一种微藻多肽及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及A61K38/00领域，尤其涉及一种微藻多肽及其制备方法和应用，微藻多肽的氨基酸序列为：EMFGTSSET，MTT检测结果显示ETT(10‑100μM)对HUVEC细胞无毒性。ETT对LOX‑1表达、ROS积累、各种炎症介质和细胞因子表达的具有影响。它通过抑制LOX‑1的表达来抑制ROS的过度产生，从而抑制相关细胞因子的表达。这些结果意味着ETT通过抑制ox‑LDL诱导的炎症和细胞凋亡而表现出抗动脉粥样硬化活性。

权利要求

1.一种微藻多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：EMFGTSSET。

2.一种根据权利要求1所述的微藻多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

3.一种根据权利要求1所述的微藻多肽在制备抑制细胞中氧化应激、炎症因子和凋亡蛋白表达药物中的应用。

说明书

一种微藻多肽及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及A61K38/00领域，尤其涉及一种微藻多肽及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 动脉粥样硬化是大多数心血管疾病的原因，也是全球主要死因。动脉粥样硬化的发病机系很复杂，动脉粥样硬化的发病机制复杂，主要涉及内皮细胞、脂质代谢和血管平滑肌细胞(VSMCs)。在这些因素中，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化开始的早期步骤。动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。动脉粥样硬化的一个典型特征是斑块内氧化修饰的低密度脂蛋白(ox‑LDL)的积累，这些脂蛋白可以通过作用于氧化应激而诱导内皮细胞的功能障碍和凋亡。通过特定受体，即凝集素型氧化LDL受体(LOX‑1)。

[0003] 许多研究表明，由ox‑LDL引起的动脉粥样硬化主要由内皮受体LOX‑1介导。ox‑LDL诱导的LOX‑1过度表达可导致内皮激活和/或损伤，因为LOX‑1促进ROS的产生。ROS的过量产生导致一系列蛋白激酶、酪氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的顺序磷酸化。MAPK级联介导NF‑κB、Nrf2等多种转录因子的激活。然后，caspase‑3、Bax和其他凋亡相关蛋白通过这些转录因子调控的途径表达。ox‑LDL还可以通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/三磷酸‑吡啶核苷酸(NADH/NADPH)氧化酶导致ROS形成。同时，已经证明ox‑LDL会引起动脉粥样硬化中各种细胞的炎症反应，并诱导各种炎症介质和细胞因子的表达，包括TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、ICAM‑1和VCAM‑1。因此，抑制血管内皮细胞中释放的促炎介质可以成为缓解动脉粥样硬化的有效措施。

[0004] 目前临床上将他汀类药物应用为降低心血管疾病风险的最有效手段之一，但同时会出现各种副作用，包括他汀类药物相关肌肉症状(SAMS)、糖尿病(DM)、和中枢神经系统疾病。因此，对于寻找并研究动脉粥样硬化疾病的新式药物迫在眉睫。

[0005] 近年来，天然活性物质逐渐走入人们的生活，由于其相对较低的毒性和较为丰富的活性，相关抗疾病研究愈来愈多。海洋微藻被认为是一种高价值的海洋生物资源，为人类生物医学和化学工业的研究提供了优良且尚未开发的生物活性成分。已有研究表明，其具有作为抗氧化剂、抗炎剂、抗癌剂、抗菌剂和抗过敏剂的潜在用途。

[0006] CN104800825A公开了从微藻中分离出来的肽通过MAPK和NF‑κB诱导成骨细胞分化方法，所得到的活性骨肽分子量小，生物活性高，易被人体吸收。

[0007] CN102822343A公开了微藻中异源多肽的生产，微藻胞外体、组合物及其制备方法和用途，包含异源多肽的微藻胞外体，以及他们的组合物。

[0008] 本发明中所研究对象为中国南部湛江湾地区的湛江等鞭金藻，它富含多不饱和脂肪酸和蛋白质，广泛用作贝类的水产养殖饲料，以及各种水产养殖动物的幼虫。本发明公开了一种从湛江等鞭金藻中分离出一种新肽，其生物学活性尚未见报道。

发明内容

[0009] 本发明的第一个方面提供了一种微藻多肽，其氨基酸序列为：EMFGTSSET。

[0010] 本发明的第二个方面提供了一种微藻多肽的制备方法，将微藻干粉用酶水解，通过体外模拟胃肠消化过程得到水解物，将水解物过离子交换柱纯化后进行氨基酸序列和分子量测定。

[0011] 作为一种优选的实施方式，所述微藻为湛江等鞭金藻。

[0012] 本发明所述微藻干粉得制备方法包括但不限于浓缩、冻干等常见的制备干粉的方法。

[0013] 作为一种优选的实施方式，所述酶为胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，所述胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为(1‑2)：(1‑2)：(1‑2)。

