m6A重组兔单克隆抗体及制备方法

摘要

本发明提供了m6A重组兔单克隆抗体及制备方法，其重链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.2所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示；其轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ.NO.6所示。本发明提供的m6A重组兔单克隆抗体对m6A修饰的RNA有很好的富集能力，且在DNA损伤修复活体细胞模型中，检测m6A修饰的RNA有很好的灵敏度。

权利要求

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1.mA重组兔单克隆抗体，其特征在于，其重链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.2所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示；

其轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ.NO.6所示。

6

2.根据权利要求1所述的mA重组兔单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ.NO.7所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.NO.8所示。

3.根据权利要求1所述的m6A重组兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的重链恒定区亚型为IgG型，所述轻链恒定区的亚型为κ型。

6

4.编码权利要求1 3任一项所述的mA重组兔单克隆抗体的核酸。

~

5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码重链可变区的核酸其序列如SEQ.NO.9所示或是与之互补的序列，编码轻链可变区的核酸其序列如SEQ.NO.10所示或是与之互补的序列。

6

6.一种表达载体，其特征在于，包括编码权利要求1 3任一项所述的mA重组单克隆抗体~

的核酸。

7.转化或转染权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。

6

8.权利要求1 3任一项所述的m A重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：制~

备权利要求6所述的表达载体、培养权利要求7所述的宿主细胞及m6A重组兔单克隆抗体的表达。

6

9.根据权利8所述的mA重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述表达载体的制6

备方法包括：将mA分子与载体蛋白进行偶联，制备免疫原蛋白；然后将所述免疫原蛋白注入兔的体内中进行免疫，获得免疫增强的兔的B细胞，经过培养筛选后，从阳性克隆B细胞中6

提取所述mA重组兔单克隆抗体的RNA，再依次经过反转录及扩增，得到编码重链氨基酸的核酸与编码轻链氨基酸的核酸，将编码重链的核酸与编码轻链的核酸连接至载体质粒中后，得到所述表达载体。

10.权利要求1所述的m6A重组兔单克隆抗体在制备检测RNA m6A甲基化修饰的产品中的应用或在制备检测DNA紫外线损伤的产品中的应用。

说明书

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m A重组兔单克隆抗体及制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及m6A重组兔单克隆抗体及制备方法。

背景技术

[0002] N6‑甲基腺嘌呤(m6A)是目前发现的真核生物mRNA上含量最多的化学修饰，同时也6
广泛存在于多种细菌和RNA病毒中。在动物或植物体内， m  A可以被一系列甲基转移酶、去
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甲基酶和结合蛋白进行修饰、去修饰和识别。m A可以通过影响RNA加工代谢从而调控多种
生物学功能。相关研究还发现，RNA m6A修饰在UV诱导的DNA损伤反应中的重要作用，RNA的
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mA修饰主要是指导细胞快速准确的将Polκ募集到损伤位点并且加速DNA的损伤修复从而
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促使细胞存活。因此，有关RNA的mA修饰对于相关疾病机理研究、筛查以及药物研发等领域
具有重要的参考因素。

[0003] 目前的检测RNA的m6A修饰所采用的方法为m6A高通量检测技术与基于抗体特异性6
检测的技术。两者的共同点在于，为避免细胞中大量rRNA与tRNA的干扰，必须将m A修饰的
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RNA富集出来。而采取特异性抗体富集便是常用的方法，但是，目前所用的mA抗体依旧存在
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灵敏度不强的缺陷，难以进行IF实验；同时，在大量干扰RNA的存在下将m A修饰的RNA进行
富集非常困难。

发明内容

[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了m6A重组兔单克隆抗体及制备方法。

[0005] 具体技术方案如下：

[0006] m6A重组兔单克隆抗体，其不同之处在于，

[0007] 其重链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.2所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示；

[0008] 其轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ.NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ.NO.6所示。

[0009] 进一步，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ.NO.7所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.NO.8所示。

