一种核桃粕乙酰胆碱酯酶抑制肽及其制备方法与应用

摘要

本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种提取自核桃粕的乙酰胆碱酯酶抑制肽及其制备方法与应用。所述乙酰胆碱酯酶抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Tyr‑Val‑Pro‑His‑Trp(YVPHW)、Phe‑Tyr‑Arg‑Arg(FYRR)或Leu‑Ala‑Pro‑Phe(LAPF)，半抑制浓度IC50分别为139.10±1.34μg/mL、304.20±2.57μg/mL和318.80±1.98μg/mL。本发明提供的短肽酶抑制作用明显，且采用核桃粕为原料，生产成本低，经济效益高。本发明还通过两步乳化法制备了负载短肽YVPHW的双纳米乳液，包封率可达92.65±0.77％。该双纳米乳液分布较为均匀，有较好的环境稳定性，可改善短肽YVPHW在胃肠道里很快被消化的缺点，达到缓慢释放的效果，为核桃粕深加工提供理论基础。

权利要求

1.一种乙酰胆碱酯酶抑制肽，其特征在于，乙酰胆碱酯酶抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Tyr‑Val‑Pro‑His‑Trp，简称YVPHW。

2.一种包含权利要求1所述抑制肽的双纳米乳液，其特征在于，将抑制肽由亚油酸和卵磷脂包埋获得。

3.如权利要求2所述的一种包含权利要求1所述抑制肽的双纳米乳液，其特征在于，制备方法如下：（1）将卵磷脂溶于蒸馏水中，配置0.1 mg/mL的卵磷脂溶液，该溶液为外水相；

（2）取适量亚油酸，加入5%的聚甘油蓖麻醇酸酯（PGPR）,该溶液为油相；

（3）将短肽配置成800 μg/mL的溶液，此为内水相；

（4）将油相与内水相置于磁力搅拌器搅拌20min后置于超声波破碎仪超声，超声条件为：325 W，15 min，间隔2 s；其中油相：内水相=3：2，此溶液为初乳；

（5）将外水相与初乳置于磁力搅拌器和超声波破碎仪，按照（4）中的参数进行操作，其中外水相：初乳=1:4；

（6）将所获得的双纳米乳液经过微射流处理，使其具有更稳定的乳液体系。

说明书

一种核桃粕乙酰胆碱酯酶抑制肽及其制备方法与应用

技术领域：

[0001] 本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种分离自核桃粕的乙酰胆碱酯酶抑制肽及其制备方法与应用。背景技术：

[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是神经退行性痴呆的最主要病因，也是老年人群发病率和死亡率的主要来源之一。其主要表现为记忆丧失、语言能力退化、行为异常和认知功能障碍。AD患者由于缺乏日常生活能力，给家庭和社会带来了沉重的负担。因此阿尔茨海默症是一项亟待解决的公共卫生问题，也是近些年来的研究重点。AD的病理特征主要有乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)缺失、淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过磷酸化等。在中枢神经系统中的胆碱能神经是构成学习和记忆的重要基础。胆碱能神经丢失学说是目前最被认可的AD发病机制，该学说认为，大脑中乙酰胆碱水平的下降会导致AD患者的记忆和认知障碍，AD患者神经间隙中乙酰胆碱酯酶活性较高，因此抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)的活性，可以提高突触间隙乙酰胆碱的浓度，有利于AD患者改善认知功能。

[0003] 现代医学实验研究发现，核桃对脑健康具有十分重要的作用。研究者发现核桃具有大脑所需的脂肪酸、微生物、矿物质等营养物质，可提升认知能力。核桃中含有14～28％的蛋白质，因其蛋白质的氨基酸组成种类齐全，包含了8种人体必需氨基酸，并且消化率、利用度高，从而被认为是优质蛋白质。作为核桃蛋白的酶解产物，核桃多肽因吸收率高、生物效价高、引起研究者的关注。文献报道指出，核桃蛋白多肽具有抗氧化、降压、抑菌、改善学习记忆等功效。如：脱脂核桃粕酶解液可作为天然抗氧化剂用于开发针对记忆障碍的功能性食品。天然还原肽可以降低与氧化、衰老等相关疾病的发生几率，因此，常被用于防衰老和改善记忆障碍保健食品的研究和开发。