[0014] 优选的，所述胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为1:1:1。

[0015] 作为一种优选的实施方式，所述微藻干粉与酶的质量比为100：(0.5‑2)。

[0016] 优选的，所述微藻干粉与酶的质量比为100：1。

[0017] 作为一种优选的实施方式，所述胃蛋白酶与水解物的质量比为(0.5‑2)：100。

[0018] 优选的，所述胃蛋白酶与水解物的质量比为1:100。

[0019] 作为一种优选的实施方式，水解物在105℃真空条件下用盐酸水溶液溶解稀释24h，采用自动氨基酸分析仪进行定量后再进行离子交换柱纯化。

[0020] 优选的，所述微藻多肽的制备方法包括：

[0021] (1)用培养基在25±1℃和含有2％CO2的消毒天然海水中培养湛江等鞭金藻，冻干海水制备微藻干粉；

[0022] (2)将胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶以质量比为1:1:1混合成复合酶后，将微藻干粉与复合酶以质量比为100：1混合，在反应器中37℃孵育8h，加热至100℃并保持20min，混合物冻干，得水解物；

[0023] (3)将质量浓度为4％的水解物调节pH值至2，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与水解物的质量比为1:100，在反应器中37℃孵育2.5h，调节pH值至10，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(质量比为1:1)，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶总质量与解物的质量比1:100，在反应器中37℃孵育2.5h，浓缩，冻干，得水解物；50mg水解物在105℃真空条件下用盐酸水溶液(6M，2mL)溶解稀释24h，采用自动氨基酸分析仪对水解物进行定量后再进行离子交换柱纯化；

[0024] (4)在用醋酸钠缓冲液(20mM,pH＝4.0)平衡的HiPrep16/10CMFF离子交换柱上通过FPLC纯化水解物，用0至2.0M的NaCl水溶液的梯度洗脱以1mL/min的流速洗脱柱子，收集每个级分3mL，在280nm处检测吸光度后分别冻干。

[0025] 具有较高自由基清除活性的级分继续通过RP‑HPLC进一步纯化，使用Primesphere10的C18柱(20mm×250mm)，在质量浓度为0.1％的三氟乙酸(TFA)中以0‑30％的乙腈为洗脱溶液，梯度洗脱，流速为60mL/h，洗脱液在215nm处检测。自由基清除活性优秀组分通过SynchropakRPP‑100分析柱(4.6mm×250mm)以60mL/h的流速进一步纯化，通过线性梯度洗脱(乙腈，0‑20％)进行分离，检测215nm处的吸光度。

[0026] (5)氨基酸序列和分子质量测定，SynchropakRPP‑100色谱柱的亚组分具有较高的自由基清除能力，采用电喷雾电离源和QTOF质谱对其进行分析。肽与甲醇和水(v/v,1:1)直接注入电喷雾源。使用质谱通过双电荷(M+2H)2+状态评估分子量。确定分子量后，自动选择肽段进行片段化，获得序列信息。

[0027] 作为一种优选的实施方式，本发明所制备的微藻多肽的氨基酸序列为EMFGTSSET，命名为ETT，分子量为998.02Da。

[0028] 所述ETT的结构式为图24。

[0029] 本发明的第三个方面提供了一种微藻多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

[0030] 本发明的第四个方面提供了一种微藻多肽在制备抑制细胞中氧化应激、炎症因子和凋亡蛋白表达药物中的应用。

[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0032] 1.MTT检测结果显示ETT(10‑100μM)对HUVEC细胞无毒性。

[0033] 2.ETT对LOX‑1表达、ROS积累、各种炎症介质和细胞因子表达的具有影响，能够表现出抗动脉粥样硬化活性。

[0034] 3.蛋白质印迹显示p‑Akt/Akt的比率增加，而裂解的caspase‑9/procaspase‑9、caspase‑3/procaspase‑3和Bcl‑2/Bax值降低，能够证明ETT可以通过激活Akt来抵抗细胞凋亡。

[0035] 4.ox‑LDL激活了MAPK通路，导致HUVEC凋亡，ETT可以降低p‑ERK、p‑JNK和p‑p38的表达，结果证明ETT通过调节MAPK信号通路来改善抗凋亡反应对HUVEC的有益作用。

[0036] 5.ETT可以激活Nrf2和HO‑1的蛋白表达，从而保护HUVEC免受ox‑LDL诱导的氧化损伤。

[0037] 6.ETT通过抑制NF‑κB通路中p65的核易位具有抗凋亡作用。

附图说明

[0038] 图1为ETT对HUVEC细胞的毒性的实验结果，图2‑3为细胞内活性氧簇的实验结果，图4‑7为细胞内LOX‑1、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的实验结果，图8‑24为蛋白免疫印迹的实验结果，图25为ETT的结构式。

