mRNA或mRNA组合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110526165.2
文献号 : CN113684219B
文献日 : 2022-12-23
发明人 : 朱涛 , 王浩猛 , 李荩 , 晏巧玲 , 莘春林 , 邵忠琦 , 李军强 , 宇学峰 , 巢守柏
申请人 : 康希诺(上海)生物科技有限公司
摘要 :
本发明提供了mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗。所述的mRNA或mRNA组合物包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列。本发明还提供了mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病的药物(尤其是疫苗)中的应用。
权利要求 :
1.mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体以及编码S蛋白中的RBD或其变体；
所述的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2的14‑1273位或SEQ ID NO：15的
14‑1270位所示；
所述的RBD或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的19‑241位所示。
2.mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物编码信号肽和新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体，以及，编码S蛋白中的RBD或其变体；
所述的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2的14‑1273位或SEQ ID NO：15的
14‑1270位所示；
所述的RBD或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的19‑241位所示；
所述的信号肽包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽为组织型纤溶酶原激活剂的信号肽或血清免疫球蛋白E的信号肽。
3.mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体，以及，编码信号肽和S蛋白中的RBD或其变体；
所述的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2的14‑1273位或SEQ ID NO：15的
14‑1270位所示；
所述的RBD或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的19‑241位所示；
所述的信号肽包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽为组织型纤溶酶原激活剂的信号肽或血清免疫球蛋白E的信号肽。
4.mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物编码第一信号肽和新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体，以及，编码第二信号肽和S蛋白中的RBD或其变体；
所述的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2的14‑1273位或SEQ ID NO：15的
14‑1270位所示；
所述的RBD或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的19‑241位所示；
所述的第一信号肽包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽为组织型纤溶酶原激活剂的信号肽或血清免疫球蛋白E的信号肽；
所述的第二信号肽包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽为组织型纤溶酶原激活剂的信号肽或血清免疫球蛋白E的信号肽。
5.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列为分别的两条mRNA序列或连接为一条mRNA序列。
6.根据权利要求5所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，连接为一条mRNA序列从5’至
3’的连接顺序为：先编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列、后编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，或者为先编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列、后编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列。
7.根据权利要求6所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列之间通过内部核糖体进入位点连接；其中，所述的内部核糖体进入位点选自小RNA病毒、瘟病毒、丙肝病毒或猿免疫缺陷病毒。
8.根据权利要求7所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的小RNA病毒包含脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒或蟋蟀麻痹病毒。
9.根据权利要求7所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的瘟病毒包含古典猪瘟病毒。
10.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’帽子结构、5’非编码区和多聚腺苷酸尾。
11.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’保守序列元素、RNA复制酶编码区、亚基因组启动子、3’保守序列元素或3’非编码区中的一种或两种以上的组合。
12.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA为传统mRNA、自主扩增型mRNA或反式扩增型mRNA。
13.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物包括编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列连接构成的一条mRNA序列，其选自下列任一组:A）由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
B）由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
C）由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，内部核糖体进入位点（IRES），编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
D）由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
E）由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，
3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
F）由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
G）由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；或，H）由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。
14.根据权利要求1‑4任一所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的mRNA或mRNA组合物包括两条mRNA序列的组合，其选自下列任一组：a）由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
b）由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
c）由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
d）由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
e）由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；或，f）由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA。
15.根据权利要求13所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的RNA复制酶编码区选自甲病毒、小RNA病毒、黄病毒、副粘病毒或杯状病毒。
16.根据权利要求14所述的mRNA或mRNA组合物，其特征在于，所述的RNA复制酶编码区选自甲病毒、小RNA病毒、黄病毒、副粘病毒或杯状病毒。
17.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗包括权利要求1‑16任一所述的mRNA或mRNA组合物。
18.根据权利要求17所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗中编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA的质量比为（1‑5）：（1‑5）。
19.根据权利要求17所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗还包括阳离子化合物。
20.根据权利要求19所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的阳离子化合物包括聚阳离子化合物。
21.根据权利要求17所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗还包含脂质。
22.根据权利要求17所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗包含脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。
23.一种mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求1‑16任一所述的mRNA或mRNA组合物与阳离子化合物混合后用脂质包装。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述的阳离子化合物包括聚阳离子化合物。
25.一种权利要求1‑16任一所述的mRNA或mRNA组合物或权利要求17‑22任一所述的mRNA疫苗的应用，其特征在于，所述的应用包括在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病的药物中的应用。