[0004] 核桃(Juglans regia L.)是市面上常见的坚果类作物之一，具有丰富的营养价值和药用功效。核桃榨油后产生大量的副产物核桃粕，通常以饲料低价出售，不仅造成核桃蛋白资源的浪费，也严重阻碍了核桃产业的发展。生物酶解技术作为一种绿色生物转化手段，一方面有助于提高底物的生物利用率，另一方面可以将核桃粕蛋白分解成更利于人体吸收的小分子化合物，增加功能活性，提高营养价值。

[0005] 本研究以冷榨核桃粕为原料，利用双酶酶解法制备核桃多肽，采用超滤、葡聚糖凝胶层析等方法分离纯化核桃粕蛋白酶解液，并测定其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，筛选出抑制活性较高的多肽组分，对纯化后的核桃粕多肽进行液质分析，确定核桃粕多肽的氨基酸序列，通过分子对接技术筛选处对乙酰胆碱酯酶抑制活性较好的多肽序列，人工合成乙酰胆碱酯酶抑制肽，并检测其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。发明内容：

[0006] 为解决以上问题，本发明以核桃粕为原料，通过复合酶解法制备活性多肽，并采用超滤、葡聚糖凝胶色谱进行纯化，LC‑MS/MS鉴定多肽序列，并利用分子对接技术筛选抑制乙酰胆碱酯酶的活性片段，针对打分较高的多肽进行人工合成并验证其乙酰胆碱酯酶抑制活性；最后，再次利用分子对接技术对单个抑制活性多肽与受体蛋白AChE进行分子对接，分析其相互作用的关键氨基酸及作用力。

[0007] 本发明提供的技术方案之一，是提取自核桃粕的乙酰胆碱酯酶抑制肽，所述抑制肽自N端至C端的氨基酸序列为Tyr‑Val‑Pro‑His‑Trp，以下简称YVPHW；或者，自N端至C端的氨基酸序列为Phe‑Tyr‑Arg‑Arg，以下简称FYRR；或者，自N端至C端的氨基酸序列为Leu‑Ala‑Pro‑Phe，以下简称LAPF；

[0008] 所述蛋白酶抑制肽YVPHW、FYRR、LAPF可通过人工合成的方式获得，也可通过对核桃粕酶解筛选获得；

[0009] 本发明提供的技术方案之二，是上述抑制肽YVPHW、FYRR、LAPF在抑制乙酰胆碱酯酶中的应用，YVPHW对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度(IC50)达到139.10±1.34μg/mL；FYRR对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(IC50)达到304.20±2.57μg/mL；LAPF对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(IC50)达到318.80±1.98μg/mL；

[0010] 本发明提供的技术方案之三，是一种乳液体系包埋短肽，是将抑制肽YVPHW由卵磷脂和亚油酸包埋获得；

[0011] 进一步的，制备方法如下：

[0012] (1)将卵磷脂溶于蒸馏水中，配置0.1mg/mL的卵磷脂溶液，该溶液为外水相；

[0013] (2)取适量亚油酸，加入5％的聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)，该溶液为油相；

