一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系及其应用

摘要

本发明属于组织工程支架材料领域，具体涉及一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系及其应用。ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系包括明胶纳米纤维支架和吸附在明胶纳米纤维支架上的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子。本发明发现ZIF8纳米粒子煅烧后具有近红外光敏感特性，其在近红外光应激作用下，可杀死肿瘤细胞。本发明的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系植入骨肿瘤切除后的缺损部位，NIR作用下，GF/ZIF8‑phenamil支架温度升高，杀死残留的肿瘤细胞。在实际应用中可以采取原位移植，可满足切除肿瘤组织后残余肿瘤细胞和产生骨缺损的要求，为临床骨肿瘤治疗提供新的选择。

权利要求

1.一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：包括明胶纳米纤维支架和吸附在明胶纳米纤维支架上的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子；所述煅烧处理后的ZIF8纳米粒子为未煅烧的ZIF8纳米粒子在600‑1000℃、N2气氛下热解6‑10h得到的。

2.根据权利要求1所述的近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：所述的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子分散于缓冲液中得到均匀的悬浊液，随后滴加在明胶纳米纤维支架上，得到近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系。

3.根据权利要求1所述的近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：所述的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子上负载有促成骨分化药物。

4.根据权利要求3所述的近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：所述促成骨分化药物为phenamil药物。

5.根据权利要求1所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：所述明胶纳米纤维支架的制备过程包括以下步骤：将明胶溶于溶液中配制明胶溶液，在模具中加入石蜡微球并使石蜡微球能够相互连接得到石蜡微球组件，然后将明胶溶液滴到石蜡微球组件上，转移到零下60 ℃‑零下100℃的环境中相分离过夜，随后，明胶/石蜡复合材料在零下10℃‑零下30℃的乙醇中浸泡12h以上，继续转移到1，4‑二氧六环中振荡12h以上，低温冷冻干燥，之后在正己烷中振荡脱蜡，低温盐浴冷冻干燥，得到支架材料在0‑8℃的丙酮/MES缓冲液中，进行化学交联。

6.根据权利要求1所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，其特征在于：未煅烧的ZIF8纳米粒子的制备过程包括以下步骤：2‑甲基咪唑和十六烷基三甲基溴化铵溶于甲醇中，Zn(NO3)2·6H2O也溶于甲醇，然后均匀混合，室温下继续搅拌，得到乳状悬浮液，然后将悬浮液离心，洗涤，得到未煅烧的ZIF8纳米粒子。

7.如权利要求1‑6任一项所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有肿瘤清除作用的组织工程支架材料的应用。

8.如权利要求3或4所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有骨组织修复作用的组织工程支架材料的应用。

说明书

一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系及其

应用

技术领域

[0001] 本发明属于组织工程支架材料领域，具体涉及一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系及其应用。

背景技术

[0002] 癌症是威胁人类健康的一种极其复杂的疾病。然而，目前的癌症诊断方法复杂，缺乏有效的治疗技术。常规治疗主要包括手术、放疗和化疗。但是，这些方法有一定的局限性。比如，手术在很多情况下不能完全清除肿瘤细胞，放化疗也会对身体产生很多副作用，比如常见的恶心呕吐，甚至会损害正常组织。

[0003] 虽然原发性骨肿瘤所占比例不大，但骨是转移性肿瘤最常见的器官之一。病理性骨折、骨缺损、脊髓和神经根受压是骨相关恶性肿瘤的常见并发症。

[0004] 因此，迫切需要设计一种既能消除和防止肿瘤复发，又能修复骨缺损的多功能材料。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系及其应用。

[0006] 本发明所采取的技术方案如下：一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，包括明胶纳米纤维支架和吸附在明胶纳米纤维支架上的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子。

[0007] 所述的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子分散于缓冲液中得到均匀的悬浊液，随后滴加在明胶纳米纤维支架上，得到近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系。