[0039] 具体的，图2为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下的细胞在荧光倒置显微镜中的荧光成像图。

[0040] 图3为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下的平均光密度。

[0041] 图4为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下的LOX‑1的相对表达量。

[0042] 图5为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下的IL‑6的相对表达量。

[0043] 图6为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下的IL‑1β的相对表达量。

[0044] 图7为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下TNF‑α的电泳图和相对表达量。

[0045] 图8为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下ICAM‑1的电泳图和相对表达量。

[0046] 图9为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下VCAM‑1的电泳图和相对表达量。

[0047] 图10为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下NFκB通路的电泳图。

[0048] 图11为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下p‑p65/p65的相对表达量。

[0049] 图12为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下IκBα/p‑IκBα的相对表达量。

[0050] 图13为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下Nrf2通路的电泳图。

[0051] 图14为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下Nrf2的相对表达量。

[0052] 图15为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下HO‑1的相对表达量。

[0053] 图16为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下MAPK通路的电泳图。

[0054] 图17为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下p‑p38/p38的相对表达量。

[0055] 图18为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下p‑ERK/pERK的相对表达量。

[0056] 图19为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下p‑JNK/pJNK的相对表达量。

[0057] 图20为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下凋亡蛋白的电泳图。

[0058] 图21为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下Bc1‑2/Bax的相对表达量。

[0059] 图22为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下p‑AKT/AKT的相对表达量。

[0060] 图23为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下c‑caspase‑3/procaspase‑3的相对表达量。

[0061] 图24为空白组、阳性对照组、10μM、50μM和100μM下c‑caspase‑9/procaspase‑9的相对表达量。

[0062] 本发明中的试剂来源和英文缩写信息如下：

[0063] 湛江等鞭金藻的来源为中国南海海域中采集

[0064] 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶购买自Sigma‑Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)

[0065] HiPrep16/10CMFF离子交换柱购买自上海嵘崴达实业有限公司

[0066] Primesphere10的C18柱购买自上海嵘崴达实业有限公司

[0067] SynchropakRPP‑100分析柱购买自上海嵘崴达实业有限公司

[0068] HUVEC细胞的来源为广州赛库生物技术有限公司

[0069] DCFH‑DA试剂购买自美国Sigma‑Aldrich

[0070] ELISA试剂盒购买自上海碧云天生物技术有限公司

[0071] 一抗购买自美国Santa Cruz Biotechnology

[0072] 二抗购买自美国Santa Cruz Biotechnology

[0073] ECL化学发光试剂盒购买自上海文渊阁生物科技有限公司

具体实施方式

[0074] 实施例

[0075] 本实施例第一个方面提供了一种微藻多肽，其氨基酸序列为：EMFGTSSET。

[0076] 本实施例第二个方面提供了一种微藻多肽的制备方法，包括：

[0077] (1)用培养基在25±1℃和含有2％CO2的消毒天然海水中培养湛江等鞭金藻，冻干海水制备微藻干粉；

[0078] (2)将胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶以质量比为1:1:1混合成复合酶后，将微藻干粉与复合酶以质量比为100：1混合，在反应器中37℃孵育8h，加热至100℃并保持20min，混合物冻干，得水解物；

[0079] (3)将质量浓度为4％的水解物调节pH值至2，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与水解物的质量比为1:100，在反应器中37℃孵育2.5h，调节pH值至10，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(质量比为1:1)，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶总质量与解物的质量比1:100，在反应器中37℃孵育2.5h，浓缩，冻干，得水解物；50mg水解物在105℃真空条件下用盐酸水溶液(6M，2mL)溶解稀释24h，采用自动氨基酸分析仪对水解物进行定量后再进行离子交换柱纯化；

[0080] (4)在用醋酸钠缓冲液(20mM,pH＝4.0)平衡的HiPrep16/10CMFF离子交换柱上通过FPLC纯化水解物，用0至2.0M的NaCl水溶液的梯度洗脱以1mL/min的流速洗脱柱子，收集每个级分3mL，在280nm处检测吸光度后分别冻干。

[0081] 具有较高自由基清除活性的级分继续通过RP‑HPLC进一步纯化，使用Primesphere10的C18柱(20mm×250mm)，在质量浓度为0.1％的三氟乙酸(TFA)中以0‑30％的乙腈为洗脱溶液，梯度洗脱，流速为60mL/h，洗脱液在215nm处检测。自由基清除活性优秀组分通过SynchropakRPP‑100分析柱(4.6mm×250mm)以60mL/h的流速进一步纯化，通过线性梯度洗脱(乙腈，0‑20％)进行分离，检测215nm处的吸光度。