[0014] (3)将短肽配置成800μg/mL的溶液，此为内水相；

[0015] (4)将油相与内水相置于磁力搅拌器搅拌20min后置于超声波破碎仪超声(325W，15min，间隔2s)；其中油相：内水相＝3：2，此溶液为初乳；

[0016] (5)将外水相与初乳置于磁力搅拌器和超声波破碎仪，按照(4)中的参数进行操作，其中外水相：初乳＝1:4；

[0017] (6)将所获得的乳液经过微射流处理，使其具有更稳定的乳液体系。

[0018] 本发明还提供获取上述多肽的方法，具体如下：

[0019] 本发明以核桃粕为原料，经石油醚脱脂后采用碱提酸沉法提取脱脂核桃粕中的蛋白，再用碱性蛋白酶与胃蛋白酶复合酶解，酶解液首先经过超滤分离，得到不同分子量范围(0‑3KDa、3‑5KDa、5‑10KDa、>10KDa)的核桃粕多肽，检测它们对乙酰胆碱酯酶的抑制能力，得到0‑3KDa的超滤液对乙酰胆碱酯酶的IC50值最低，为510.50±0.52μg/mL，得因此选用该分子量超滤液进行葡聚糖凝胶层析G‑25纯化，同样检测它们对乙酰胆碱酯酶的抑制能力，得到纯化后乙酰胆碱酯酶抑制活性高的组分F3(IC50＝323.71±1.31μg/mL)，再采用EASY nano‑LC system液相色谱仪，C18(75μm×100mm，3μm)，串联LTQ orbitrap velos pro质谱仪，测定核桃粕多肽的结构；通过分子对接技术从LC‑MS/MS中得到的606条多肽中筛选出与AChE(PDB：3LII)对接时对接能较低的多肽序列，继而对相应的多肽进行人工合成，人工合成YVPHW、FYRR、LAPF后验证乙酰胆碱酯酶抑制活性，发现具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，IC50分别为139.10±1.34μg/mL、304.20±2.57μg/mL和318.80±1.98μg/mL，分子对接结果表明，YVPHW、FYRR、LAPF与AChE之间主要通过π‑π堆积、烷基键、π‑烷基键以及氢键相连接。

[0020] 有益效果：

[0021] 本发明还提供上述抑制肽及含有该肽的纳米乳液，其酶抑制作用明显。且采用核桃粕为原料，生产成本低，经济效益高。

[0022] 基于试验结果，超滤酶解后的核桃粕多肽，乙酰胆碱酯酶抑制率测定结果为分子量在0‑3KDa的核桃粕多肽对乙酰胆碱酯酶的抑制能力最强，IC50为510.50±0.52μg/mL，葡萄糖凝胶层析中F3组分对乙酰胆碱酯酶的抑制能力最强，IC50为323.71±1.31μg/mL，合成的短肽序列YVPHW对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度(IC50)达到139.10±1.34μg/mL，且具有经过胃消化后部分分解，在肠道内全部分解的特性。FYRR、LAPF也被证明有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性，IC50分别为304.20±2.57μg/mL和318.80±1.98μg/mL。

[0023] 同时经过微射流处理的负载短肽YVPHW的双纳米乳液表现了良好的酸碱稳定性，在pH 7‑8范围内无泄漏，在pH 3～8范围内，其对YVPHW的保留率均可达到75％以上，因此它有利于改善YVPHW在胃肠道内的稳定性。双纳米乳液在离子浓度为50‑250mmol/L下具有良好稳定性，保留率均可达到70％以上；在4、25、37℃下贮藏35天时，乳液中YVPHW的保留率分别为80.54±0.73％、75.35±0.60％和52.09±0.47％，因此4℃更有益于该纳米乳液的贮藏。附图说明：