[0008] 所述的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子上负载有促成骨分化药物。

[0009] 所述促成骨分化药物为phenamil药物。

[0010] 所述明胶纳米纤维支架的制备过程包括以下步骤：将明胶溶于溶液中配制明胶溶液，在模具中加入石蜡微球并使石蜡微球能够相互连接得到石蜡微球组件，然后将明胶溶液滴到石蜡微球组件上，转移到零下60 ℃‑零下100℃的环境中相分离过夜，随后，明胶/石蜡复合材料在零下10℃‑零下30℃的乙醇中浸泡12h以上，继续转移到1，4‑二氧六环中振荡12h以上，低温冷冻干燥，之后在正己烷中振荡脱蜡，低温盐浴冷冻干燥，得到支架材料在0‑
8℃的丙酮/MES缓冲液中，进行化学交联。

[0011] 未煅烧的ZIF8纳米粒子的制备过程包括以下步骤：2‑甲基咪唑和十六烷基三甲基溴化铵溶于甲醇中，Zn(NO3)2•6H2O也溶于甲醇，然后均匀混合，室温下继续搅拌，得到乳状悬浮液，然后将悬浮液离心，洗涤，得到未煅烧的ZIF8纳米粒子。

[0012] 所述未煅烧的ZIF8纳米粒子在600‑1000℃、N2气氛下热解6‑10h，得到煅烧处理后的ZIF8纳米粒子。

[0013] 如上所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有肿瘤清除作用的组织工程支架材料的应用。

[0014] 如上所述的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有骨组织修复作用的组织工程支架材料的应用。

[0015] 本发明的有益效果如下：本发明发现ZIF8纳米粒子煅烧后具有近红外光敏感特性，其在近红外光应激作用下，可杀死肿瘤细胞。本发明的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系植入骨肿瘤切除后的缺损部位，NIR作用下，GF/ZIF8‑phenamil支架温度升高，杀死残留的肿瘤细胞。在实际应用中可以采取原位移植，可满足切除肿瘤组织后残余肿瘤细胞和产生骨缺损的要求，为临床骨肿瘤治疗提供新的选择。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

[0017] 图1为3D GF明胶纳米纤维支架SEM图。

[0018] 图2为(a) ZIF8的TEM图，(b)Z IF8的BET图，(c)Un‑ZIF8和ZIF8的FTIR表征图。

[0019] 图3为GF、GF/2ZIF8和GF/2ZIF8+NIR的Phenamil体外释放行为。

[0020] 图4为不同支架处理在无NIR照射(a) (b)和有NIR照射(c) (d)时对C2C12细胞ALP表达的影响。

[0021] 图5为不同支架处理在无NIR照射(a)(b)和有NIR照射(c) (d)时对C2C12细胞成骨相关基因表达的影响。

[0022] 图6为(a)Un‑ZIF8和ZIF8在不同NIR功率照射下的升温曲线图；(b) ZIF8在1.0 W/2
cm时连续5个循环NIR照射(10 min)/关闭(6 min)曲线图；(c)不同NIR功率对负载不同浓度ZIF8的干态明胶支架照射5 min的升温曲线图；(d)不同NIR功率对负载不同浓度ZIF8的湿态明胶支架照射10 min的升温曲线图。

[0023] 图7为不同NIR功率对GF‑2ZIF8和GF‑3ZIF8的干态明胶支架照射5 min的热成像图，(a)定性分析；(b)定量分析。

[0024] 图8为NIR功率为1.0 W/cm2时对GF和GF‑2ZIF8的湿态明胶支架照射10 min的热成像图，(a)定性分析；(b)定量分析。

[0025] 图9为GF和GF‑2ZIF8在有/无NIR照射后细胞存活图，(a)CCK8定量分析；(b)活死定性分析。

[0026] 图10为(a) GF和GF‑2ZIF8在NIR(1.0 W/cm2)照射时肿瘤部位的实时热成像图；(b) Control、GF+NIR和GF‑2ZIF8+NIR第0天和第14天裸鼠体内肿瘤图片；(c)三种治疗方法对肿瘤体积影响的定量分析；(d) 三种治疗方法对裸鼠体重影响的定量分析。