[0010] 进一步，重链氨基酸序列如SEQ.NO.17所示，轻链氨基酸序列如SEQ.NO.18所示。

[0011] 进一步，所述兔单克隆抗体的重链恒定区亚型为IgG型，所述轻链恒定区的亚型为κ型。

[0012] 编码上述m6A重组兔单克隆抗体的核酸。

[0013] 进一步，编码重链可变区的核酸其序列如SEQ.NO.9所示或是与之互补的序列，编码轻链可变区的核酸其序列如SEQ.NO.10所示或是与之互补的序列。

[0014] 进一步，编码重链的核酸其序列如SEQ.NO.11所示或是与之互补的序列，编码轻链的核酸其序列如SEQ.NO.12所示或是与之互补的序列。

[0015] 一种表达载体，其不同不处在于，包括编码权利上述m6A重组单克隆抗体的核酸。

[0016] 转化或转染上述表达载体的宿主细胞。

[0017] 上述m6A重组兔单克隆抗体的制备方法，其不同之处在于，包括：制备上述表达载6
体、培养上述宿主细胞及mA兔单克隆抗体的重组表达。

[0018] 上述m6A重组兔单克隆抗体的制备方法，其不同之处在于，所述表达载体的制备方6
法包括：将m A分子与载体蛋白进行偶联，制备免疫原蛋白；然后将所述免疫原蛋白注入兔
的体内中进行免疫，获得免疫增强的兔的B细胞，经过培养筛选后，从阳性克隆B细胞中提取
6
所述m A重组兔单克隆抗体的RNA，再依次经过反转录及扩增，得到编码重链氨基酸的核酸
与编码轻链氨基酸的核酸，将编码重链的核酸与编码轻链的核酸连接至载体质粒中后，得
到所述表达载体。

[0019] 进一步，扩增编码重链的核酸的引物对如SEQ.NO.13 SEQ.NO.14所示，扩增编码轻~
链的核酸的引物对为如SEQ.NO.15 SEQ.NO.16所示。
~

[0020] 在制备检测RNA m6A甲基化修饰的产品中的应用或在制备检测DNA紫外线损伤的产品中的应用。

[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0022] （1）本发明提供的m6A重组兔单克隆抗体对m6A修饰的RNA有很好的富集能力，且对于检测DNA紫外损伤有很好的灵敏度。

[0023] （2）本发明提供的m6A重组兔单克隆抗体的制备方法，先制备出表达载体，在进行转染或转化获得宿主细胞，最后再经过重组表达得到抗体，相较于传统的先获得杂交瘤细
胞，再进行腹水制备得到抗体，本方法采用重组表达载体制备抗体，优势在于不需要牺牲大
量的动物，重组抗体表达载体保存稳定性更高，且很容易放大生产，制备出大量抗体。

[0024] （3）采用兔作为免疫动物，由于兔的脾脏大，基因多样性高，在小分子的抗原呈递上有独特优势，为后续进行阳性克隆筛选时，更容易筛选出更优的阳性克隆；采用单个B细
胞培养后再筛选，提高了筛选效率，且成本更低，操作更加简便。

附图说明

[0025] 图1为实施例2的ELASA检测结果；

[0026] 图2为实施例2的DB实验结果；

[0027] 图3为实施例4抗体富集实验的q‑PCR检测结果；

[0028] 图4为实施例5抗体对紫外损伤DNA细胞样本中的IF检测结果；

[0029] 图5为对比例1抗体对紫外损伤DNA细胞样本中的IF检测结果。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

[0031] 以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有
实施例，都属于本发明的保护范围。

[0032] 在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的
常规手段。

[0033] 实施例1

[0034] 本发明提供一种由m6A半抗原合成抗原的方法，具体操作步骤如下：

[0035] 1、称量m6A小分子 40mg，加入一个50ml的试管中，然后逐滴加入0.1M NaIO4溶液，直至5ml，边加边摇，室温反应30分钟。再加1ml乙二醇中和过量的NaIO4，室温反应5min。

[0036] 2、取浓度6.15mg/ml的KLH载体蛋白（Merck，货号：374805）10ml，加入一支新的50ml试管中，用2M的K2CO3溶液调pH值至pH 9.0~9.5之间。

