一种抗细菌多肽及其应用

摘要

本发明公开了一种抗细菌多肽及其应用，属于多肽技术领域。为了提供一种杀菌能力强、容易吸收和无毒性的抗细菌多肽。本发明分别对抗真菌多肽的第1位、2位、6位中至少一个氨基酸进行突变，得到3个杀菌能力强、容易吸收和无毒性的多肽。本发明提供一种抗细菌的多肽，大小为1315Da，根据实验验证本发明提供的抗细菌的多肽杀菌能力强、起效快、抗菌时间持久、容易吸收和应用中无毒性。本发明公开的抗细菌多肽可应用于漱口水中。

权利要求

1.一种抗细菌多肽，其特征在于，所述抗细菌多肽为Arg‑Arg‑Val‑Val‑Phe‑His‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2。

2.根据权利要求1所述的抗细菌多肽，其特征在于，所述抗细菌多肽的氨基酸序列中氨基酸为L‑型或D‑型。

3.编码权利要求1或2所述的抗细菌多肽的基因。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的基因。

5.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞携带权利要求3所述的基因或者表达权利要求1或2所述的抗细菌多肽。

6.根据权利要求5所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞为原核细胞或者真核细胞。

7.权利要求1或2所述的抗细菌多肽在制备抑制微生物感染的产品中的应用，其特征在于，所述微生物为金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。

说明书

一种抗细菌多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种抗细菌多肽及其应用。

背景技术

[0002] 抵抗细菌微感染导致的传染病可以追溯到古代文明。随着亚历山大·弗莱明(Alexander Fleming)在1924年发现青霉素，细菌感染治疗取得了一个里程碑。这形成了现代抗生素药物的基础。但经过反复的抗生素治疗，由于细菌具有遗传突变，可以保护自己免受某些类型的抗生素的侵害，从而使它们能够在更高的抗生素浓度下生长。细菌种群将适应并最终变得对该药具有耐受性和耐药性。耐药机制包括药物的直接灭活，改变药物靶标以降低结合亲和力，减少摄取或增加外排，多余的途径绕过受影响的药物靶标等等。

[0003] 近年来，由于抗生素滥用，耐药菌感染所致疾病已成为临床治疗的重点和难点。抗菌肽作为一种广泛存在于生物体内的小分子多肽，具有抗菌谱广，抗菌效能高且不易产生耐药性等特点。其不仅能杀灭细菌，而且对正常细胞毒性较小，生物安全性高。

[0004] 目前抗菌肽技术特点是多肽结果包含多个阳离子，侧链性质多为疏水性基团，且多肽展现出两亲性。阳离子抗菌肽主要通过自身两亲性结构作用于细菌的细胞膜，通过带负电荷的疏水区域与胞膜脂质结合形成跨膜离子通道，带正电荷的亲水性区域与水或带负电荷的残基结合，使细胞膜穿孔，破坏细胞膜的完整性。抗菌肽进入细胞后引起胞内物质的絮凝反应、抑制细胞壁生成、与核酸物质相结合、抑制核酸或蛋白质合成、抑制酶的活性、改变细胞膜、抑制隔膜形成都是多次报道杀死细胞的机理，达到杀菌的目的，由于阳离子抗菌肽接触细菌时没有特异性作用靶位，所以其对耐药细菌也具有抑菌作用，且不易诱导新的耐药性产生。例如多次公开报道过的蟾蜍肽(Magainin)、蜂毒肽(Melittin)等。但这些抗菌肽均发现于动物体内，发现此类抗菌肽用于人体毒性大、对于其他物种排斥性较强。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了提供一种杀菌能力强、容易吸收和无毒性的抗细菌多肽，解决了如何抗细菌肽特异性杀菌的能力。

[0006] 本发明提供了一种抗细菌多肽，所述多肽是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗真菌多肽为出发序列，对第1、2、6位中的至少一个氨基酸突变获得的。

[0007] 进一步地限定，所述抗细菌的多肽为以下(a)～(c)中的任意一种：

[0008] (a)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第6位氨基酸突变为鸟氨酸；

[0009] (b)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第6位氨基酸突变为组氨酸；

[0010] (c)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第1位和第2为氨基酸突变为精氨酸，以及第6位突变为组氨酸。

[0011] 进一步地限定，所述抗细菌多肽的氨基酸序列中氨基酸为L‑型或D‑型。

[0012] 进一步地限定，所述抗细菌多肽的C端融合一个氨基或者羟基。

[0013] 进一步地限定，所述抗细菌多肽的C端、N端或氨基酸侧链进行化学修饰。

[0014] 进一步地限定，所述化学修饰为乙酰化、甲酰化、脂肪酸修饰、三氟乙酰化、苯甲酰化、2‑氨基苯甲酰化、氯乙酰化、溴乙酰化、DOTA修饰、NOTA修饰、TATE修饰、酰胺化、酯化、AMC修饰、AFC修饰、pNA修饰、CMK修饰、FMK修饰、醛基化、醇基化、AOMK修饰或PEG修饰。