[0027] 图11为(a)三种治疗方法第14天肿瘤大体图；(b) 三种治疗方法第3天肿瘤组织的Tunel和H&E染色图。

[0028] 图12为三种治疗方法第14天裸鼠体内主要脏器（心、肝、脾、肺和肾）的H&E染色图。

具体实施方式

[0029] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

[0030] 本发明提供一种近红外光敏感的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系，包括明胶纳米纤维支架和吸附在明胶纳米纤维支架上的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子。在本发明的一些实施例中，将ZIF8纳米粒子煅烧处理后，得到的ZIF8纳米粒子具有近红外光敏感作用，在近红外光（NIR）作用下，升温效果显著，煅烧前的ZIF8纳米粒子则无该性能，发明人认为是ZIF8高温烧结后碳化形成的卟啉结构具有近红外光敏感特性。在本发明的一些实施例中，NIR照射后的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系能有效诱导肿瘤细胞凋亡和死亡，有效清除肿瘤。因此，本发明一些实施例制备的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有肿瘤清除作用的组织工程支架材料的应用。

[0031] 在本发明的一些实施例中，所述的煅烧处理后的ZIF8纳米粒子上负载有促成骨分化药物，具体的，所述促成骨分化药物为phenamil药物。phenamil药物负载到ZIF8纳米粒子中，具有优异的缓释作用，且近红外光作用能有效促进药物的释放，控制药物保持释放长达14天，保证了phenamil与干细胞间的相互作用，进而诱导干细胞成骨分化，促进新生骨的形成。因此在本发明的一些实施例中所提供的负载有phenamil药物的ZIF8功能化明胶纳米纤维支架体系制备具有骨组织修复作用的组织工程支架材料的应用。

[0032] 以下为具体实施例：

[0033] 一、明胶支架（GF）的合成与表征

[0034] 合成方法：称取1 g明胶溶于10 mL无水乙醇/PBS（50：50 v/v）溶液中，配制10 wt%的明胶溶液，60℃搅拌1 h，使明胶充分溶解，在聚四氟乙烯瓶中加入1 g粒径为150 300μm~的石蜡微球，将模具置于37℃下40min，以确保石蜡微球能够相互连接。然后，将冷却至37℃的明胶溶液(1mL)滴到石蜡微球组件上，转移到‑80℃冰箱中相分离过夜。随后，明胶/石蜡复合材料在‑20℃乙醇中浸泡24h，继续转移到1，4‑二氧六环中振荡24h，低温冷冻干燥48h后，将样品切成5 mm×1.5mm盘，在正己烷中振荡4d，脱蜡，然后用环己烷振荡2d，置换正己烷，然后低温冷冻干燥48h，得到的3D明胶支架在4℃的丙酮/MES缓冲液(pH5.3，0.05M)中，进行化学交联以供后续使用。

[0035] 的扫描电子显微镜（SEM）表征：SEM主要利用二次电子信号发射成像来观察测试样品的表面形态与结构特征，是目前表征材料和细胞生物领域较常用的研究工具。取未交联的GF支架，粘于预先贴好导电胶的载物台上，倒扣、用洗耳球吹除多余的样品残渣，喷金，放入仪器进行扫描。如图1所示，观察到相互贯通的孔结构和典型的纳米纤维结构，有利于细胞黏附。

[0036] 二、ZIF8的合成与表征

[0037] 合成方法：2‑甲基咪唑（1.108 g）和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,0.121 g) 溶于50mL甲醇中，Zn(NO3)2·6H2O (0.92 g) 溶于40 mL甲醇，两种溶液分别搅拌30min，然后均匀混合，室温下继续搅拌2h，得到乳状悬浮液，然后将悬浮液离心，洗涤3次，得到未煅烧的（Un）ZIF8。最后，将样品在800℃、N2气氛下热解8h，得到煅烧的ZIF8。

[0038] 的投射电子显微镜（TEM）表征：TEM是目前对材料进行精确表征的分析手段，它以比紫外光和可见光波长更短的电子束为光源，投射至待测物表面，高速电子束与待测样品原子发生碰撞，引起立体角散射现象，成像器件进一步以影像形式呈现出来。取少量ZIF8固体粉末固定于铜网上，透射电镜观察该纳米粒子的尺寸、形貌及孔径等情况。如图2所示，可2
观察到粒径大小均匀的十二面体纳米粒子。BET法测得ZIF8的比表面积是1631 m/g，ZIF8的孔径是1.347 nm。优良的比表面积和三维孔道结构有助于理想的药物负载与释放。