[0037] 3、然后将步骤2中的载体蛋白缓慢加入步骤1的溶液中，反应45min。期间用5%的K2CO3溶液调pH值，使pH维持在9~9.5之间。

[0038] 4、称量37.5mg NaBH4溶于2.5ml水中，逐滴加入步骤3中的反应液中，边加边摇，然后室温反应18小时。

[0039] 5、将10%（v/v）的甲酸溶液逐滴加入步骤4的反应液中，边加边摇，调pH值至6.0‑6.5，室温反应1小时。

[0040] 6、用NH4OH或NaOH溶液将步骤5产物调pH值至8.5，然后在4℃透析用0.05M的Tris‑HCl(pH8.0)透析36h，即获取所需完全抗原。

[0041] 实施例2

[0042] 本实施例提供利用实施例1合成的抗原免疫动物及阳性克隆筛选的方法，具体步骤如下：

[0043] 1、对兔子背部和腹部多点注射（首免每只兔子750ug抗原，之后每只兔子350ug抗原），每隔2周进行重复免疫，重复3次，本实施例所用兔子为新西兰大白兔，首次免疫用完全
佐剂（Sigma，货号：F5881），之后的免疫用不完全佐剂（北京博奥龙，货号：KX0210047Q‑10）。

[0044] 2、免疫结束后1周，取兔血清进行ELASA进行多抗检测，合成如下引物：

[0045] M6A‑1：m6A‑CUGGUAACGAAUGGCUG‑Biotin

[0046] M6A‑2：A‑CUGGUAACGAAUGGCUG‑Biotin

[0047] M6A‑3：AAAAAAAAAAAAA‑Biotin

[0048] M6A‑1引物是正对照，含有m6A修饰的RNA，另外两条是负对照。

[0049] 用链霉亲和素铺板，然后孵育这三条引物，进行ELISA验证实验，选取四只特异性强的兔子抗血清，分别标记为AB1、AB2、AB3及AB4，ELASA结果如图1所示，可见4只兔子均能
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特异性识别mA修饰的引物。

[0050] 用200ug免疫原就皮下多点注射，加强免疫一次，然后提取四只兔子的血清抗体，抗血清编号为105（与AB1对应）、106（与AB2对应）、107（与AB3对应）、108（与AB4对应）与市售
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mA抗体进行DB实验，结果如图2所示，结果显示，本实施例的多抗效价明显优于市售mA（购
于SYSY公司）抗体。特别是编号107血清对应的兔子，效价最高，后续用该兔子进行单抗制
备。

[0051] 3、三天后取脾脏牺牲兔子，分离脾脏中的淋巴细胞，用FITC标记的m6A对B淋巴细胞进行荧光标记，用流式细胞仪富集这类细胞，然后将细胞分选到96孔板中，一孔一个细
胞。

[0052] 4、对细胞进行培养，10 14天后取细胞上清进行ELISA验证。筛选出抗体效价高，特~
异性好的孔作为阳性孔。

[0053] 实施例3

[0054] 本实施例提供将实施例2筛选的B细胞进行抗体表达及纯化的方法，具体操作步骤如下：

[0055] 1、阳性克隆的细胞收集裂解后，采用常规方法提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，重链扩增引物如SEQ.NO.13 SEQ.NO.14所示。
~

[0056] 轻链扩增引物如SEQ.NO.15 SEQ.NO.16所示。~

[0057] SEQ.NO.15中，Y是C或者T；SEQ.NO.16，R为G或者A)。PCR反应体系为：95℃2min  ,然后按下列条件进行25个循环反应，95℃1min，56℃1min，72℃0.5min；最后95℃10min。

[0058] 天然配对的兔单克隆抗体重轻链基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列，重链可变区的基因序列如SEQ.NO.9所示，对应的氨基酸序列如
SEQ.NO.7所示；轻链可变区的基因序列如SEQ.NO.10所示，对应的氨基酸序列如SEQ.NO.8所
示；编码重链的基因序列如SEQ.NO.11所示，对应的氨基酸序列如SEQ.NO.17所示；编码轻链
的基因序列如SEQ.NO.12所示，对应的氨基酸序列如SEQ.NO.18所示。