[0024] 图1葡聚糖凝胶层析纯化图；

[0025] 图2F3组分液质分析基峰图；

[0026] 图3乙酰胆碱酯酶抑制肽YVPHW、LAPF、FYRR与AChE的相互作用图(A：YVPHW；B：LAPF；C：FYRR)；

[0027] 图4核桃粕多肽YVPHW、LAPF、FYRR液质质谱图(A：YVPHW；B：LAPF；C：FYRR)；

[0028] 图5模拟消化处理前后YVPHW的反相液相色谱图(A：消化前，B：经胃消化处理，C：经胃肠消化处理)；

[0029] 图6不同多肽浓度对乳液包封率的影响；

[0030] 图7不同处理方式对空白及负载短肽的纳米乳液粒径的影响；

[0031] 图8不同处理方式对空白及负载短肽的纳米乳液多分散指数的影响；

[0032] 图9不同处理方式对空白及负载短肽的纳米乳液的Zeta电位影响；

[0033] 图10不同处理方式对空白及负载短肽的纳米乳液的稳定性影响(A：超声空白；B：超声样品；C：超声微射流空白；D：超声微射流样品)；

[0034] 图11不同处理方式对空白及负载短肽的纳米乳液的流变特性影响；

[0035] 图12不同pH对负载短肽YVPHW的纳米乳液的保留率影响；

[0036] 图13不同离子强度对负载短肽YVPHW的纳米乳液的保留率影响；

[0037] 图14不同贮藏温度对负载短肽YVPHW的纳米乳液的保留率影响

[0038] 图15不同比例尺下负载短肽YVPHW的纳米乳液的激光共聚焦显微镜图；具体实施方式：

[0039] 为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清晰明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

[0040] 本领域技术人员在使用本发明提供的乙酰胆碱酯酶抑制肽时，可通过人工合成或核桃粕酶解分离获得。

[0041] 实施例1：核桃粕多肽的提取方法

[0042] (1)核桃粕脱脂：

[0043] 核桃粕粉碎过40目筛，以1∶5的料液比(w/v)加入石油醚抽提2h，过滤，收集残渣，连续提取3次，将残渣置于通风橱中挥干有机溶剂，即得核桃粕脱脂粉，于4℃条件下保存备用。

[0044] (2)碱溶酸沉提取核桃蛋白

[0045] 准确称取10g核桃粕脱脂粉于400mL的烧杯中，加入200mL的蒸馏水，调节pH至10.0，在磁力搅拌器上搅拌5min，然后超声处理20min，超声结束后立即取出，静置1h，
6000r/min离心20min，取上清液备用。用1mol/L的HCl调节pH至4.5，静置1h，6000r/min离心
20min，得到核桃粕蛋白沉淀，用1mol/L NaOH调pH值至7.0，得到核桃粕蛋白，真空冷冻干燥备用。

[0046] (3)碱性蛋白酶与胃蛋白酶双酶酶解

[0047] 将制备的核桃粕蛋白冻干粉以1∶20的料液比(w/v)与蒸馏水混合，并在90℃条件下预煮30min。预煮结束后，待温度降至60℃，以1mol/L的NaOH溶液将pH值调至10.0，添加5％(w/w)碱性蛋白酶水解核桃粕蛋白溶液3h。水解过程中通过加入1mol/L的NaOH溶液使反应的pH始终保持在10.0。碱性蛋白酶酶解结束后，待温度降至60℃，以1mol/L的HCl溶液将pH值调至2.0，添加5％(w/w)胃蛋白酶水解核桃粕蛋白溶液2h。酶解结束后，煮沸10min以终止酶促反应，以1mol/L的NaOH溶液将pH调至蛋白质等电点以去除大分子蛋白质，6000r/min离心20min，取上清液并将pH调至7.0，冻干备用。

[0048] (4)乙酰胆碱酯酶抑制能力测定

[0049] 本发明所使用的乙酰胆碱酯酶为购自上海麦克林生化科技有限公司的电鳗鱼乙酰胆碱酯酶(500U/g)。用0.1mol/L的PBS缓冲液(pH＝8)配置浓度为10mmol/mL的碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、5mmol/mL的5,5’‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸)(DTNB)、1U/mL的乙酰胆碱酯酶、以及不同浓度的阳性对照石杉碱甲和多肽液样品。

[0050] 在96孔板中加人160μL 0.1mol/L的PBS缓冲液(pH＝8)，10μL 1U/mL的AChE和10μL待测样品溶液，混匀，4℃放置20min。加入10μL的DTNB和10μL的ATCI，37℃反应20min，用酶标仪测定412nm处吸光度值。同时设立背景对照组和空白对照组。按下式计算酶活性抑制率。