[0015] 本发明还提供了一种编码上述的抗细菌多肽的基因。

[0016] 本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述的编码基因。

[0017] 本发明还提供了一种重组微生物细胞，所述重组细胞携带上述的编码基因或者表达权上述的抗细菌多肽。

[0018] 进一步地限定所述微生物细胞为原核生物或者真核生物。

[0019] 本发明还提供了上述的抗细菌多肽在制备控制微生物感染的产品中的应用。

[0020] 有益效果：本发明提供一种抗细菌的多肽，大小为1315Da，根据实验验证本发明提供的抗细菌的多肽杀菌能力强、起效快、抗菌时间持久、容易吸收和应用中无毒性。

附图说明

[0021] 图1为金黄色葡萄球菌抑菌曲线，其中，横坐标是时间，纵坐标是菌落数；

[0022] 图2为变异链球菌抑菌曲线，其中，横坐标是时间，纵坐标是菌落数；

[0023] 图3为大肠埃希菌抑菌曲线，其中，横坐标是时间，纵坐标是菌落数；

[0024] 图4为白色念珠菌抑菌曲线，其中，横坐标是时间，纵坐标是菌落数；

[0025] 图5为抗细菌多肽对人胚胎肾细胞293T安全性的影响结果图，其中，图A是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为5K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图B是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为15K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图C是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为5K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。图D是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为15K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。

[0026] 图6为抗细菌多肽对人正常肝细胞LO2安全性的影响结果图，其中，图A是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为5K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图B是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为15K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图C是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为5K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。图D是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为15K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。

[0027] 图7为抗细菌多肽对人永生化表皮细胞HaCaT安全性的影响结果图，其中，图A是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为5K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图B是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为15K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图C是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为5K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。图D是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为15K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。

[0028] 图8为抗细菌多肽对人胚肺成纤维细胞MRC‑5安全性的影响结果图，其中，图A是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为5K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图B是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，k04浓度为横坐标观察细胞数量为15K/孔(96孔板)下三天内对细胞的抑制情况。图C是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为5K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。图D是以吸光度(CCK8法测得存活率)为纵坐标，以日期为横坐标观察k04不同浓度下对细胞数量为15K/孔(96孔板)的细胞抑制情况。具体实施例

[0029] 肽链的顺序是：从N端到C端。

[0030] 人胚胎肾细胞293T细胞、人正常肝细胞LO2、人永生化表皮细胞HaCaT和人胚肺成纤维细胞MRC‑5是商业购买。

[0031] 公开的抗真菌的多肽序列为：Lys‑Lys‑Val‑Val‑Phe‑Lys‑Val‑Lys‑Phe‑Lys，(SEQ ID NO.1)KKVVFKVKFK。

[0032] 实施例1.一种抗细菌多肽的合成方法

[0033] 1.以FMOC合成法为基础，采用固相合成法，以酰胺类树脂为固相载体(交联度11％，0.97mmol/g)，FMOC保护的特殊氨基酸，HOBT/DIC偶联剂、10％哌啶/DMF(体积分数)有机碱，按照3倍合成规模的氨基酸投料，按照序列从后往前依次连接Lys‑Lys‑Val‑Val‑Phe‑Orn‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2。

[0034] 2.以苯酚：TA:EDT:水:TIS:三氟乙酸＝5:5:5:4:1:80(体积比)为剪切剂，搅拌避光反应。反应结束后抽滤，滤液沉淀，再次抽滤，滤饼为目的肽。

[0035] 3.合成的多肽粗产物通过制备型反相高效液相色谱(50mm内径制备柱)进行分离纯化，填料采用C18，5μm粒径、 孔径型号，A流动相使用乙腈，B流动相使用1‰TFA水，梯度洗脱，由A:B‑5％：95％变为A:B‑50％：50％，运行时间90分钟。

[0036] 4.分段收集最高峰顶处流出液，标准为液相纯度90％以上，合格收集液合并，减压蒸馏，最终浓度为5mg/ml，最终制得冻干粉为抗细菌肽化合物。

[0037] 其氨基酸序列为KKVVF‑鸟氨酸‑VKFK‑NH2，经质谱检测线性肽分子量大小1236Da。在SEQ ID NO.2的N端融合一个NH2，KKVVFOrnVKFK(SEQ ID NO.2)。