26.一种权利要求1‑16任一所述的mRNA或mRNA组合物或权利要求17‑22任一所述的mRNA疫苗的应用，其特征在于，所述的应用包括在制备抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的药物中的应用。
27.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病为COVID‑19。
说明书 :
mRNA或mRNA组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的刺突蛋白(S蛋白)或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的受体结合域(RBD)或其变体的mRNA
序列。本发明涉及包含一种或两种mRNA的组合物。以及所述mRNA或组合物在制备预防和/或
治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的药物(尤其是疫苗)中的应用。
序列。本发明涉及包含一种或两种mRNA的组合物。以及所述mRNA或组合物在制备预防和/或
治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的药物(尤其是疫苗)中的应用。
背景技术
[0002] 冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒(Nidovirales)冠状病毒(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状
病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。迄今为止，共有7种冠状病毒可感染人类：包括α属的
229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr‑CoV)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr‑CoV)和新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)。其中只有后三种会导致
严重的人类疾病甚至死亡。
病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。迄今为止，共有7种冠状病毒可感染人类：包括α属的
229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr‑CoV)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr‑CoV)和新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)。其中只有后三种会导致
严重的人类疾病甚至死亡。
[0003] 冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径通常为50～200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。
N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARS‑CoV和
MERS‑CoV的研究。基于SARS‑CoV的全长S蛋白设计的疫苗被报道会诱导大量非中和抗体，在动物模型上攻毒失败且引起严重的副反应，比如增加发病率，引起肝部组织强烈炎症反应
及肝损伤(参见文献：“Evaluation of modified vaccinia virus ankara based
recombinant SARS vaccine in ferrets”，Vaccine 23，2273‑2279.)。因此，在疫苗设计中避免暴露能具有免疫优势的非中和表位是保障疫苗安全性的基础。
N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARS‑CoV和
MERS‑CoV的研究。基于SARS‑CoV的全长S蛋白设计的疫苗被报道会诱导大量非中和抗体，在动物模型上攻毒失败且引起严重的副反应，比如增加发病率，引起肝部组织强烈炎症反应
及肝损伤(参见文献：“Evaluation of modified vaccinia virus ankara based
recombinant SARS vaccine in ferrets”，Vaccine 23，2273‑2279.)。因此，在疫苗设计中避免暴露能具有免疫优势的非中和表位是保障疫苗安全性的基础。
[0004] SARS‑CoV和MERS‑CoV的RBD都由两部分组成：一个高度相似的核心结构和一段差异极大的受体结合基序(RBM)。RBM的不同使得SARS‑CoV和MERS‑CoV分别识别不同的受体：
SARS‑CoV识别血管紧张素转化酶2(ACE2)，而MERS‑CoV识别二肽基肽酶4(DPP4)。
SARS‑CoV识别血管紧张素转化酶2(ACE2)，而MERS‑CoV识别二肽基肽酶4(DPP4)。
[0005] 目前SARS‑CoV和MERS‑CoV疫苗研发所涉及到的疫苗平台有：病毒载体疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、类病毒颗粒(VLP)疫苗、全病毒灭活疫苗和减毒疫苗。
[0006] 近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋
白，从而使机体获得免疫保护。与传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗相比，mRNA疫
苗制备步骤简单，对于传染性疾病的控制有着重大意义。此外，mRNA疫苗比传统重组疫苗更
耐高温也更加稳定。同时，mRNA疫苗能够引起强烈的CD4+或CD8+的T细胞应答，与DNA免疫接
种不同，在动物体内mRNA疫苗通过一两次低剂量接种就能够产生抗体。
白，从而使机体获得免疫保护。与传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗相比，mRNA疫
苗制备步骤简单，对于传染性疾病的控制有着重大意义。此外，mRNA疫苗比传统重组疫苗更
耐高温也更加稳定。同时，mRNA疫苗能够引起强烈的CD4+或CD8+的T细胞应答，与DNA免疫接
种不同，在动物体内mRNA疫苗通过一两次低剂量接种就能够产生抗体。
[0007] 因此，本发明提供了一种安全可靠的mRNA疫苗，避免了其他疫苗平台的缺陷。
发明内容
[0008] 本发明的第一方面，提供了mRNA或mRNA组合物，所述的mRNA或mRNA组合物包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白(刺突蛋白)或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的
RBD(受体结合域)或其变体的mRNA序列。
RBD(受体结合域)或其变体的mRNA序列。
[0009] 其中，所述的编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列来源于相同的SARS‑CoV‑2突变株或不同的SARS‑CoV‑2突变株。
[0010] 优选的，所述的S蛋白或其变体包含野生型全长S蛋白或固定在融合前构象的全长S蛋白。
[0011] 进一步优选的，为稳定构象，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白包含682RRAR685位突变和/或将986KV987位突变，以使S蛋白固定到融合前构象。最为优选的，所
述的固定在融合前构象的全长S蛋白为将野生型全长S蛋白的682RRAR685突变为GSAG和/或
将986KV987突变为PP。
述的固定在融合前构象的全长S蛋白为将野生型全长S蛋白的682RRAR685突变为GSAG和/或
将986KV987突变为PP。
[0012] 同时，现有专利中公开的部分内容也支持了本发明的技术方案，例如在接近第一段七肽重复区域或在第一段七肽重复区域中将一个或两个氨基酸替换为脯氨酸可极有效
率地稳定构象(见美国专利，申请号20200061185，PREFUSION CORONAVIRUS SPIKE
PROTEINS and THEIR USE)。
率地稳定构象(见美国专利，申请号20200061185，PREFUSION CORONAVIRUS SPIKE
PROTEINS and THEIR USE)。
[0013] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的野生型全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
[0014] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：2或15具有70％、75％、80％、85％、
90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
[0015] 优选的，所述的S蛋白或其变体不包含信号肽、包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽优选为组织型纤溶酶原激
活剂(tPA)的信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
活剂(tPA)的信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，编码不含信号肽的野生型2019‑nCoV S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0017] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、或与SEQ ID NO：3或13具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
[0018] 优选的，所述的RBD或其变体不包含信号肽、包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽优选为组织型纤溶酶原激活
剂(tPA)的信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
剂(tPA)的信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
[0019] 在本发明的一个具体实施方式中，编码含IgE信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的核苷酸序列如SEQ ID NO：7、9‑11任一所示。
[0020] 优选的，所述的mRNA为单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。所述的双顺反子或多顺反子mRNA即含有两个及以上编码区的mRNA。
[0021] 优选的，所述的编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列为分别的两条mRNA序列或连接为一条mRNA序列。
