序列。

[0055] 本发明还涉及分离的核酸，其编码如上所述的双特异性抗体。

[0056] 核酸通常是RNA或DNA，核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA核酸。此外，核酸分子可根据不同的宿主细胞进行密码子优化。

[0057] 本发明还涉及载体，其包含如上所述的的核酸。

[0058] 术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

[0059] 本发明还提供宿主细胞，其包含如上所述的核酸或被如上所述的载体所转化。

[0060] 适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO、COS、HEK、成纤维细胞和骨髓瘤细胞。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。或者，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。

[0061] 可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞。用于表达的各种大肠杆菌菌株，是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株，也可以用于该方法中。

[0062] 如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。

[0063] 根据本发明的再一方面，还涉及一种生产如上所述的抗体的方法，包括：

[0064] 在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及

[0065] 从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体。

[0066] 本发明还提供固相载体，其表面包被有如上所述的抗体，且同时具有a和b。

[0067] 示例性固体支持物包括，但不限于，柱基质材料、培养板、管(EP管)、皿、烧瓶、微量滴定板、多孔板、微量反应板凹孔、微球、热杀死的福尔马林‑(或其他化学)‑固定的原核或真核细胞、显微镜载片、 薄膜或任何其他光学透明的聚合物，或其组合。所述固体支持物可以全部或部分地由塑料、纤维素、纤维素衍生物、硝化纤维素、玻璃、玻璃纤维、乳胶或其组合构成。

[0068] 术语“固相载体”表示载体材料以非液体坚固性为主，从而允许核酸在载体材料上的精确和可追踪的定位。固相支持物可以选用聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质。固相载体的形式可以是膜、片状物、多孔板，微球等。优选的固相载体为酶标板。其含有的孔位可以为16、32、48、64、96或更多。在本发明中，术语“微球”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。微球优选为磁珠，其成分中含有磁性物质。

[0069] 本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的固相载体。

[0070] 在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含特异性识别SARS‑CoV‑2 N蛋白、且能够与a和b配对使用的第二抗体。

[0071] 配对的抗体意为与同于抗原结合的两个或多个抗体，它们直接所结合的抗原表位不同，且空间上的距离能够保证彼此的空间位阻在可接受范围内，能够特异性识别并结合所述抗原，当配对的抗体之一为多抗时，多抗中的至少部分抗体能够特异性识别并结合所述抗原。

[0072] 在一些实施方式中，所述第二抗体为多克隆抗体。

[0073] 在一些实施方式中，所述第二抗体的种属来源非人，且与a和b的种属来源也不同。

[0074] 在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含特异性识别所述第二抗体Fc段的第三抗体，所述第三抗体缀合有可检测的信号物质。

[0075] 本发明还涉及试剂、试剂盒或试纸条，其包含如上所述的抗体。

[0076] 本发明还涉及一种检测SARS‑CoV‑2病毒的方法，包括：

[0077] 使用如上所述的多肽、试剂盒或试纸条检测SARS‑CoV‑2抗原。

[0078] 在一些实施方式中，所述检测的受试样品选自生物组织或其灌洗液、细胞、体液，进一步选自血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。

[0079] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

[0080] 实施例1免疫原制备

[0081] 将新型冠状病毒N蛋白全长基因序列构建到载体pET28a中，并通过BL21(DE3)重组表达后，利用亲和层析和离子交换层析法制备，获得免疫原。

[0082] 氨基酸序列组成如下：

[0083] (1)新型冠状病毒N蛋白全长

[0084] MSDNGPQNQR NAPRITFGGP SDSTGSNQNG ERSGARSKQR RPQGLPNNTA SWFTALTQHG KEDLKFPRGQ GVPINTNSSP DDQIGYYRRA TRRIRGGDGK MKDLSPRWYF YYLGTGPEAG LPYGANKDGI IWVATEGALN TPKDHIGTRN PANNAAIVLQ LPQGTTLPKG FYAEGSRGGS QASSRSSSRS RNSSRNSTPG SSRGTSPARM AGNGGDAALA LLLLDRLNQL ESKMSGKGQQ QQGQTVTKKS AAEASKKPRQ KRTATKAYNV TQAFGRRGPE QTQGNFGDQE LIRQGTDYKH WPQIAQFAPS ASAFFGMSRI GMEVTPSGTW LTYTGAIKLD DKDPNFKDQV ILLNKHIDAY KTFPPTEPKK DKKKKADETQ ALPQRQKKQQ TVTLLPAADL DDFSKQLQQS MSSADSTQA