[0038] 实施例2.一种抗细菌多肽的合成方法

[0039] 1.以FMOC合成法为基础，采用固相合成法，以酰胺类树脂为固相载体(交联度11％，0.97mmol/g)，FMOC保护的特殊氨基酸，HOBT/DIC偶联剂、30％哌啶/DMF(体积分数)有机碱，按照5倍合成规模的氨基酸投料，按照序列从后往前依次连接Lys‑Lys‑Val‑Val‑Phe‑His‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2。

[0040] 2.以苯酚：TA:EDT:水:TIS:三氟乙酸＝5:5:5:4:1:80(体积比)为剪切剂，搅拌避光反应。反应结束后抽滤，滤液沉淀，再次抽滤，滤饼为目的肽。

[0041] 3.合成的多肽粗产物通过制备型反相高效液相色谱(50mm内径制备柱)进行分离纯化，填料采用C18，5μm粒径、 孔径型号，A流动相使用乙腈，B流动相使用1‰TFA水，梯度洗脱，由A:B‑5％：95％变为A:B‑50％：50％，运行时间90分钟。

[0042] 4.分段收集最高峰顶处流出液，标准为液相纯度90％以上，合格收集液合并，减压蒸馏，最终浓度为30mg/ml，最终制得冻干粉为抗细菌肽化合物。

[0043] 其氨基酸序列为Lys‑Lys‑Val‑Val‑Phe‑His‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2，在SEQ ID NO.3的N端融合一个NH2，KKVVFHVKFK(SEQ ID NO.3)。经质谱检测线性肽分子量大小为1259Da。

[0044] 实施例3.一种抗细菌多肽的合成方法

[0045] 1.以FMOC合成法为基础，采用固相合成法，以酰胺类树脂为固相载体(交联度11％，0.97mmol/g)，FMOC保护的特殊氨基酸，HOBT/DIC偶联剂、30％哌啶/DMF(体积分数)有机碱，按照5倍合成物质量的氨基酸投料，按照序列从后往前依次连接Arg‑Arg‑Val‑Val‑Phe‑His‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2。

[0046] 2.以苯酚：TA:EDT:水:TIS:三氟乙酸＝5:5:5:4:1:80(体积比)为剪切剂，搅拌避光反应。反应结束后抽滤，滤液沉淀，再次抽滤，滤饼为目的肽。

[0047] 3.合成的多肽粗产物通过制备型反相高效液相色谱(50mm内径制备柱)进行分离纯化，填料采用C18，5μm粒径、 孔径型号，A流动相使用乙腈，B流动相使用1‰TFA水，梯度洗脱，由A:B‑5％：95％变为A:B‑50％：50％，运行时间90分钟。

[0048] 4.分段收集最高峰顶处流出液，标准为液相纯度90％以上，合格收集液合并，减压蒸馏，最终浓度为30mg/ml，最终制得冻干粉为抗细菌肽化合物。

[0049] 其氨基酸序列为Arg‑Arg‑Val‑Val‑Phe‑His‑Val‑Lys‑Phe‑Lys‑NH2，在SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2，RRVVFHVKFK(SEQ ID NO.4)，经质谱检测线性肽分子量大小为1315Da。

[0050] 实施例4.利用抗细菌多肽制备产品

[0051] 漱口水：向市面上现有的漱口水中按照10‑50μg/ml量的比例加入抗细菌多肽，获得漱口水。

[0052] 利用以下实验验证实验效果：

[0053] 1.绘制抑菌曲线

[0054] 采用10μg/ml的药物浓度，将制备好的103‑108CFU/mL的菌悬液与药物混合。在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h时，吸取培养物，进行系列稀释,活菌计数,每个稀释度做三个平行实验，求平均值。最后以细菌浓度对数为纵坐标,培养时间为横坐标，绘制杀菌曲线。

[0055] 结果1，如图1所示(金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003抑菌曲线)，金黄色葡萄球菌抑菌实验中k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)与K01(SEQ ID NO.1的N端融合一个NH2)相比，k04(SEQ ID NO.4)‑NH2起效快，抑菌时间持久。

[0056] 变异链球菌抑菌实验中k04与K01相比，k04起效快，抑菌时间持久，图2为变异链球菌抑菌曲线。

[0057] 如图3所示(大肠埃希菌CMCC(B)44102抑菌曲线)，大肠埃希菌抑菌实验中k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)与K01(SEQ ID NO.1的N端融合一个NH2)相比，k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)起效快，抑菌时间持久。

[0058] 如图4所示(白色念珠菌CMCC(B)98001抑菌曲线)，白色念珠菌实验中k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)与K01(SEQ ID NO.1的N端融合一个NH2)相比，k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)起效快，抑菌时间持久。