[0022] 进一步优选的，连接为一条mRNA序列从5’至3’的连接顺序为：先编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列、后编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，或者为先编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列、后编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白
或其变体的mRNA序列。再进一步优选的，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列之间通过内部核糖体进入位点(IRES)
连接。
或其变体的mRNA序列。再进一步优选的，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列之间通过内部核糖体进入位点(IRES)
连接。
[0023] 其中，所述的IRES可以用于分隔两个编码区。
[0024] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的IRES序列包括但不限于小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(例如CFFV)、脊髓灰质炎病毒(例如PV)、脑心肌炎病毒(例如ECMV)、口蹄疫病毒(例如FMDV)、丙肝病毒(例如HCV)、古典猪瘟病毒(例如CSFV)、小鼠角膜白斑病毒(例如
MLV)、猿免疫缺陷病毒(例如SIV)或蟋蟀麻痹病毒(例如CrPV)。
MLV)、猿免疫缺陷病毒(例如SIV)或蟋蟀麻痹病毒(例如CrPV)。
[0025] 优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’帽子结构、5’非编码区和多聚腺苷酸尾。
[0026] 进一步优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’保守序列元素、RNA复制酶编码区、亚基因组启动子、3’保守序列元素或3’非编码区中的一种或两种以上的组合。
[0027] 优选的，所述的mRNA为传统mRNA、自主扩增型mRNA或反式扩增型mRNA。
[0028] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为传统mRNA，即所述的mRNA除包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变
体的mRNA序列外，还包含5’帽子结构，5’非编码区，3’非编码区和/或多聚腺苷酸尾的mRNA序列。
体的mRNA序列外，还包含5’帽子结构，5’非编码区，3’非编码区和/或多聚腺苷酸尾的mRNA序列。
[0029] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为自主扩增型mRNA，即所述的mRNA除包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD
或其变体的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。其中，可使用的RNA复制酶编码区包括但不
限于甲病毒(例如SFV)、小RNA病毒(例如FMDV)、黄病毒(例如DENV)、副粘病毒(例如HMPV)或
杯状病毒(例如NV)。
或其变体的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。其中，可使用的RNA复制酶编码区包括但不
限于甲病毒(例如SFV)、小RNA病毒(例如FMDV)、黄病毒(例如DENV)、副粘病毒(例如HMPV)或
杯状病毒(例如NV)。
[0030] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为反式扩增型mRNA，即所述的编码目的基因的mRNA除包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编
码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；RNA复制酶由单独的传统mRNA编码。
码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；RNA复制酶由单独的传统mRNA编码。
[0031] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物包括编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列连接
构成的一条mRNA序列，其选自下列任一组:
构成的一条mRNA序列，其选自下列任一组:
[0032] A)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
[0033] B)由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
[0034] C)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，内部核糖体进入位点(IRES)，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
[0035] D)由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
[0036] E)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
[0037] F)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
[0038] G)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；或
[0039] H)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。
[0040] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物包括两条mRNA序列的组合，其选自下列任一组：
[0041] a)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
[0042] b)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
[0043] c)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，
3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
[0044] d)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
[0045] e)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列
元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；或
元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；或
[0046] f)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA。
[0047] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物中包含的mRNA序列包含SEQ ID NO：16‑19中的任一个或两个以上的组合。
[0048] 优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包括阳离子或聚阳离子化合物。
[0049] 优选的，所述的阳离子或聚阳离子化合物游离或者与mRNA结合。
[0050] 在本发明的一个具体实施方式中，为了使得所述mRNA或mRNA组合物更稳定选择阳离子或聚阳离子化合物与所述mRNA结合的形式。
[0051] 优选的，所述的mRNA或mRNA组合物中还包含脂质。
[0052] 进一步优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的
脂质体或用作稳定剂的脂质体。
脂质体或用作稳定剂的脂质体。
[0053] 更优选的，为了增加LNP(脂质纳米颗粒)的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
[0054] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
[0055] 本发明所述的mRNA或mRNA组合物可以为脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。所述的脂质体可以为以下形式制备得到的脂质体：1，2‑二油烯基氧基‑N，N‑二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、1，2‑二亚油基氧基‑3‑二甲基氨基丙烷(DLin‑DMA)、2，2‑二亚油基‑4‑(2‑二甲基氨基乙基)‑[1，3]‑二氧杂环戊烷(DLin‑KC2‑DMA)脂质体。所述脂质复合物或脂质纳米粒子可以由选自以下的脂质形成：DLin‑DMA、DLin‑K‑DMA、98N12‑5、C12‑200、DLin‑MC3‑DMA、DLin‑KC2‑DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG‑DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。
[0056] 本发明所述的mRNA或mRNA组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑
剂、助悬剂、转染促进剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、
费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐
剂的核苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
剂、助悬剂、转染促进剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、
费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐
剂的核苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
[0057] 本发明的第二方面，提供了一种mRNA疫苗，所述的mRNA疫苗包括本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物。
[0058] 优选的，所述的mRNA疫苗中编码的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体与编码S蛋白中的RBD或其变体的序列分别来自于不同SARS‑CoV‑2突变株，从而免疫产生对不
同SARS‑CoV‑2突变株的交叉保护。在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗中编
码含IgE信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD中含有501Y.V2谱系的K417N、E484K和N501Y突