[0082] (5)氨基酸序列和分子质量测定，SynchropakRPP‑100色谱柱的亚组分具有较高的自由基清除能力，采用电喷雾电离源和QTOF质谱对其进行分析。肽与甲醇和水(v/v,1:1)直接注入电喷雾源。使用质谱通过双电荷(M+2H)2+状态评估分子量。确定分子量后，自动选择肽段进行片段化，获得序列信息。

[0083] 所制备的微藻多肽的氨基酸序列为EMFGTSSET，命名为ETT，分子量为998.02Da。

[0084] 本实施例第三个方面提供了一种微藻多肽在制备抗动脉粥样硬化药物的应用。

[0085] 性能测试

[0086] ETT对HUVEC细胞的毒性测定方法：将HUVEC细胞接种于96孔板中，放入培养箱中培养24h后，吸弃旧培养基，用PBS清洗，将培养基更换为无血清培养基，用浓度为10、50和100μM的ETT处理细胞，设置空白组，空白组中不加ETT。放入培养箱中继续培养24h，吸弃培养基后每孔加入100μLMTT溶液，放入培养箱中孵育，4h后吸掉96孔板中的MTT溶液，每孔加入100μLDMSO，孵育5min使结晶物充分溶解，用酶标仪测570nm处的吸光值。本研究通过MTT比色法可检测ETT对HUVEC细胞的毒性作用。

[0087] 细胞内活性氧簇(ROS)的测定方法：将HUVEC细胞200μL接种于24孔板中，孵育24h。弃去24孔板中的旧培养基，加入200μL/孔的新鲜培养基，用浓度为10、50和100μM样品处理细胞1h后，每孔加入10ng/ml的ox‑LDL，设置空白组和阳性对照组，空白组中不加ETT和ox‑LDL，阳性对照组不加ETT。放入培养箱培养12h。弃去旧培养基，用PBS缓冲溶液小心清洗细胞3min/次，重复3次；加入200μLDCFH‑DA试剂(10μM/L)，置于37℃恒温培养箱中孵育30min。
于荧光倒置显微镜下观察并拍照。

[0088] 细胞内LOX‑1、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的测定方法：将HUVEC细胞接种于6孔板中，放入培养箱中培养24h后，将培养基更换为无血清培养基，用浓度为10、50和100μM样品处理细胞1h后，每孔加入10ng/ml的ox‑LDL，设置空白组和阳性对照组，空白组中不加ETT和ox‑LDL，阳性对照组不加ETT。放入培养箱中继续培养24h。将培养基收集至离心管中，按照ELISA试剂盒说明书进行实验，最后用酶标仪测取吸光值。

[0089] 蛋白免疫印迹测定方法：将HUVEC细胞接种于6孔板中，放入培养箱中培养24h后，将培养基更换为无血清培养基，用浓度为10、50和100μM样品处理细胞1h后，每孔加入10ng/ml的ox‑LDL，设置空白组和阳性对照组，空白组中不加ETT和ox‑LDL，阳性对照组不加ETT。放入培养箱中继续培养24h。弃培养基后用4℃预冷的PBS清洗3次，每孔加200μL的RIPA细胞裂解液充分裂解细胞后，吸取至1.5mL离心管中，测蛋白浓度。以已测样品蛋白浓度中最低的为标准，其余换算为相同浓度，总体积5μL，加入1.2μL蛋白上样缓冲液(5×)，金属浴95℃，5min，离心10s，使所有溶液沉于离心管底部。进行SDS‑PAGE电泳，电压240V，电泳50min。
从电极芯上取出玻璃板，用超纯水冲洗，用剥胶铲轻轻撬开凝胶上的薄玻璃，切去四边多余的胶。将凝胶置于TBST缓冲溶液中，将NC膜放于超纯水中漂洗，裁剪成凝胶同样大小，将2层滤纸铺在托盘中，将已活化的NC膜放在滤纸上，再将胶放在膜上，再加两层滤纸，形成“2层滤纸‑膜‑胶‑2层滤纸”的结构，放入电转仪中，加入电转液，电流200A，转膜1h。转膜结束后，将NC膜放入7％的脱脂奶粉溶液中，置于摇床上室温封闭2h。封闭完成后，将膜放入孵育盒中，加入10mL的TBST溶液进行洗脱，每次10min，重复3次。向孵育盒中加入用TBST稀释的一抗(稀释倍数根据抗体说明书)，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，向孵育盒中加入10mL的TBST溶液进行洗脱，每次10min，重复3次。向孵育盒中加入用TBST稀释的二抗(稀释倍数根据抗体说明书)，置于摇床上室温孵育2h。孵育完成后，向孵育盒中加入10mLTBST溶液进行洗脱，每次10min，重复3次。使用ECL化学发光试剂盒，吸取500μL的B液和500μL的A液于
1.5mL离心管中避光保存，将发光液均匀敷与NC膜上，然后进行化学发光。