[0051]

[0052] 空白组用PBS缓冲液(pH＝8)代替10μL样品液，完全抑制组用10μL石杉碱甲代替10μL样品液，样品本底组用10μL PBS缓冲液代替10μL ACHE。

[0053] 测定不同的样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，根据实验结果拟合计算样品对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(IC50)。结果如下：

[0054] 以多肽得率和乙酰胆碱酯酶抑制率为指标(多肽浓度为8mg/mL时测定)，碱性蛋白酶和胃蛋白酶复合酶对核桃粕分离蛋白水解后，其多肽得率为41.47±2.02％，对乙酰胆碱酯酶的抑制率达到89.12±3.12％。酶解液对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度IC50达到1.84±0.22mg/mL，而对照组石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度IC50为0.58±0.02μg/mL。

[0055] 实施例2超滤后不同分子量的核桃粕多肽对乙酰胆碱酯酶的抑制能力

[0056] 经碱性蛋白酶和胃蛋白酶复合酶解得到的核桃粕酶解液中包含游离氨基酸、长度不一的多肽以及水解程度较小的蛋白等，成分复杂，要获得活性、纯度高的多肽需要将其纯化。

[0057] 本实施例利用超滤的手段、以乙酰胆碱酯酶抑制能力为指标纯化核桃粕多肽，并通过LC‑MS/MS鉴定纯化后组分的多肽序列。通过PyRx虚拟筛选结合Autodock Vina分子对接以及文献调研等手段，筛选出可能具有较强乙酰胆碱酯酶抑制能力的肽段。

[0058] (1)超滤

[0059] 将实施例1制备的核桃粕酶解产物进行超滤处理，以纯化和富集活性成分。依次使用截留分子量为10KDa、5KDa和3KDa的超滤膜包对酶解液进超滤分离，将多肽溶液置于冰浴中以保持活性。结束后，将四个组分的核桃粕多肽分别冷冻干燥，置于‑20℃保存备用。测定不同分子量多肽的对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度。结果如表1所示0‑3KDa的小分子多肽的乙酰胆碱酯酶抑制活性更好。因此可知，核桃粕多肽具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性，且小分子多肽的活性更为显著。

[0060] 表1不同分子量多肽的乙酰胆碱酯酶抑制能力

[0061]

[0062] 注：不同大小写字母表示样品间存在显著性差异(Duncan检验，p＜0.05)[0063] (2)葡聚糖凝胶层析

[0064] 采用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G‑25)对超滤后的0‑3KDa的小分子多肽进行分离。分离条件为：上样量5mg/mL，5mL，层析色谱柱规格为1.6×60cm，流速：1mL/min，蒸馏水作为洗脱液，采用紫外检测器检测，波长为220nm。

[0065] 超滤后的0‑3KDa的小分子多肽进行葡聚糖凝胶层析G‑25，得出三个峰的多肽：1号峰F1、2号峰F2和3号峰F3，结果如图1所示，对其进行乙酰胆碱酯酶抑制率测定，表2不同组分抑制乙酰胆碱酯酶能力的半抑制浓度(IC50)值可以看出，经纯化得到的组分F3的活性更高。

[0066] 表2葡聚糖凝胶层析纯化后不同组分的乙酰胆碱酯酶抑制能力

[0067]

[0068] 注：不同大小写字母表示样品间存在显著性差异(Duncan检验，p＜0.05)[0069] (3)LC‑MS/MS多肽组成鉴定

[0070] 将葡聚糖凝胶色谱过后的高活性F3组分进一步进行LC‑MS/MS测定所含多肽的氨基酸序列及分子量。所用色谱柱为75μm×150mm的Acclaim PepMap C18分析柱(5μm， )，流动相A和B分别为0.1％(v/v)甲酸水溶液和0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，流速为200nL/min，洗脱78皿。