变，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变
为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的序列来自Wuhan‑Hu‑1isolate，其中含有501Y.V2
谱系的L18F、D80A、D215G、L242‑L244删除突变(L242‑244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，优选其氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示。
同SARS‑CoV‑2突变株的交叉保护。在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗中编
码含IgE信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD中含有501Y.V2谱系的K417N、E484K和N501Y突
变，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变
为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的序列来自Wuhan‑Hu‑1isolate，其中含有501Y.V2
谱系的L18F、D80A、D215G、L242‑L244删除突变(L242‑244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，优选其氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示。
[0059] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其中，新
型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，S蛋白中的
RBD或其变体如SEQ ID NO：13所示。
型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，S蛋白中的
RBD或其变体如SEQ ID NO：13所示。
[0060] 在本发明的另一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其
中，新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体如SEQ ID NO：13所示。
中，新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体如SEQ ID NO：13所示。
[0061] 在本发明的另一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其
中，新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体如SEQ ID NO：3所示。优选的，所述的mRNA疫苗中编码新型冠状病毒SARS‑
CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA的质量比为(1‑5)：(1‑
5)。
中，新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体如SEQ ID NO：3所示。优选的，所述的mRNA疫苗中编码新型冠状病毒SARS‑
CoV‑2的S蛋白或其变体的mRNA与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA的质量比为(1‑5)：(1‑
5)。
[0062] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗中编码含IgE信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合
前构象的全长S蛋白的mRNA的质量比为(1‑2)：(1‑2)。
前构象的全长S蛋白的mRNA的质量比为(1‑2)：(1‑2)。
[0063] 优选的，所述的mRNA疫苗还包括阳离子或聚阳离子化合物。
[0064] 优选的，所述的阳离子或聚阳离子化合物游离或者与mRNA结合。
[0065] 在本发明的一个具体实施方式中，为了使得所述mRNA疫苗更稳定选择阳离子或聚阳离子化合物与所述mRNA结合的形式。
[0066] 优选的，所述的mRNA疫苗中还包含脂质。
[0067] 进一步优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的
脂质体或用作稳定剂的脂质体。
脂质体或用作稳定剂的脂质体。
[0068] 更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
[0069] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
[0070] 本发明所述的mRNA疫苗可以为脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。所述的脂质体可以为以下形式制备得到的脂质体：1，2‑二油烯基氧基‑N，N‑二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、1，2‑二亚油基氧基‑3‑二甲基氨基丙烷(DLin‑DMA)、2，2‑二亚油基‑4‑(2‑二甲基氨基乙基)‑[1，3]‑二氧杂环戊烷(DLin‑KC2‑DMA)脂质体。所述脂质复合物或脂质纳米粒子可以由选自以下的脂质形成：DLin‑DMA、DLin‑K‑DMA、98N12‑5、C12‑200、DLin‑MC3‑DMA、DLin‑KC2‑DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG‑DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。
[0071] 本发明所述的mRNA疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、费氏
(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的
核苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的
核苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
[0072] 本发明的第三方面，提供了一种mRNA或mRNA组合物的制备方法，包括将mRNA与阳离子或聚阳离子化合物混合后用脂质包装。
[0073] 优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂
质体或用作稳定剂的脂质体。更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG
化脂质。
质体或用作稳定剂的脂质体。更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG
化脂质。
[0074] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
[0075] 本发明的第四方面，提供了一种mRNA疫苗的制备方法，所述的制备方法包括将本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物与阳离子或聚阳离子化合物混合后用脂质包装。优选
的，包装成脂质纳米颗粒。
的，包装成脂质纳米颗粒。
[0076] 优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂
质体或用作稳定剂的脂质体。更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG
化脂质。
质体或用作稳定剂的脂质体。更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG
化脂质。
[0077] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
[0078] 本发明的第五方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在预防和/或治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病的应用。
[0079] 优选的，所述的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病包括但不限于COVID‑19。
[0080] 本发明的第六方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染中的应用。
[0081] 本发明的第七方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病的药物中的应用。
[0082] 优选的，所述的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病包括但不限于COVID‑19。
[0083] 本发明的第八方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在制备抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的药物中的应用。
[0084] 本发明的第九方面，提供了一种治疗和/或预防新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染导致的疾病的方法，包括向个体施加有效量的本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者
mRNA疫苗。
mRNA疫苗。
[0085] 本发明的第十方面，提供了一种预防新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的方法，包括向未感染新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的个体施加有效量的本发明所述的mRNA疫苗。
[0086] 本发明的第十一方面，提供了一种治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的方法，包括向感染新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的个体施加有效量的本发明所述的mRNA或包含mRNA的
组合物或mRNA疫苗，以使得个体体内产生中和抗体抵制新型冠状病毒SARS‑CoV‑2。
组合物或mRNA疫苗，以使得个体体内产生中和抗体抵制新型冠状病毒SARS‑CoV‑2。
[0087] 本发明的第十二方面，提供了一种抗体筛选的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者mRNA疫苗的步骤。
[0088] 其中，所述的抗体筛选的方法不是治疗方法。该方法用来筛选中和抗体，对抗体的药效进行检测和比较，以确定哪些抗体可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同
药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