[0059] 2、将抗体重链和轻链的基因分别用同源重组的方式连接至到pcDNA3.1载体（购自invitrogen）中，无内毒素质粒提取后共转染CHO(武汉大学细胞典藏中心）细胞，转染72‑96
小时后，离心除去细胞，收集细胞上清。

[0060] 3、用Protein A亲和凝胶树脂对细胞表达的上清进行纯化，即为所得抗体。

[0061] 实施例4

[0062] 将实施例3制备的抗体进行植物m6A修饰的RNA的富集能力检测，其操作步骤如下：

[0063] （1）取相同重量的拟南芥根、茎、叶，用剪刀剪碎后，加液氮速冻后碾磨均匀后，用常规Trizol法提取RNA，然后用化学法将RNA片段化，片段大小约100nt。

[0064] （2）将步骤(1)中片段化的RNA与实施例3制备的抗体进行孵育，富集m6A修饰的RNA，IgG抗体富集后的RNA作为对照。富集后的m6A修饰的RNA进行富集效果评估实验，检测
结果如图3所示，结果显示，相较于IgG抗体，本发明制备的单克隆抗体对于m6A修饰的RNA有
更优的富集能力。

[0065] 实施例5

[0066] 本实施例提供实施例3制备的对紫外损伤DNA细胞样本的检测，其具体操作如下：

[0067] 细胞系：U2OS(武汉大学细胞典藏中心）

[0068] 1、状态好的U2OS细胞铺24孔板，加BrdU（终浓度10uM/L），培养24‑48小时。

[0069] 2、吸出培养基，在超净台打开盖子，打开紫外线照射细胞30秒，再把原来的培养基加上，37℃下培养0、1、2、3、6、8、10、12分钟。

[0070] 3、吸取去掉培养基，固定细胞。后续步骤同常规IF（其中m6A抗体浓度1mg/ml，抗体6
稀释倍数1:1500）实验操作一样，测试结果如图4所示，4a为培养0min 的mA修饰的RNA的情
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况，4b为培养1min的m A修饰的RNA的情况，4c为培养2min的m A修饰的RNA的情况，4d为培养
6 6 6
3min的m A修饰的RNA的情况，4e为培养6min的m A修饰的RNA的情况，4f为培养8min的mA修
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饰的RNA的情况，4g为培养10min的m A修饰的RNA的情况，4h为培养12min的m A修饰的RNA的
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情况，结果显示，紫外照射后，mA修饰的RNA含量增加，随着修复时间的延长，m A修饰的含量
6
逐渐下降，而本发明的抗体很好的反应了mA修饰的RNA在DNA损伤修复过程中的调控作用。

[0071] 对比例1

[0072] 在实施例2中的步骤（4）中，除筛选出制备实施例3的阳性克隆细胞外，还筛选出了一组阳性克隆细胞。

[0073] 按实施例3的方法制备出另外一组单克隆抗体，制备方法中涉及的引物按常规方法进行设计。最终获得的抗体的重链CDR1序列、CDR2序列、CDR3序列，轻链CDR1序列、CDR2序
列、CDR3序列如表1所示。

[0074] 表1 对比例1抗体序列

[0075]

[0076] 将上述抗体按实施例5操作，抗体浓度1mg/ml，进行1:1000稀释，进行紫外损伤DNA6
细胞样本的IF检测，检测结果如图5所示，5a为培养0min 的mA修饰的RNA的情况，5b为培养
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1min的m A修饰的RNA的情况，5c为培养2min的m A修饰的RNA的情况，5d为培养3min的mA修
6 6
饰的RNA的情况，5e为培养6min的m A修饰的RNA的情况，5f为培养8min的m A修饰的RNA的情
6 6
况，5g为培养10min的m A修饰的RNA的情况5h为培养12min的mA修饰的RNA的情况。可以看
出，本发明单克隆抗体其抗体效价优于对比例1效价，均可以进行IF实验。

[0077] 在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并
非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替
换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。