[0071] MS和MS/MS参数如下：

[0072] (1)MS：扫描范围＝100‑1500(m/z)；分辨率＝60,000；最大进样时间＝40ms；动态排除时间＝20s。

[0073] (2)MS/MS：分辨率＝7,5000；最大进样时间＝120ms；Top N＝20；NCE/steeped NCE＝27；扫描范围(m/z)＝100‑1500。

[0074] 利用基于样品种类的Mascot软件对原始MS/MS文件进行分析并从Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)搜索比对多肽结构，从而确定多肽序列。图4是核桃粕多肽F3组分的液质分析基峰图，经LC‑MS/MS分析以及数据库搜索比对，共得到氨基酸序列在10以下的多肽序列606个，为了筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的氨基酸序列，将606个多肽小分子与AChE进行虚拟筛选对接，对606个小分子进行打分排序，以筛选活性较高的多肽序列。

[0075] (4)PyRx肽段虚拟筛选

[0076] 使用ChemDraw软件绘制氨基酸个数在10个及以下的肽段的3D结构图。从RCSB Protein Data Bank数据库(https://www.rcsb.org)下载乙酰胆碱酯酶三维结构文件作为本发明对接使用的受体，其PDB编号为3LII。对酶的结构进行加氢去水预处理，并保存为pdbqt格式。使用PyRx软件将所有肽段设为配体，与乙酰胆碱酯酶受体依次进行对接打分和虚拟筛选，通过对接能大小判断其相互作用力的强弱以筛选肽段。

[0077] 表3肽段与乙酰胆碱酯酶的对接能排名

[0078]

[0079] 对接能打分代表着受体与配体的结合潜力，较低的得分通常对应着两者之间较强的结合能力。将液质分析后得到的肽段经模拟打分并将对接能排名，结果如表3所示。肽段‑1 ‑1 ‑1YVPHW、LAPF、FYRR与酶的对接能分别为‑9.6kcal mol 、‑9.6kcal mol 、‑9.3kcal mol 。
此结果说明YVPHW、LAPF、FYRR可能具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制作用，根据其序列进行合成以备后续实验。

[0080] (5)Autodock Vina分子对接

[0081] 配体及受体处理：使用ChemDraw软件绘制肽段的3D结构图，并使用AutodockTools 4.2.6软件打开多肽和酶(PDB:3LII)。将多肽作为配体，进行加氢、加电荷处理，检测root、进行可旋转键的搜寻与定义；将酶作为受体，添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢，将二者均保存成pdbqt文件。

[0082] 对接及分析：确定分子对接的坐标和盒子大小，对接运行次数设置为100次。采用Autodock Vina进行半柔性对接，选取对接结合能最佳的构象用于对接结合模式分析，并使用Discovery Studio 2.5进行作图。

[0083] 图3展示了酶与多肽结合时产生的相互作用，可以看出多肽嵌入在乙酰胆碱酯酶结构上的凹槽中，并呈现出紧凑的结合模式。由YVPHW、LAPF、FYRR和乙酰胆碱酯酶的相互作用图可以看出，三个多肽均对接于3LII的空腔中，且疏水相互作用和氢键是三条多肽与乙酰胆碱酯酶之间的主要相互作用力。对接结果表明3LII的His447可与FYRR中的苯环通过π‑π堆积连接，Tyr72、Tyr341、Tyr337、Trp86、Asp74可与FYRR上的氢原子和氧原子形成氢键。3lii的Ser203、Trp75可与YVPHW上的氢原子和氧原子形成氢键，Phe338、Tyr337与YVPHW通过π‑烷基键以及烷基键进行连接。3lii的Tyr341与LAPF通过氢键进行连接，Leu76、Trp286、Val294与LAPF通过π‑烷基键以及烷基键进行连接。