[0089] 本发明的第十三方面，提供了一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，所述的方法包括向个体施加本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者mRNA疫苗。
[0090] 优选的，所述的抗原特异性免疫应答包括T细胞应答和/或B细胞应答。
[0091] 本发明的第十四方面，提供了本发明所述的mRNA或mRNA组合物编码的蛋白。
[0092] 优选的，所述的蛋白为固定在融合前构象的全长S蛋白。进一步优选的，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白包含682RRAR685位突变和/或将986KV987位突变，以使S蛋白
固定到融合前构象。最为优选的，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白为将野生型全长S
蛋白的682RRAR685突变为GSAG和/或将986KV987突变为PP。
固定到融合前构象。最为优选的，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白为将野生型全长S
蛋白的682RRAR685突变为GSAG和/或将986KV987突变为PP。
[0093] 本发明的第十五方面，提供了一种编码本发明所述蛋白的核苷酸序列。
[0094] 本发明的第十六方面，提供了一种包含本发明所述核苷酸序列的载体。
[0095] 本发明的第十七方面，提供了一种包含本发明所述的蛋白、所述的核苷酸序列和/或所述的载体的细胞。
[0096] 本发明所述的mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗具备的优势在于：1、体外合成，无需细胞培养，无动物源污染的风险；2、研发、生产较快，标准化生产，易于量产和质量控制，同一生产流程适用于多个不同产品；3、可以在一段时间内持续表达，延长抗原暴露时间从而提高免疫反应的强度和质量；4、模拟天然感染的过程，在人体细胞内被翻译、修饰，可以被MHC I类分子呈递，诱发更强的细胞免疫；5、支持多种蛋白形式，包括胞内蛋白、跨膜蛋白、VLP等，且可避开VLP产量低而造成的纯化问题；6、具有自佐剂效应，无需进行佐剂筛选；7、无感染、基因组整合风险；8、无预存免疫，可多次免疫。
[0097] 本发明所述的mRNA或mRNA组合物的表达产物包含RBD或其变体以及S蛋白或其变体，其中，RBD中包含了主要的中和表位，可以诱发高水平的中和抗体滴度；而且，非中和表位相对较少，安全性高。全长S蛋白可诱导出高水平的特异性细胞免疫，配合针对性诱导中
和抗体的RBD，可以产生极为优异的免疫效果。进一步的，实施例也证实了本发明所述的
mRNA或mRNA组合物的表达产物能够在人体中诱发高水平中和抗体和细胞因子的产生。
和抗体的RBD，可以产生极为优异的免疫效果。进一步的，实施例也证实了本发明所述的
mRNA或mRNA组合物的表达产物能够在人体中诱发高水平中和抗体和细胞因子的产生。
[0098] 同时，现有技术中公开的部分内容也支持了本发明的技术方案，例如通过对SARS‑CoV‑2的RBD的序列分析，以及对其结构的模拟预测，认为SARS‑CoV‑2的S蛋白维持了SARS‑CoV的S蛋白和ACE2相互作用的结构构象。通过比对MERS‑CoV的RBD的不同片段，确定蛋白片
段377‑588为关键中和域，即可以在小鼠和兔子模型中引起最高的中和抗体滴度；而且此关
键中和域仍可以和受体hDPP4结合，证明其保持了结构构象，不止可以提供线性表位，也可
以提供结构表位(见Cuiqing,M等(2014)，Searching for an ideal vaccine candidate
among different MERS coronavirus receptor‑binding fragments‑‑the importance
of immunofocusing in subunit vaccine design，Vaccine.32(46):6170‑6176.)。
段377‑588为关键中和域，即可以在小鼠和兔子模型中引起最高的中和抗体滴度；而且此关
键中和域仍可以和受体hDPP4结合，证明其保持了结构构象，不止可以提供线性表位，也可
以提供结构表位(见Cuiqing,M等(2014)，Searching for an ideal vaccine candidate
among different MERS coronavirus receptor‑binding fragments‑‑the importance
of immunofocusing in subunit vaccine design，Vaccine.32(46):6170‑6176.)。
[0099] 本发明所述的“个体”包括哺乳动物和人。所述的哺乳动物包括但不限于啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)、猴子、斑马鱼、猪、鸡、兔子等等。
[0100] 本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为；优选的，所述的预防包括将本发明所述的
mRNA或包含mRNA的组合物用作疫苗。
mRNA或包含mRNA的组合物用作疫苗。
[0101] 本发明所述的“治疗”指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预；优选的，所述的治疗包括筛选与本发明所述的mRNA或包含mRNA的组合物结
合的抗体，并将其用于治疗。
合的抗体，并将其用于治疗。
[0102] 本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明所述产品的量或剂量。
[0103] 本发明所述的“S蛋白”为组成新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的结构蛋白，名称为刺突蛋白。
[0104] 本发明所述的“RBD”为组成新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的结构蛋白，名称为刺突蛋白受体结合域。
[0105] 本发明所述的“同一性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具
有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，
15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，
30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，
45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，
60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，
99.7％，99.8％，99.9％的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同或类似的
功能，例如与原序列具有同一性的氨基酸序列依然具有在体内诱发中和抗体和产生细胞因
子的功能，与原序列具有同一性的mRNA序列表达产物依然具有在体内诱发中和抗体和产生
细胞因子的功能。
有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，
15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，
30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，
45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，
60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，
99.7％，99.8％，99.9％的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同或类似的
功能，例如与原序列具有同一性的氨基酸序列依然具有在体内诱发中和抗体和产生细胞因
子的功能，与原序列具有同一性的mRNA序列表达产物依然具有在体内诱发中和抗体和产生
细胞因子的功能。
附图说明
[0106] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0107] 图1：编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的序列测序结果。
[0108] 图2：图2A和图2B的拼接为编码野生型SARS‑CoV‑2的S蛋白的序列测序结果。
[0109] 图3：含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板序列图。
[0110] 图4：用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，其中，M为Marker，1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP
的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。
的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。
[0111] 图5：WB(Western Blot，蛋白质印迹法)检测结果，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA的表达上清，2为阴性对照。
[0112] 图6：免疫荧光结果。
[0113] 图7：DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)检测mRNA‑LNP的粒径和粒径分布结果，其中，A代表RBD+S‑1‑LNP，B代表RBD+S‑2‑LNP，C代表RBD+S‑3‑LNP，D代表RBD‑LNP，E代表S‑LNP。
[0114] 图8：甲醛变性胶检测包装后样品的mRNA完整性结果，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA，2为RBD+S‑1，3为RBD+S‑2，4为RBD+S‑3，5为编码
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。
[0115] 图9：一免、二免后的S蛋白特异性抗体滴度，其中，Negative为阴性对照。
[0116] 图10：用ELISpot(酶联免疫斑点法)检测干扰素γ(IFN‑γ)的结果，其中，纵坐标为每百万脾细胞的点形成单位(spot forming unit，SFU)，Negative为阴性对照。
[0117] 图11：CD4 CK胞内染色法(ICS)检测IFN‑γ、白细胞介素‑2(IL‑2)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的结果。
[0118] 图12：CD8 CK胞内染色法(ICS)检测IFN‑γ、白细胞介素‑2(IL‑2)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的结果。
[0119] 图13：用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，其中，M为Marker，1为实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的
mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2
谱系的全长S蛋白的mRNA，3为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD
序列的mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2
谱系的全长S蛋白的mRNA，3为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD
序列的mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
[0120] 图14：WB检测结果，其中1为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的表达上清，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定
在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照的细胞上清，4
为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的表达细胞沉
淀，5为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱
系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞沉淀，6为阴性对照的细胞沉淀。
在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照的细胞上清，4
为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的表达细胞沉
淀，5为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱
系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞沉淀，6为阴性对照的细胞沉淀。
[0121] 图15：DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)检测mRNA‑LNP的粒径和粒径分布结果。
[0122] 图16：一免、二免后针对501Y.V2谱系的S蛋白特异性抗体滴度。
[0123] 图17：一免、二免后针对Wuhan‑Hu‑1isolate的S蛋白特异性抗体滴度。
[0124] 图18：替代性中和抗体滴度结果，左边4组为针对Wuhan‑Hu‑1isolate的替代性中和抗体滴度，右边4组为针对501Y.V2谱系的替代性中和抗体滴度。
[0125] 图19：CD4+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果。
[0126] 图20：CD8+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果。
具体实施方式
[0127] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的
实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。
实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。
[0128] 实施例中使用的试剂来源：
[0129] 替代性中和抗体检测是检测的疫苗免疫小鼠血清中的中和抗体，利用的是ACE2蛋白和RBD蛋白的竞争结合。
[0130] 特异性抗体体检测是检测的疫苗免疫小鼠血清中的特异性抗体，利用的是RBD蛋白。
[0131] 检测针对Wuhan‑Hu‑1isolate用到的RBD蛋白为野生型RBD蛋白(厂家：金斯瑞，货号：Z03483‑1)。
[0132] 检测针对501Y.V2谱系用到的RBD蛋白为含501Y.V2谱系突变的RBD蛋白(厂家：近岸，货号：DRA125)。
[0133] 实施例1：mRNA的制备与检测
[0134] 1、分别人工合成抗原设计的基因序列。
[0135] 2、通过固相亚磷酰胺三酯法合成短核苷酸链(引物)。
[0136] 3、引物互为模板进行PCR扩增。
[0137] 4、将步骤3扩增的产物连接到pUC57载体上，转化测序。
[0138] 5、经测序验证，序列与预期一致，结果见图1‑2所示。具体的，图1显示了编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。图2显示编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基
酸序列如SEQ ID NO：2所示。
酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0139] 6、准备含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板，序列如图3(SEQ ID NO：8)所示。
[0140] 7、用含有与基础质粒模板同源的引物进行PCR，结果显示正确。
[0141] 基础质粒模板用限制性核酸内切酶BsmBI线性化。将PCR产物分别通过同源重组的方式分别连到基础质粒模板上，分别转化到Xl1‑Blue菌株中，并进行测序确认序列正确，转录模板构建成功。用摇瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。
[0142] 将转录模板用限制性核酸内切酶BbsI线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，分别获得SEQ IDNO：4‑5的未加帽的mRNA(mRNA具体序列分别为SEQ ID NO：16‑17)。分别用
DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA
纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待
用。
DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA
纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待
用。
[0143] 用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，如图4所示，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定
在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
[0144] 用24孔板铺3个孔的HEK293细胞，其中1、2号孔分别用lipofectamine 2000转染0.5μg加帽纯化后的编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA，和编码
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，3号
孔作为阴性对照加入lipofectamine2000转染试剂。转染24h后，取1、3号孔的细胞上清进行
WB检测，2、3号孔的细胞固定后用抗S蛋白多抗进行免疫荧光检测。WB检测结果如图5所示，
其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA的表达上清，2为阴性对照。结
果显示表达出来的蛋白大小正确。免疫荧光结果如图6所示，证明编码682RRAR685突变为
GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA可以正常表达。
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，3号
孔作为阴性对照加入lipofectamine2000转染试剂。转染24h后，取1、3号孔的细胞上清进行
WB检测，2、3号孔的细胞固定后用抗S蛋白多抗进行免疫荧光检测。WB检测结果如图5所示，
其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA的表达上清，2为阴性对照。结
果显示表达出来的蛋白大小正确。免疫荧光结果如图6所示，证明编码682RRAR685突变为
GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA可以正常表达。
[0145] 实施例2：mRNA疫苗的制备与免疫
[0146] 1、原料准备
[0147] 1)将阳离子脂质D‑Lin‑MC3‑DMA、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇、PEG化脂质PEG‑DMG四个组分按摩尔比50:10:38.5:1.5在乙醇中溶解、混合。
[0148] 2)实施例1制备的编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，将
这两种mRNA分别按质量比1:1、2:1、1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为RBD+S‑1、RBD+S‑2和RBD+S‑3。
这两种mRNA分别按质量比1:1、2:1、1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为RBD+S‑1、RBD+S‑2和RBD+S‑3。
[0149] 2、试验步骤
[0150] 以脂质混合物：mRNA流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Ignite中分别混合包装RBD+S‑1、RBD+S‑2、RBD+S‑3、编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全
长S蛋白的mRNA。将包装好的mRNA‑LNP(LNP为脂质纳米颗粒)透析并超滤浓缩到DPBS中，无
菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。用DLS检测mRNA‑LNP的粒径和粒径分布，检测结果
如图7所示，包装后样品的粒径大小均在70nm‑100nm，PDI均小于0.2。其中，RBD+S‑1‑LNP：粒径平均值77.15nm，PDI值0.038，截距(intercept)0.958，具体见表1；RBD+S‑2‑LNP：粒径平均值77.04nm，PDI值0.055，截距(intercept)0.959，具体见表2；RBD+S‑3‑LNP：粒径平均值
91.43nm，PDI值0.049，截距(intercept)0.974，具体见表3；RBD‑LNP：粒径平均值77.92nm，PDI值0.036，截距(intercept)0.954，具体见表4；S‑LNP：粒径平均值76.89nm，PDI值0.031，截距(intercept)0.977，具体见表5。
长S蛋白的mRNA。将包装好的mRNA‑LNP(LNP为脂质纳米颗粒)透析并超滤浓缩到DPBS中，无
菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。用DLS检测mRNA‑LNP的粒径和粒径分布，检测结果
