一种编辑基因融合的方法转让专利
申请号 : CN202111280023.9
文献号 : CN113717991B
文献日 : 2022-02-01
发明人 : 李菁华 , 修毓雯 , 耿汇津 , 刘楚新 , 涂英美 , 许滢琳
申请人 : 菁良基因科技(深圳)有限公司
摘要 :
本发明提供了一种融合基因的编辑方法，其特征在于，所述的编辑方法中包括：（1）在参与融合的两个基因的天然断点附近各设计一条sgRNA；（2）设计一个重组AAV载体使两处断裂的DNA发生同源重组修复。利用该方法能够保证无论天然断点是在外显子内部、外显子边界或内含子区域，得到的融合基因的序列均与天然的序列完全一致，克服了现有方法断点序列不准确的问题。
权利要求 :
1.一种融合基因的编辑方法，其特征在于，所述的编辑方法中包括：（1）在参与融合的两个基因的天然断点附近各设计一条sgRNA；
（2）设计一个重组AAV载体使两处断裂的DNA发生同源重组修复；
所述的sgRNA在基因天然断点上游或下游的100 bp以内的区域，所述的天然断点在外显子内部、外显子边界或内含子区域；
所述的两个基因为基因A和基因B，所述的重组AAV载体包含两个结构区：Ⅰ区为同源左臂，起始于基因A天然断点上游的100‑1000 bp区域，终止于基因A的天然断点；
Ⅱ区为同源右臂，起始于基因B的天然断点，包含其下游的100‑1000 bp区域；
所述的融合基因为融合基因 COSF571，所述的sgRNA为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，所述的重组AAV载体Ⅰ区选自：SEQ ID NO.4，所述的重组AAV载体Ⅱ区选自：SEQ ID NO.5；
或者，所述的融合基因为融合基因 ROR1‑DNAJC6 ，所述的sgRNA为SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16，所述的重组AAV载体Ⅰ区选自：SEQ ID NO.17，所述的重组AAV载体Ⅱ区选自：SEQ ID NO.18；
或者，所述的融合基因为融合基因COSF1347，sgRNA为SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21，所述的重组AAV载体Ⅰ区选自：SEQ ID NO.22，所述的重组AAV载体Ⅱ区选自：SEQ ID NO.23。
2.根据权利要求1所述融合基因的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）相关sgRNA的设计，重组AAV载体的制备；
（2）sgRNA转染细胞和重组AAV感染细胞；
（3）融合基因mRNA的检测。
3.根据权利要求2所述的编辑方法，其特征在于，所述的步骤（2）包括：将两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合，采用电穿孔的方法转染细胞；电穿孔结束后，使用重组AAV感染细胞。
4.根据权利要求3所述的编辑方法，其特征在于，所述的两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合质量比例为1：3；重组AAV的感染复数为100000。
5.用于检测权利要求1中所述融合基因的试剂在制备诊断肿瘤的药物和/或试剂盒中的应用。
说明书 :
一种编辑基因融合的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子技术领域，具体涉及一种编辑基因融合的方法。
背景技术
[0002] 融合基因（Fusion gene）是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程，可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒位所致的结果。其中，染色体易位
是形成融合基因的一种重要方式，其主要产生原因是DNA双链断裂或两个相邻的DNA单链断
裂被错误修复，造成染色体片段位置改变。融合基因可通过两种机制产生致瘤作用：一种是
在其中一个断点处过度表达一个基因，另一种是通过两个基因的融合产生杂交基因。目前
已有超过300个融合基因在各种血液瘤和实体瘤中被发现，且有大量证据表明染色体易位
引起的基因融合是肿瘤发生的关键驱动因素。因此，关于融合基因及其特定易位断点的研
究对于了解癌症的发病机制和临床表型、确定预后指标、监测复发状况至关重要。
是形成融合基因的一种重要方式，其主要产生原因是DNA双链断裂或两个相邻的DNA单链断
裂被错误修复，造成染色体片段位置改变。融合基因可通过两种机制产生致瘤作用：一种是
在其中一个断点处过度表达一个基因，另一种是通过两个基因的融合产生杂交基因。目前
已有超过300个融合基因在各种血液瘤和实体瘤中被发现，且有大量证据表明染色体易位
引起的基因融合是肿瘤发生的关键驱动因素。因此，关于融合基因及其特定易位断点的研
究对于了解癌症的发病机制和临床表型、确定预后指标、监测复发状况至关重要。
[0003] 目前针对染色体易位导致的融合基因的表达研究主要通过以下三种方式：（1）在常规细胞系中异位表达融合基因；（2）在肿瘤细胞中沉默融合基因；（3）直接研究病人来源
的细胞系。但是以上方式均存在各自的问题：（1）融合基因的表达非生理水平；（2）融合基因