[0059] 2.安全性

[0060] (1)抗细菌肽细胞毒性(对人胚胎肾细胞293T的影响)：

[0061] 分别选取对数生长期的人胚胎肾细胞293T细胞，分别按5k/孔和15k/孔接种于96孔板。将多肽药物(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)k04从0.25mg/ml开始梯度稀释，每一浓度都为上一浓度的1/4，共获得8组不同的浓度，使用CCK8的方法，对293T细胞在450nm处的吸光度进行连续4天的测定。

[0062] Day0为未加药物时293T的吸光度，Day1‑Day3分别为加药处理24h、48h、72h后293T的吸光度。分别用浓度和天数为横坐标，吸光度为纵坐标作图。结果如图5所示。

[0063] (2)抗细菌肽细胞毒性(对人正常肝细胞LO2的影响)：

[0064] 分别选取对数生长期的人正常肝细胞LO2，分别按5k/孔和15k/孔接种于96孔板。

[0065] 将多肽药物(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)k04从0.25mg/ml开始梯度稀释，每一浓度都为上一浓度的1/4，共获得8组不同的浓度，使用CCK8的方法，对人正常肝细胞LO2在450nm处的吸光度进行连续4天的测定。

[0066] Day0为未加药物时293T的吸光度，Day1‑Day3分别为加药处理24h、48h、72h后293T的吸光度。分别用浓度和天数为横坐标，吸光度为纵坐标作图。结果如图6所示。

[0067] (3)抗细菌肽细胞毒性(人永生化表皮细胞HaCaT)

[0068] 选取对数生长期的HaCaT细胞，分别按5k/孔和15k/孔接种于96孔板。

[0069] 将多肽药物k04(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)从0.5mg/ml开始梯度稀释，每一浓度都为上一浓度的1/4，共获得8组不同的浓度。使用CCK8的方法，对HaCaT细胞在450nm处的吸光度进行连续4天的测定。Day0为未加药物时HaCaT的吸光度，Day1‑Day3分别为加药处理24h、48h、72h后HaCaT的吸光度。分别用浓度和天数为横坐标，吸光度为纵坐标作图。结果如图7所示。

[0070] (4)抗细菌肽细胞毒性(对人胚肺成纤维细胞MRC‑5的影响)

[0071] 选取对数生长期的MRC‑5细胞，分别按5k/孔和15k/孔接种于96孔板。

[0072] 将多肽药物(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)k04从0.5mg/ml开始梯度稀释，每一浓度都为上一浓度的1/4，共获得8组不同的浓度。使用CCK8的方法，对MRC‑5细胞在450nm处的吸光度进行连续4天的测定。48h、72h后MRC‑5的吸光度。分别用浓度和天数为横坐标，吸光度为纵坐标作图。结果如图8所示。

[0073] 结果：(SEQ ID NO.4的N端融合一个NH2)药物多肽k04对于人细胞影响的数据中显示，在0.5mg/ml的最高浓度下对人体肝细胞略微有抑制作用，其他细胞无影响。对人体的安全性非常高。

[0074] 3.稳定性：在漱口水中的稳定性

[0075] (1)细菌传代稀释：将金色葡萄球菌和大肠埃希菌的微穹以1ml的肉汤培养基稀释后，分别接种到LB平板培养基和上，37°培养48h，取对数增长期的金黄色葡萄球菌和大肠埃6
希菌，以肉汤培养基为稀释剂，采用麦氏比浊法制成1×10CFU/ml的菌液。

[0076] (2)稳定性试验

[0077] 试验条件：37℃放置90天。

[0078] 阳性对照：金色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液。

[0079] 阴性对照：培养基。

[0080] 供试品：5个配方漱口水和各配方用培养基稀释2倍后溶液。

[0081] 试验操作：取96孔板，供试品组每孔加漱口水和菌液各100μl；阳性对照每孔加肉汤培养基和菌液各100μl；阴性对照每孔加200μl肉汤培养基。37°培养24h。阴性对照应澄清(‑)，阳性对照应浑浊(+)，供试品组澄清的试验孔为该漱口水抑菌，供试品组浑浊的试验孔为该漱口水不抑菌。

[0082] 表1漱口水中配方的多肽的浓度

[0083]名称 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5
多肽浓度 10μg/ml 15μg/ml 20μg/ml 10μg/ml 10μg/ml

[0084] 表2稳定性结果

[0085]

[0086] 结果：表1和表2所示，配方1、2、3在37℃放置90天后对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有抑制作用；配方5和4只对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对大肠埃希菌无抑制作用。