如图7所示，包装后样品的粒径大小均在70nm‑100nm，PDI均小于0.2。其中，RBD+S‑1‑LNP：粒径平均值77.15nm，PDI值0.038，截距(intercept)0.958，具体见表1；RBD+S‑2‑LNP：粒径平均值77.04nm，PDI值0.055，截距(intercept)0.959，具体见表2；RBD+S‑3‑LNP：粒径平均值
91.43nm，PDI值0.049，截距(intercept)0.974，具体见表3；RBD‑LNP：粒径平均值77.92nm，PDI值0.036，截距(intercept)0.954，具体见表4；S‑LNP：粒径平均值76.89nm，PDI值0.031，截距(intercept)0.977，具体见表5。
[0151] 表1：RBD+S‑1‑LNP
[0152] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 81.06 100 18.64
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 81.06 100 18.64
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0153] 表2：RBD+S‑2‑LNP
[0154] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 81.93 100 20.68
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 81.93 100 20.68
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0155] 表3：RBD+S‑3‑LNP
[0156] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 97 100 24.54
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 97 100 24.54
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0157] 表4：RBD‑LNP
[0158] 粒径(nm) 强度(％) 标准差峰1 82.01 100 19.41
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0159] 表5：S‑LNP
[0160]
[0161]
[0162] 用甲醛变性胶检测包装后样品的mRNA完整性，结果如图8所示，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS‑CoV‑2的RBD的mRNA，2为RBD+S‑1，3为RBD+S‑2，4为RBD+S‑3，5为编码
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。可
见mRNA基本无降解。
682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。可
见mRNA基本无降解。
[0163] 6周龄左右的BALB/c雌性小鼠随机6只一组，分为6组。分别在第0天和第28天免疫后腿肌肉接种10ug，在第28天和第42天检测S蛋白特异性抗体滴度，在第42天杀鼠检测细胞
因子。
因子。
[0164] 3、实验结果
[0165] 一免、二免后的S蛋白特异性抗体滴度如图9所示，可以看到单S全长免疫二免后的特异性抗体滴度显著低于单RBD免疫，而三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单RBD免疫的
特异性抗体滴度无显著性差异，RBD+S‑1出现了协同增益的效果，特异性抗体滴度显著高于
单RBD免疫。用ELISpot检测干扰素γ(IFN‑γ)的结果如图10所示，可以看到单S全长免疫引
起的IFN‑γ分泌水平显著高于单RBD免疫，而三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单S全长
免疫的IFN‑γ分泌水平无显著性差异，RBD+S‑3出现了协同增益的效果，IFN‑γ分泌水平显著高于单S全长免疫。用CK胞内染色法(ICS)检测IFN‑γ、白细胞介素‑2(IL‑2)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的结果如图11和图12所示。CD4+T细胞的反应较低，个体差异较大，指导意义较小；而CD8+T细胞的检测结果与ELISpot的检测结果基本一致，三组S与RBD的组合免疫，其
中两组与单S全长免疫在IFN‑γ、IL‑2和TNF‑α的分泌水平上无显著性差异，而RBD+S‑3出现了显著性的协同增益的效果。证明S全长和RBD的组合不仅可以结合S全长的细胞免疫优势
和RBD的体液免疫优势，而且可以达到协同增益的效果，可在2019‑nCoV型冠状病毒感染的
预防上取得更为优异的效果。
特异性抗体滴度无显著性差异，RBD+S‑1出现了协同增益的效果，特异性抗体滴度显著高于
单RBD免疫。用ELISpot检测干扰素γ(IFN‑γ)的结果如图10所示，可以看到单S全长免疫引
起的IFN‑γ分泌水平显著高于单RBD免疫，而三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单S全长
免疫的IFN‑γ分泌水平无显著性差异，RBD+S‑3出现了协同增益的效果，IFN‑γ分泌水平显著高于单S全长免疫。用CK胞内染色法(ICS)检测IFN‑γ、白细胞介素‑2(IL‑2)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的结果如图11和图12所示。CD4+T细胞的反应较低，个体差异较大，指导意义较小；而CD8+T细胞的检测结果与ELISpot的检测结果基本一致，三组S与RBD的组合免疫，其
中两组与单S全长免疫在IFN‑γ、IL‑2和TNF‑α的分泌水平上无显著性差异，而RBD+S‑3出现了显著性的协同增益的效果。证明S全长和RBD的组合不仅可以结合S全长的细胞免疫优势
和RBD的体液免疫优势，而且可以达到协同增益的效果，可在2019‑nCoV型冠状病毒感染的
预防上取得更为优异的效果。
[0166] 实施例3：序列来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA的制备与检测
[0167] 1、通过引物互为模板扩增合成编码含IgE信号肽的的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列，其中含有501Y.V2谱系的K417N、E484K和N501Y突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所
示，氨基酸序列如SEQID NO：13所示。
示，氨基酸序列如SEQID NO：13所示。
[0168] 2、通过引物互为模板扩增合成编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的序列，其中含有501Y.V2谱系的L18F、
D80A、D215G、L242‑L244删除突变(L242‑244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
D80A、D215G、L242‑L244删除突变(L242‑244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
[0169] 3、准备含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板，序列如图3(SEQ ID NO：8)所示。
[0170] 4、用含有与基础质粒模板同源的引物进行PCR，结果显示正确。
[0171] 基础质粒模板用限制性核酸内切酶BsmBI线性化。将PCR产物分别通过同源重组的方式分别连到基础质粒模板上，分别转化到Xl1‑Blue菌株中，并进行测序确认序列正确，转录模板构建成功。用摇瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。
[0172] 将转录模板用限制性核酸内切酶BbsI线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，分别获得SEQ ID NO：12、14的未加帽的mRNA(mRNA具体序列分别为SEQ ID NO：18、19)。分别用DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA
纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待
用。
纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待
用。
[0173] 用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，如图13所示，其中1为实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，2为
编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全
长S蛋白的mRNA，3为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的
mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全
长S蛋白的mRNA，3为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的
mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
[0174] 用24孔板铺3个孔的HEK293细胞，其中1、2号孔分别用lipofectamine 2000转染0.5μg加帽纯化后的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的
mRNA，和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2
谱系的全长S蛋白的mRNA，3号孔作为阴性对照。转染24h后，离心获得细胞上清和细胞沉淀
分别进行WB检测。WB检测结果如图14所示，其中1为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生
型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的表达上清，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突
变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照
的细胞上清，4为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的
表达细胞沉淀，5为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象
的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞沉淀，6为阴性对照的细胞沉淀。结果显示表
达出来的蛋白大小正确。
mRNA，和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2
