一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用转让专利
申请号 : CN202111182083.7
文献号 : CN113699083B
文献日 : 2023-04-11
发明人 : 黄冬芬 , 郇恒福 , 王悠 , 董荣书 , 刘国道
申请人 : 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
摘要 :
本发明公开了一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用，所述的菌株为芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年5月31日，保藏号为CCTCC NO:M 2021649。本发明的菌株可将难溶的无机磷酸盐转化为可直接供植物吸收利用的可溶性磷，其在磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、磷矿粉四种难溶磷酸盐液体培养基中培养7天的溶磷量分别为35.0μg mL‑1、0.7μg mL‑1、1.2μg mL‑1、9.4μg mL‑1，为野生菌株后期研究提供了一定的参考，对解磷菌肥等微生物肥料的开发具有重要的价值。
权利要求 :
1.一种菌株，其特征在于：所述菌株为芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年5月31日，保藏号为CCTCC NO:M 2021649。
2.一种难溶磷酸盐的溶解剂，其特征在于：所述溶解剂包含如权利要求1中所述的菌株的发酵液或无菌体发酵液。
3.一种如权利要求1中所述的菌株在溶解难溶磷酸盐中的应用。
说明书 :
一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用。
背景技术
[0002] 磷是植物生长所需的最为重要的营养元素之一。土壤无机磷有三种形态，水溶态、矿物态和吸附态，其中主要以矿物态的形态存在。矿物态磷在碱性土壤中主要是磷灰石，在酸性土壤中主要是磷酸铁铝。吸附态磷是指土壤中被土壤固相如矿物或有机物所吸持的磷酸盐，其含量一般很低。水溶态可以溶解于水，能被植物直接吸收利用的磷，在土壤中的含量非常低，主要产生自矿物态磷的溶解和吸附态磷的释放。土壤酸碱环境对土壤中磷的形态有着直接的影响，因此土壤中磷的有效性和土壤的供磷能力也与土壤酸碱环境息息相关。酸性土壤中的活性铁、铝含量较高，易与可溶性磷相结合转化为难溶性磷酸铁、磷酸铝等形态而被固定。施用磷肥时肥料中的磷也常与土壤溶液中的活性铁、铝作用而被固定，后又水解转化为磷酸盐如磷钾铝石和磷钾铁铝石，再进一步转化为闭蓄态磷酸盐，因此酸性土壤中磷的有效性和供磷能力通常较低。
[0003] 土壤磷素的循环主要以微生物为中心，能将无效态磷转化为植物能吸收利用磷的微生物称为土壤磷素转化微生物，也称溶磷微生物，其中细菌称为溶磷菌或解磷菌,但是传统的解磷菌对难溶磷酸盐的溶解度较低 。因此需要一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用。
发明内容
[0004] 本发明提供一种具有溶磷能力的芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides及其应用。
[0005] 本发明所述的菌株为芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7，已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2021年5月31日，保藏号为CCTCC NO:M 2021649。
[0006] 除此之外，本发明还提供了上述芽孢杆菌的分离方法，包括以下步骤：
[0007] 取土样于无菌环境下称取 1g，置于装有9mL无菌水的三角瓶中(内有无菌玻璃‑4 ‑5 ‑6珠)，28℃下160r·min 振荡 30min选择3个连续的稀释度（10 ,10 ,10 )，用表面涂抹法接种于改良PKO平板培养基。
[0008] 每个平板接种土壤溶液0.1 ml。接种后的平板于28 ℃的恒温箱中培养约4d。待菌落生长出来后，根据生长情况和溶磷菌的大小进一步筛选优势菌落。
[0009] 挑取出现透明溶磷圈的菌株，连续划线培养3次，只有连续划线培养3次后仍能在PKO平板上生长的菌株才被视为有效溶磷菌。
[0010] 进一步的，所述改良PKO培养基包括磷酸钙3 g，蔗糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.1 g，七水合硫酸镁0.1 g，氯化钾0.2 g，硫酸锰0.03 g，七水合硫酸亚铁0.03 g，酵母菌膏0.5 g，琼脂15 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。