[0084] 实施例3多肽活性验证

[0085] (1)肽段人工合成

[0086] 肽段的合成采用Fmoc固相合成法，根据氨基酸序列合成肽段，经切割、析出、纯化后得到粉末状多肽。合成过程委托南京源肽生物科技有限公司。肽段YVPHW、LAPF、FYRR的纯度均大于95％。

[0087] (2)人工合成肽段活性验证

[0088] 根据实施例1中描述的方法测定不同浓度的肽段对乙酰胆碱酯酶的抑制率，[0089] 根据实验结果拟合计算肽段对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(IC50)。肽段YVPHW的IC50值为139.10±1.34μg/mL，LAPF的IC50值为318.80±1.98μg/mL，FYRR的IC50值为304.20±2.57μg/mL有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，可以作为具有功能性的生物活性肽开展后续应用。图4为YVPHW、LAPF、FYRR的质谱图。

[0090] 表4是人工合成的多肽YVPHW、LAPF、FYRR和石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的IC50值。从中可以看出在人工合成的三条多肽中，肽段YVPHW最好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。

[0091] 表4合成短肽YVPHW、LAPF、FYRR的乙酰胆碱酯酶抑制活性

[0092]

[0093] 注：不同大小写字母表示样品间存在显著性差异(Duncan检验，p＜0.05)[0094] (3)肽段消化稳定性研究

[0095] 为探究筛选出的肽段在胃肠消化过程中的稳定性，设计体外模拟消化实验，进行两段式胃肠道模拟消化。

[0096] 多肽在胃肠道中的稳定性是其重要性质之一。通过RP‑HPLC对未处理、经过胃液消化、肠液消化后的短肽YVPHW进行定性与定量，探究其模拟消化稳定性。图5(A)为消化前YVPHW(浓度为1mg/mL)的液相色谱图，可见其出峰时间为7.20min，峰型尖窄且无拖尾。图5(B)为YVPHW经胃液消化2h后的液相色谱图，图中7.20min处的峰面积变小，说明短肽经过胃消化后部分分解。图5(C)为YVPHW经胃肠液完全消化后的液相色谱图，图中7.20min处的峰面积变小且出现杂峰，在8.30min和11.10min出现新峰，说明短肽被进一步消化。

[0097] 实施例4负载短肽YVPHW的双纳米乳液

[0098] 许多蛋白水解物都具有苦涩味，肽段整体疏水性的增加会导致其苦味的增加，此外，对于含有大于等于4个氨基酸的肽段，其苦味会随着N端碱性氨基酸和C端疏水性氨基酸数量的增加而增加，同时通过实施例3发现，短肽YVPHW在胃肠道中很快被消化，因此可将其包封于运输体系中，以达到缓慢释放的目的。

[0099] (1)制备方法

[0100] 采用两步法制备水包油包水双纳米乳液。

[0101] 第一步：取适量亚油酸，加入5％的聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)搅拌均匀,该溶液为油相；将短肽配置成800μg/mL的溶液，此为内水相；将油相与内水相置于磁力搅拌器搅拌20min后置于超声波破碎仪超声(325W，15min，间隔2s)；其中油相：内水相＝3:2，得到初乳[0102] 第二步：首先将卵磷脂溶于蒸馏水中，配置浓度为0.1mg/mL的卵磷脂溶液，该溶液为外水相；将外水相与初乳置于磁力搅拌器和超声波破碎仪，按照相同的参数进行操作，其中外水相：初乳＝1：4；最后将所获得的乳液经过微射流处理，使其具有更稳定的乳液体系。

[0103] (2)乳液包封率测定

[0104] 取适量乳液于离心管中，在预冷到4℃的离心机中以12000r/min的转速离心20min，此时乳液分为乳脂层和血清层。取血清层经0.22μm滤膜过滤后，用酶标仪测定其在
220nm处的吸光度，代入标准曲线计算出游离在血清层中多肽YVPHW的含量。

[0105]