不能保证完全沉默；（3）病人来源的细胞系并不能再现体内癌症发展的最初阶段。因此，以
上方式均具有局限性。
的细胞系。但是以上方式均存在各自的问题：（1）融合基因的表达非生理水平；（2）融合基因
不能保证完全沉默；（3）病人来源的细胞系并不能再现体内癌症发展的最初阶段。因此，以
上方式均具有局限性。
[0004] 为了研究特定易位在肿瘤发生中的作用，并开发针对这些恶性肿瘤的疗法，必须有一种可行的方法——在细胞培养系统中准确诱导染色体易位。在早期构建的模型中，DNA
双链断裂的产生是通过在两个基因组位点引入I‑SceI内切酶酶切位点，并且过表达I‑
SceI，然后用预先引入的标记片段选择染色体易位。其后，可编程核酸酶的发展，使得构建
染色体易位不再需要事先修饰并裂解内源性位点。ZFNs（Zinc finger nucleases）和
TALENs（Transcription activator‑like effector nucleases）核酸酶已被用于在哺乳动
物细胞中构建染色体易位。在近期的研究中，CRISPR‑Cas9（Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats‑CRISPR‑associated endonuclease 9）的发
现，进一步简化了在目标基因组位点引入DNA双链断裂的过程。人们利用这些不同的可编程
核酸酶，已经在人类细胞系中构建了一系列的致瘤融合基因，包括EWSR1‑FLI1（ZFNs，
CRISPR‑Cas9），NPM1‑ALK（TALENs，CRISPR‑Cas9），EML4‑ALK（CRISPR‑Cas9），以及CD74‑ROS1
（CRISPR‑Cas9）等。比如基于CRISPR/Cas9技术诱导的基因融合，其设计原理为：在两个融合
基因的断点（基因天然融合过程中，DNA自发的断裂处，下文称“天然断点”）附近各设计一条
sgRNA，同时造成两处DNA双链的断裂（sgRNA引导Cas9对DNA剪切形成的断裂点，下文称“剪
切位点”），随后DNA通过非同源末端连接（Non‑homologous End Joining，NHEJ）修复，或在
同源重组模板的引导下进行同源重组（Homologous recombination，HR）修复。基于非同源
末端连接的方法，DNA会通过随机连接的方式对断开的DNA进行修复，并在连接处造成碱基
的插入/缺失。相较于非同源末端连接，同源重组的方法通常引入抗性筛选的过程，使得编
辑效率提高。但是，已经报道的同源重组中用到的重组载体，一般包含同源左臂和同源右臂
（如图1）：同源左臂对应于上游基因上Cas9剪切位点的一段上游序列，终止于Cas9在该基因
上的剪切位点；同源右臂起始于Cas9在下游基因上的剪切位点，并与该基因上剪切位点的
一段下游序列同源。其中，Cas9在上游基因和下游基因上的剪切位点由设计的sgRNA序列决
定，而在sgRNA设计时，由于受到序列本身的限制，如PAM序列的需求、避免重复序列等，无法
保证在准确的天然断点位置能够找到合适的sgRNA，即无法保证sgRNA能够准确地引导Cas9
在真实的断点处将DNA切断，进而导致同源臂序列与天然断点序列不一致。因此，在已报道
的同源重组质粒为模板进行重组修复时，无法保证天然断点序列的准确性，断裂的DNA经过
修复后与真实的基因并不相同。如图2所示，Fabio等在诱导EWSR1基因与WT1基因融合时，采
用了图1中的方法，得到的融合基因，在两个融合的基因之间，插入了LoxP序列。
双链断裂的产生是通过在两个基因组位点引入I‑SceI内切酶酶切位点，并且过表达I‑
SceI，然后用预先引入的标记片段选择染色体易位。其后，可编程核酸酶的发展，使得构建
染色体易位不再需要事先修饰并裂解内源性位点。ZFNs（Zinc finger nucleases）和
TALENs（Transcription activator‑like effector nucleases）核酸酶已被用于在哺乳动
物细胞中构建染色体易位。在近期的研究中，CRISPR‑Cas9（Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats‑CRISPR‑associated endonuclease 9）的发
现，进一步简化了在目标基因组位点引入DNA双链断裂的过程。人们利用这些不同的可编程
核酸酶，已经在人类细胞系中构建了一系列的致瘤融合基因，包括EWSR1‑FLI1（ZFNs，
CRISPR‑Cas9），NPM1‑ALK（TALENs，CRISPR‑Cas9），EML4‑ALK（CRISPR‑Cas9），以及CD74‑ROS1
（CRISPR‑Cas9）等。比如基于CRISPR/Cas9技术诱导的基因融合，其设计原理为：在两个融合
基因的断点（基因天然融合过程中，DNA自发的断裂处，下文称“天然断点”）附近各设计一条
sgRNA，同时造成两处DNA双链的断裂（sgRNA引导Cas9对DNA剪切形成的断裂点，下文称“剪
切位点”），随后DNA通过非同源末端连接（Non‑homologous End Joining，NHEJ）修复，或在
同源重组模板的引导下进行同源重组（Homologous recombination，HR）修复。基于非同源