[0085] 上述抗原的SDS‑PAGE结果图如图1所示。

[0086] 实施例2抗新型冠状病毒N蛋白的鼠单克隆抗体筛选

[0087] 使用制备的新型冠状病毒N蛋白全长免疫适龄BalB/C小鼠，使用各免疫原通过4
ELISA检测小鼠尾血，直至效价达到10时停止免疫，取出小鼠脾脏，处理后与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，并进而通过有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的鼠单克隆抗体与新冠N蛋白进行活性验证，一方面验证单一抗原与N蛋白的反应灵敏度，另一方面验证两个抗体配对后与N蛋白的灵敏度。

[0088] 表1单克隆抗体细胞上清活性检测结果

[0089]

[0090] 表2单克隆抗体配对检测(双抗夹心法)

[0091]

[0092] 抗体配对1：抗体1(捕获抗体)+抗体2‑HRP；抗体配对2：抗体1(捕获抗体)+抗体3‑HRP；抗体配对3：抗体2(捕获抗体)+抗体1‑HRP；抗体配对4：抗体2(捕获抗体)+抗体3‑HRP；抗体配对5：抗体3(捕获抗体)+抗体1‑HRP；抗体配对6：抗体3(捕获抗体)+抗体2‑HRP。

[0093] 上述抗体的SDS‑PAGE结果图如图2所示。

[0094] 实施例3抗新型冠状病毒N蛋白的IgM及IgG亚型嵌合抗体获得

[0095] 扩增相应的阳性杂交瘤细胞株，提取其mRNA后利用RT‑PCR的方法扩增其可变区的基因序列，Sanger法测序确认后，将其分别构建至IgG嵌合抗体重链及轻链表达载体pFUSE‑CHIg‑mG1及pFUSE2‑CLIg‑mk上(载体图谱分别如图3和图4所示)，另分别构建到IgM嵌合抗体重链及轻链表达载体pFUSE‑CHIgM及pFUSE2‑CLIg‑mk上(载体图谱分别如图5和图4所示)。提取去内毒素质粒，轻链、重链按照适当的比例瞬时转染293细胞，约48h后收集培养细胞上清，分别经Protein A(IgG)和Protein L(IgM)亲和层析和离子交换层析纯化，获得嵌合抗体，标记为N‑Ab‑G1(具有IgG1恒定区的a抗体)，N‑Ab‑G2(具有IgG1恒定区的b抗体)及N‑Ab‑M1(具有IgM恒定区的a抗体)、N‑Ab‑M2(具有IgM恒定区的b抗体)。制备的IgG1嵌合抗体SDS‑PAGE电泳图如图6所示，IgM嵌合抗体SDS‑PAGE电泳图如图7所示。

[0096] 实施例4抗新型冠状病毒N蛋白的嵌合抗体活性验证

[0097] 将N‑Ab‑G1，N‑Ab‑G2及N‑Ab‑M1、N‑Ab‑M2按照适当的浓度包被至酶标板上，BSA封闭后，与不同浓度的N蛋白反应后，加入合适浓度的HRP标记的兔多克隆抗体，使用TMB进行显色。

[0098]

[0099] 将N‑Ab‑G1，N‑Ab‑G2及N‑Ab‑M1、N‑Ab‑M2两两1:1组合，均按照2ug/ml的浓度包被至酶标板上，BSA封闭后，与不同浓度的N抗原反应后，加入合适浓度的HRP标记的兔多克隆抗体，使用TMB进行显色。

[0100]

[0101]

[0102] 组合1：N‑Ab‑G1&N‑Ab‑G2；

[0103] 组合2：N‑Ab‑G1&N‑Ab‑M1；

[0104] 组合3：N‑Ab‑G1&N‑Ab‑M2；

[0105] 组合4：N‑Ab‑G2&N‑Ab‑M1；

[0106] 组合5：N‑Ab‑G2&N‑Ab‑M2；

[0107] 组合6：N‑Ab‑M1&N‑Ab‑M2。

[0108] 从上面的数据可知，组合2～6的亲和力均显著优于组合1，其中组合4的亲和力最高，组合6均为IgM，虽然抗体价态更高，但可能由于较大的空间位阻缘故，其亲和力差于组合4。

[0109] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0110] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。