[0039] 的傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征：FTIR是基于物质分子中化学基团的振动（或转动）能级跃迁而产生的振‑转光谱，因不同化学键或官能团的吸收频率不同，从而可通过不同基团的特征性吸收峰及其相对强度对待测物质的分子结构进行定性和定量分析。

[0040] 本实验采用溴化钾压片法制样对煅烧前（Un）ZIF8和煅烧后ZIF8进行扫描测定。分别取适量的样品置于研钵里磨碎，再将干燥的溴化钾晶体按100∶1的比例与样品充分混合，研磨成细粉末。取适量粉末装入模具内，平整铺开，压片机压制成透明、厚度均匀的片状，迅速置于红外光谱仪中检测。分辨率为32 cm‑1，测定范围为400‑4000 cm‑1。如图2c所示， 2961 cm‑1、2876 cm‑1、1457‑1和1381‑1出现了‑CH3的不对称伸缩振动峰， 2930‑1处出现了‑CH2的不对称伸缩振动峰，而长炔链仅存在于CTAB中，表明煅烧前（Un）ZIF8中含有CTAB，而煅烧后ZIF8中不存在这些峰，表明煅烧后ZIF8中的CTAB已完全碳化。

[0041] 三、近红外光敏感的ZIF8明胶支架

[0042] 近红外光敏感的ZIF8明胶支架合成过程：将ZIF8分散于PBS超声10min得到均匀的悬浊液，加入Phenamil冰浴共混3h，随后每个GF支架表面滴加10uL的ZIF8和Phenamil混合液得到近红外光敏感的明胶支架。

[0043] 体外释放实验

[0044] 如图3所示，在中性PBS缓冲溶液中，直接滴加到GF支架上的phenamil呈缓慢持续释放，最大累积释放量为98.27%，持续7d。而以ZIF8形式负载再滴加至GF支架上的phenamil具有类似的释放方式，且近红外光照射后的累积释放量（46.31%）高于无近红外光照射时的累积释放量（19.99%），时间长达14d。

[0045] 结果表明ZIF8能有效负载phenamil药物小分子，具有优异的缓释作用，且近红外光作用能有效促进药物的释放，控制药物保持释放长达14天，保证了phenamil与干细胞间的相互作用，进而诱导干细胞成骨分化，促进新生骨的形成。

[0046] 2.碱性磷酸酶（ALP）表达

[0047] 如图4所示，无论近红外光（NIR）刺激与否，GF/BMP2组和GF/2ZIF8‑Phe/BMP2组培养7d和10d的C2C12细胞碱性磷酸酶(ALP)活性升高，且GF/2ZIF8‑Phe/BMP2组较GF/BMP2组有统计学差异，而GF/2ZIF8‑Phe组与GF组相比无明显差异。提示BMP2能促进成骨分化，而Phenamil单独作用不能有效促进细胞成骨分化，且BMP2可以通过小分子药物Phenamil刺激信号通路，从而显著地促进成骨分化，同时近红外光照射不会影响Phenamil的活性。

[0048] 3.成骨相关基因表达

[0049] 如图5所示为不同支架对C2C12细胞成骨相关基因（Col I，RUNX2，BSP）表达的影响。可以看到，无论NIR刺激与否，细胞培养7d后，与GF组相比，GF/BMP2、GF/Phe和GF‑2ZIF8/Phe/BMP2组均可促进成骨分化的晚期基因BSP的表达，且GF‑2ZIF8/Phe/BMP2组相较于GF/BMP2组有显著性差异，细胞培养10d后，GF/BMP2、GF/Phe和GF‑2ZIF8/Phe/BMP2组明显促进了成骨分化中晚期基因RUNX2和BSP的表达，表明BMP2和phenamil均能促进RUNX2和BSP的表达，且有统计学差异。对于干细胞成骨分化中后期表达的基因，GF/BMP2、GF/2ZIF8‑Phe/BMP2组的表达量显著高于GF组。上述结果表明，含BMP2组支架可促进C2C12细胞的成骨分化，且phenamil可显著增强BMP2的成骨分化功能，与ALP表达结果基本一致。