谱系的全长S蛋白的mRNA，3号孔作为阴性对照。转染24h后，离心获得细胞上清和细胞沉淀
分别进行WB检测。WB检测结果如图14所示，其中1为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生
型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的表达上清，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突
变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照
的细胞上清，4为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA的
表达细胞沉淀，5为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象
的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞沉淀，6为阴性对照的细胞沉淀。结果显示表
达出来的蛋白大小正确。
[0175] 实施例4：序列来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合疫苗的制备与免疫
[0176] 1、原料准备
[0177] 1)将阳离子脂质D‑Lin‑MC3‑DMA、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇、PEG化脂质PEG‑DMG四个组分按摩尔比50:10:38.5:1.5在乙醇中溶解、混合。
[0178] 2)准备实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突
变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制备的编码含
IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA。
变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制备的编码含
IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA。
[0179] 3)将实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA和实施例3制备的编码含IgE信号肽的501Y.V2
谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo A。
谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo A。
[0180] 4)将实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA和实施例3制备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型
SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo B。
SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo B。
[0181] 2、试验步骤
[0182] 以脂质混合物：mRNA流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Ignite中分别混合包装combo A、combo B、实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和
986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制
备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA，得到包装好
的mRNA‑LNP，分别简写为comboA‑LNP，combo B‑LNP，S‑SA‑LNP和RBD‑SA‑LNP。将包装好的mRNA‑LNP透析并超滤浓缩到DPBS中，无菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。用DLS检测
mRNA‑LNP的粒径和粒径分布，检测结果如图15所示，包装后样品的粒径大小均在70nm‑
100nm，PDI均小于0.2。其中，combo A‑LNP：粒径平均值79.87nm，PDI值0.132，截距
(intercept)0.962，具体见表6；combo B‑LNP：粒径平均值80.61nm，PDI值0.123，截距
(intercept)0.958，具体见表7；S‑SA‑LNP：粒径平均值81.13nm，PDI值0.159，截距
(intercept)0.939，具体见表8；RBD‑SA‑LNP：粒径平均值82.74nm，PDI值0.112，截距
(intercept)0.960，具体见表9。
986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制
备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS‑CoV‑2的RBD序列的mRNA，得到包装好
的mRNA‑LNP，分别简写为comboA‑LNP，combo B‑LNP，S‑SA‑LNP和RBD‑SA‑LNP。将包装好的mRNA‑LNP透析并超滤浓缩到DPBS中，无菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。用DLS检测
mRNA‑LNP的粒径和粒径分布，检测结果如图15所示，包装后样品的粒径大小均在70nm‑
100nm，PDI均小于0.2。其中，combo A‑LNP：粒径平均值79.87nm，PDI值0.132，截距
(intercept)0.962，具体见表6；combo B‑LNP：粒径平均值80.61nm，PDI值0.123，截距
(intercept)0.958，具体见表7；S‑SA‑LNP：粒径平均值81.13nm，PDI值0.159，截距
(intercept)0.939，具体见表8；RBD‑SA‑LNP：粒径平均值82.74nm，PDI值0.112，截距
(intercept)0.960，具体见表9。
[0183] 表6：combo A‑LNP
[0184] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 91.43 100 32.02
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 91.43 100 32.02
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0185] 表7：comboB‑LNP
[0186]
[0187]
[0188] 表8：S‑SA‑LNP
[0189] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 93.36 100 33.28
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 93.36 100 33.28
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0190] 表9：RBD‑SA‑LNP
[0191] 粒径(nm) 强度(％) 标准差
峰1 92.91 100 30.56
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
峰1 92.91 100 30.56
峰2 0 0 0
峰3 0 0 0
[0192] 6周龄左右的BALB/c雌性小鼠随机6只一组，分为5组。分别在第0天和第14天免疫后腿肌肉接种5ug，在第14天和第28天检测S蛋白特异性抗体滴度，在第28天杀鼠检测细胞
因子。
因子。
[0193] 3、实验结果
[0194] 一免、二免后针对501Y.V2谱系的S蛋白特异性抗体滴度如图16所示，各组之间没有显著性差异。一免、二免后针对Wuhan‑Hu‑1isolate的S蛋白特异性抗体滴度如图17所示，结果显示，两组S与RBD组合免疫引起的特异性抗体滴度无显著性差异，但单S全长和单RBD
二免后的特异性抗体滴度均显著低于来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合(combo
B)。而替代性中和抗体滴度结果也显示(如图18，左边4组为针对Wuhan‑Hu‑1isolate的替代性中和抗体滴度，右边4组为针对501Y.V2谱系的替代性中和抗体滴度)，combo B针对
Wuhan‑Hu‑1isolate的替代性中和抗体滴度显著高于来源于相同SARS‑CoV‑2突变株
(501Y.V2谱系)的mRNA组合(combo A)、单S全长和单RBD；combo B针对501Y.V2谱系的替代
性中和抗体滴度则和combo A及单RBD无显著性差异，显著高于单S全长。说明S全长和RBD的
组合相对于单S全长有体液免疫优势，且来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合在体液
免疫方面相比于来源于相同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合可以提供更好地交叉保护效果。
二免后的特异性抗体滴度均显著低于来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合(combo
B)。而替代性中和抗体滴度结果也显示(如图18，左边4组为针对Wuhan‑Hu‑1isolate的替代性中和抗体滴度，右边4组为针对501Y.V2谱系的替代性中和抗体滴度)，combo B针对
Wuhan‑Hu‑1isolate的替代性中和抗体滴度显著高于来源于相同SARS‑CoV‑2突变株
(501Y.V2谱系)的mRNA组合(combo A)、单S全长和单RBD；combo B针对501Y.V2谱系的替代
性中和抗体滴度则和combo A及单RBD无显著性差异，显著高于单S全长。说明S全长和RBD的
组合相对于单S全长有体液免疫优势，且来源于不同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合在体液
免疫方面相比于来源于相同SARS‑CoV‑2突变株的mRNA组合可以提供更好地交叉保护效果。
[0195] CD4+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果如图19所示，CD8+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果如图20所示，结果显示，S全长和RBD的组合相对于单RBD有细胞免疫优势。再次
验证了S全长和RBD的组合设计在疫苗应用方面的优越性。
验证了S全长和RBD的组合设计在疫苗应用方面的优越性。
[0196] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这
些简单变型均属于本发明的保护范围。
些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0197] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可
能的组合方式不再另行说明。
能的组合方式不再另行说明。