[0106] 结果如图6所示，当短肽浓度为800μg/ml时，乳液的包封率最高，为81.63±1.04％。

[0107] (3)粒径

[0108] 图7为不同处理方式对空白和负载短肽的纳米乳液的粒径和多分散指数的影响，乳液A‑D均为单峰分散，且粒径由0.8‑2.1nm不等。从图中可以看出，与A相比，B的峰稍微右移，说明加入多肽会稍微影响乳液的粒径。多分散指数(PDI)表示内粒径的均匀程度，PDI值大表明体系内物质的尺寸差别大，粒径分布宽。一般PDI小于0.3即可认为体系粒径分布均匀。图8为四种乳液的多分散指数，PDI值均处于0.20‑0.25之间，表明乳液体系较为均匀。

[0109] (4)Zeta电位

[0110] 不同处理方式对空白和负载短肽的纳米乳液的Zeta电位如图9所示，A‑D组乳液的电位绝对值分别为38.17±0.36mV，37.60±0.60mV，43.53±0.50mV42.77±0.32mV。一般来说，Zeta电位的绝对值大于30mV表明体系比较稳定。经过微射流处理后的样品的电位绝对值明显高于未经过处理的，表明微射流处理可以使乳液更加稳定。

[0111] (5)乳液稳定性

[0112] 不同处理方式对空白和负载短肽的纳米乳液的稳定性如图10所示，由AB可知，只经过超声处理制备的乳液的顶部谱线逐渐向上变宽，乳液的透光率变大，说明在离心力的作用下乳液组分向下迁移，沉淀于样品池底部，使乳液变澄清，说明微射流均质可以提高乳液的稳定性。

[0113] (6)流变特性

[0114] 图11为不同处理方式对空白和负载短肽的纳米乳液的流变特性的影响，在所有样品中均能观察到广泛的剪切稀化，即表观粘度随着剪切速率的增加而显着降低。剪切黏度结果表明，所制备的乳状液表现为具有剪切稀释特性的假塑性流体。

[0115] (7)pH、离子强度、贮藏稳定性分析

[0116] 图12‑14分别是对乳液的pH、离子强度、贮藏稳定性分析。

[0117] 如图12所示。在pH＝8时乳液的保留率为90.14±0.31％左右，随着pH值的降低，保留率逐渐下降，当pH＝3时，乳液的保留率为75.05±0.84％，pH在3‑8之间，乳液的保留率均大于70％，说明乳液具有较好的酸碱稳定性。

[0118] 如图13所示。当离子浓度较低时(50mmol/L)，乳液的保留率较好，为90.48±1.41％，随着离子浓度的升高，保留率逐渐降低，离子浓度为250mmol/L时乳液的保留率为
72.65±1.53％。这可能是因为NaCl具有静电屏蔽作用，在高离子浓度下，盐析作用占主导地位，导致乳液絮凝。同时离子浓度过高，会导致液滴内外存在较大的渗透压，使乳液体系失稳，内容物流出导致保留率下降。

[0119] 由图14可以看出，在贮藏温度为4℃，25℃和37℃时，超声微射流处理的乳液中活性成分的保留率始终高于只经超声处理得到的乳液。4℃贮藏35天时，乳液中活性物质的保留率分别为80.54±0.73％(超声微射流处理)和75.93±0.48％(超声处理)；随着温度的升高，保留率逐渐降低，因此低温有利于该乳液的保存，且经过超声和微射流处理的乳液稳定性更好。

[0120] (8)激光共聚焦显微镜观察乳液微观形态

[0121] 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察W1/O/W2乳液。观察前油相用尼罗红染色，水相用尼罗蓝染色。染色10min后，将染色后的样品置于载玻片上，压上盖玻片，得到薄样品进行观察。结果如图15所示。从CLSM图像中可以看出，乳液液滴大小较为均匀，油相(绿色)和外水相(红色)重叠，表明O/W乳液的形成。但初乳油滴内部的水相因油壳的阻塞而没有被染色，无法清楚地观察到。

[0122] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。