[0050] 体外光热性能

[0051] 图6‑8显示未煅烧（Un）ZIF8和煅烧后ZIF8在不同功率下的光热性能，可以看到未煅烧（Un）ZIF8在不同功率下升温效果不明显，而煅烧后ZIF8升温效果显著，且随着功率的增加而增加，温度增幅最大可达32℃，同时对ZIF8进行连续5个循环NIR实验(图6b)，其升温降温曲线基本一致，表明ZIF8具有良好的光热稳定性。与GF组相比，GF‑2ZIF8和GF‑3ZIF8组支架温度随着功率和时间的增加而增加，干态5 min和湿态10 min时，均是GF‑3ZIF8，1.5 2
W/cm时温度最高，增幅分别可达177℃和30℃，表明ZIF8浓度越高、NIR功率越大，支架温度越高。干湿态热成像定性定量结果与上述基本一致，表明ZIF8具有显著的光热性能和光热稳定性。

[0052] 体外光热消除骨肿瘤细胞

[0053] 图9可见GF‑2ZIF8支架上的细胞活性与GF支架上的细胞活性基本相同。功率为2
1.0W/cm的NIR对GF支架上肿瘤细胞的杀伤率为22%，而GF‑2ZIF8支架在NIR照射下对肿瘤细胞的杀伤率约为65%。细胞活死染色显示GF和GF‑2ZIF8支架在有或无NIR照射后，骨肿瘤细胞MG 63的细胞活性不同。有报道称，当细胞温度高于39℃时，蛋白质开始变性，当细胞温度超过41℃时，蛋白质变性，细胞暂时失活，这种情况可能持续数小时。如果温度持续超过
41℃，将导致细胞长期失活。在较高温度(45‑48℃)下，肿瘤细胞迅速坏死死亡，当温度高于
48℃时，癌细胞死亡严重。在NIR照射10min后，GF‑2ZIF8支架产生的高温(65.7℃)几乎杀死了支架下的所有细胞。提示GF‑2ZIF8支架在近红外光辐射下能有效诱导肿瘤细胞凋亡和死亡。

[0054] 体内光热治疗骨肿瘤

[0055] 建立裸鼠骨肿瘤模型，评价GF‑2ZIF8支架的光热效应。从图10a热成像图可以看2
出，功率1.0W/cm的NIR辐射10min后的GF支架温度基本不变，而GF‑2ZIF8支架的中心温度迅速上升到55℃左右。同时，从支架中心到支架边缘，温度逐渐降低。近红外激光覆盖的支架温度可维持在45℃以上，可有效清除肿瘤细胞。此外，GF‑2ZIF8支架的光热效应也与照射时间有关。照射时间太短，不能有效地消除肿瘤，照射时间过长，容易损伤正常组织甚至导致死亡，因此考虑到支架的体外光热效应，最终选择照射时间为10min。图10b显示了三种治疗方法第0天和第14天裸鼠体内肿瘤的照片。图11a显示了第14天三组肿瘤的直观照相。可见，对照组和GF+NIR组肿瘤生长速度都很快，分别是初始肿瘤体积的12.5倍和7.5倍(图
10c)。GF‑2ZIF8+NIR组第14天肿瘤体积虽未见缩小甚至消失，但基本维持其初始大小，说明GF‑2ZIF8+NIR能有效地抑制和消除肿瘤。TUNEL和H&E染色可进一步检测GF‑2ZIF8+NIR的抑瘤效果(图11b)。GF‑2ZIF8+NIR组肿瘤细胞密度明显降低。同时，不同处理方法对裸鼠体重无明显影响(图10d)，说明支架与NIR具有良好的生物相容性。图12显示了三种不同处理后的心、肝、脾、肺和肾的H&E染色，主要脏器未见肿瘤转移和组织损伤，表明GF‑2ZIF8+NIR具有优异的生物相容性和肿瘤消除作用。

[0056] 通过以上实施例及相关性能检测可以说明本发明所提供的近红外光敏感的ZIF8明胶支架理化性能优、生物形容性好，能有效产生光热作用并缓控释促成骨分化药物phenamil，高效杀伤肿瘤细胞，诱导C2C12细胞成骨分化，促进内源性骨再生。基于明胶支架的力学性能，在实际应用中可以采取原位移植，可满足切除肿瘤组织后残余肿瘤细胞和产生骨缺损的要求，在肿瘤细胞的消除和骨缺损修复重建中具有重要的价值。

[0057] 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。