[0011] 本发明还提供一种难溶磷酸盐的溶解剂，所述溶解剂剂包含株为芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7发酵液，或芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7无菌体发酵液。
[0012] 进一步地，所述芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides 发酵液的制备方法，包括以下步骤：
[0013] 种子液的制备：将芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，240 r/ min，培养5‑7 d，制成种子液；
[0014] 发酵：将种子液接种于发酵培养基中，发酵条件为：接种量1vol%、装瓶量200 mL / 250 mL、发酵培养基初始pH值7 .0 7 .2，28 ℃，180 r/min，发酵时间10 天，得芽孢杆~菌Bacillus pseudomycoides发酵液。
[0015] 进一步地，所述芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides P7无菌体发酵液的制备：将芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides发酵液5000 r/min离心5 min后，用0 .4 µm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides无菌体发酵液。
[0016] 一种芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides在溶解难溶磷酸盐应用。
[0017] 本发明的有益效果为：
[0018] 本发明为该菌株具有溶解难溶磷酸盐能力，其在磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、磷矿粉‑1 ‑1四种难溶磷酸盐液体培养基中培养7天的溶磷量分别为35.0μg mL 、0.7 μg mL 、1.2 μg ‑1 ‑1
mL 、9.4 μg mL 。为首次将该菌与土壤溶磷能力相结合，为野生菌株后期研究提供了一定的参考，对解磷菌肥等微生物肥料的开发具有重要的价值。
mL 、9.4 μg mL 。为首次将该菌与土壤溶磷能力相结合，为野生菌株后期研究提供了一定的参考，对解磷菌肥等微生物肥料的开发具有重要的价值。
附图说明
[0019] 图1为本发明液体培养基有效磷含量动态变化示意图；
[0020] 图2为本发明液液体培养基酸碱度动态变化示意图。
具体实施方式
[0021] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0022] 如图1所示，
[0023] 实施例1溶磷菌的筛选
[0024] 选用在营养期的热研 2号柱花草（Stylosanthes guianensis cv. Reyan No. 2），烘干过筛（2mm）作为绿肥样品，海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所试验基地的砖红壤为土壤样品，采用室内土柱培养法，将蜡筒一端用两层滤纸封口，将供试土壤均匀加入蜡筒中并利用毛细作用使土柱均匀吸水至饱和持水量。后用保鲜膜将整个蜡筒密封，垂直放于培养箱内避光平衡48h。待土柱平衡后，将磷肥或绿肥混合均匀放于尼龙袋中，置于土柱顶部，用保鲜膜封口，在30℃（模拟田间相似环境选择该常温温度）生物培养箱培养。在15天、30天后，取出顶部绿肥样品分析腐解速率等指标，然后用切土装置将蜡柱从顶端依次切出25片2mm厚土片。取其中的土样于无菌环境下称取 1g，置于装有9mL无菌水的三角瓶中(内有无菌玻璃珠)，28℃下160r·min 振荡 30min）选择3个连续的稀释度（10‑4,10‑5,10‑6)，用表面涂抹法进行平板接种。接种培养基为改良PKO培养基(Pikovskaya’ s Medium)，其中包括磷酸钙3 g，蔗糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.1 g，七水合硫酸镁0.1 g，氯化钾0.2 g，硫酸锰0.03 g，七水合硫酸亚铁0.03 g，酵母菌膏0.5 g，琼脂15 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。每个平板接种土壤溶液0.1 ml。接种后的平板于28 ℃的恒温箱中培养约4d。待菌落生长出来后，根据生长情况和溶磷菌的大小进一步筛选优势菌落。挑取出现透明溶磷圈的菌株，连续划线培养3次，只有连续划线培养3次后仍能在PKO平板上生长的菌株才被视为有效溶磷菌。
[0025] 实施例2溶磷菌菌株的鉴定
[0026] 选取纯化培养的菌株，经16S rDNA 测序，将测序得到的序列在NCBI 中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果。经比对该序列与芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）的16SrDNA基因序列相似度高达99％。
[0027] 实施例3溶磷菌溶解难溶磷酸盐的能力
[0028] 在以磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、和磷矿粉为磷源的PKO 液体培养基中接入等量菌株制成的菌液（OD600为0.5），置于恒温摇床（160 r/min, 28℃）培养 7 d，将培养液在4℃下离心（10000 r/min）15 min，取上清液用钼锑抗比色法测定其有效磷含量，同时以不接种细菌悬液为对照，试验设置 3次重复。所测有效磷含量如下表：
[0029] Bacillus pseudomycoides P7在四种磷源培养液中有效磷含量（μg mL‑1）[0030]接种菌株 磷酸钙 磷酸铁 磷酸铝 磷矿粉
CK(不接种) 25.8±1.4 15.3±1.7 27.2±0.9 82.5±1.6
Bacillus pseudomycoides P7 60.8±8.8 16.0±0.9 28.5±3.3 91.9±6.0
CK(不接种) 25.8±1.4 15.3±1.7 27.2±0.9 82.5±1.6
Bacillus pseudomycoides P7 60.8±8.8 16.0±0.9 28.5±3.3 91.9±6.0
[0031] 溶磷量计算公式为：
[0032] 计算公式：P =（K‑Kck）×V/V1
[0033] 其中：P为溶磷量（μg/mL）；K为待测细菌培养液测得效磷含量；Kck为不接种细菌悬液测得有效磷含量（μg/mL）；V 为显色时溶液定容的体积（mL）；V1为显色时吸取上清液的体‑1积（mL）。计算所得Bacillus pseudomycoides P7溶磷量为磷酸钙35.0 μg mL 、磷酸铁0.7 ‑1 ‑1 ‑1
μg mL 、磷酸铝1.2 μg mL 、磷矿粉9.4 μg mL 。
μg mL 、磷酸铝1.2 μg mL 、磷矿粉9.4 μg mL 。
[0034] 实施例4液体培养基有效磷含量动态变化
[0035] 如图1所示，使用实施例3中的方法，每间隔24h检测不同培养液中的有效磷含量，所得7d有效磷含量动态变化。
[0036] 实施例5液体培养基酸碱度动态变化
[0037] 如图2所示每间隔24h检测不同培养液中的酸碱度，所得7d酸碱度动态变化。
[0038] 实施例6菌液有机酸含量
[0039] 将在以磷酸钙为磷源的液体培养基中培养7d后，将培养液过0. 45 μm无菌滤膜，用高效液相色谱仪测定溶液中草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸含量，如下表所示：
[0040] 在以磷酸钙为磷源的培养液中有机酸含量（mg L‑1）
[0041] 菌株 草酸 酒石酸 苹果酸 柠檬酸 琥珀酸CK(不接种) 3.70±0.27 3.34±0.63 4.99±0.13 0.00±0.00 0.00±0.00
Bacillus pseudomycoides P7 2.04±0.17 4.41±0.19 17.84±1.14 288.22±11.27 24.69±2.19[0042] 色谱条件：分析柱RP—ODS—C18，柱温30℃，流动相为 0.02 mol /L KH2PO4缓冲溶液—甲醇溶液（99∶1），用1 mol /L 磷酸调节pH 至2.60，紫外检测波长210 nm，进样量20 μL，流速 0. 5 mL /min。
Bacillus pseudomycoides P7 2.04±0.17 4.41±0.19 17.84±1.14 288.22±11.27 24.69±2.19[0042] 色谱条件：分析柱RP—ODS—C18，柱温30℃，流动相为 0.02 mol /L KH2PO4缓冲溶液—甲醇溶液（99∶1），用1 mol /L 磷酸调节pH 至2.60，紫外检测波长210 nm，进样量20 μL，流速 0. 5 mL /min。
[0043] 目前已有研究表明Bacillus pseudomycoides可以通过增加钾的有效性提高茶树对钾的吸收，但在溶磷方面还未有相关的研究。
[0044] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。