末端连接的方法，DNA会通过随机连接的方式对断开的DNA进行修复，并在连接处造成碱基
的插入/缺失。相较于非同源末端连接，同源重组的方法通常引入抗性筛选的过程，使得编
辑效率提高。但是，已经报道的同源重组中用到的重组载体，一般包含同源左臂和同源右臂
（如图1）：同源左臂对应于上游基因上Cas9剪切位点的一段上游序列，终止于Cas9在该基因
上的剪切位点；同源右臂起始于Cas9在下游基因上的剪切位点，并与该基因上剪切位点的
一段下游序列同源。其中，Cas9在上游基因和下游基因上的剪切位点由设计的sgRNA序列决
定，而在sgRNA设计时，由于受到序列本身的限制，如PAM序列的需求、避免重复序列等，无法
保证在准确的天然断点位置能够找到合适的sgRNA，即无法保证sgRNA能够准确地引导Cas9
在真实的断点处将DNA切断，进而导致同源臂序列与天然断点序列不一致。因此，在已报道
的同源重组质粒为模板进行重组修复时，无法保证天然断点序列的准确性，断裂的DNA经过
修复后与真实的基因并不相同。如图2所示，Fabio等在诱导EWSR1基因与WT1基因融合时，采
用了图1中的方法，得到的融合基因，在两个融合的基因之间，插入了LoxP序列。
[0005] 总而言之，无论是通过基于非同源末端连接还是同源重组的方式，诱导形成的染色体易位，未能准确地在天然断点处进行基因融合，或是在天然断点连接处出现DNA缺失或
插入的现象。这种不准确的断点，对于融合基因功能的发挥存在潜在的影响，尤其是外显子
之间的融合，如COSF571（ETV6基因第5外显子与NTRK3基因第15外显子之间的融合）、
COSF1434（FGFR3基因第17外显子与TACC3基因第10外显子之间的融合）等，断点处的不准确
连接，在翻译的过程中，会造成开放阅读框的破坏或因移码突变使得翻译提前终止，最终无
法形成有功能的蛋白；同时，不准确的断点，也不利于临床上分子诊断检测性能的评估。目
前，文献中尚无能够对融合基因断点进行准确编辑的方法。
插入的现象。这种不准确的断点，对于融合基因功能的发挥存在潜在的影响，尤其是外显子
之间的融合，如COSF571（ETV6基因第5外显子与NTRK3基因第15外显子之间的融合）、
COSF1434（FGFR3基因第17外显子与TACC3基因第10外显子之间的融合）等，断点处的不准确
连接，在翻译的过程中，会造成开放阅读框的破坏或因移码突变使得翻译提前终止，最终无
法形成有功能的蛋白；同时，不准确的断点，也不利于临床上分子诊断检测性能的评估。目
前，文献中尚无能够对融合基因断点进行准确编辑的方法。
发明内容
[0006] 鉴于携带染色体易位的细胞系是研究发病机理、开发治疗策略及检测性能评估的重要模型，针对现有方法的不足，本发明提出了一种准确构建基因融合细胞系的新方法。
[0007] 本发明提供了一种精确诱导基因融合的方法，使得融合基因的序列与天然序列完全相同。该方法在CRISPR/Cas9的基础上，分别在参与融合的两个基因（基因A和基因B）的天
然断点附近各设计一条sgRNA，分别为sgRNA1与sgRNA2，同时，设计一个重组AAV载体。该方
法利用sgRNA1与sgRNA2引导Cas9蛋白在基因A与基因B上的剪切，同时造成两处DNA的断裂。
在重组AAV载体存在的情况下，两处断裂的DNA发生同源重组修复，以此将天然断点准确引
入。
然断点附近各设计一条sgRNA，分别为sgRNA1与sgRNA2，同时，设计一个重组AAV载体。该方
法利用sgRNA1与sgRNA2引导Cas9蛋白在基因A与基因B上的剪切，同时造成两处DNA的断裂。
在重组AAV载体存在的情况下，两处断裂的DNA发生同源重组修复，以此将天然断点准确引
入。
[0008] 本发明中AAV载体指重组腺相关病毒载体。
[0009] 一方面，本发明提供了一种融合基因的编辑方法。
[0010] 所述的编辑方法中包括：（1）在参与融合的两个基因（基因A和基因B）的天然断点附近各设计一条sgRNA，分别为sgRNA1与sgRNA2；（2）设计一个重组AAV载体作为修复模板使
两处断裂的DNA发生同源重组修复。
两处断裂的DNA发生同源重组修复。
[0011] 具体地，所述的天然断点在外显子内部、外显子边界或内含子区域。
[0012] 具体地，所述的sgRNA在基因天然断点上游或下游的100 bp以内的区域，即，所述的sgRNA1在基因A天然断点上游或下游的100 bp以内的区域；所述的sgRNA2在基因B天然断
点上游或下游的100 bp以内的区域。
点上游或下游的100 bp以内的区域。
[0013] 优选地，所述的sgRNA1选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.20。
[0014] 优选地，所述的sgRNA2选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.21。
[0015] 具体地，所述的同源重组AAV载体包含两个结构区。
[0016] 进一步具体地，所述的两个结构区如下：
[0017] Ⅰ区为同源左臂，起始于基因A天然断点上游的100‑1000 bp区域，终止于基因A的天然断点；Ⅱ区，同源右臂，起始于基因B的天然断点，包含其下游的100‑1000 bp区域。
[0018] 优选地，所述的同源重组AAV载体Ⅰ区选自：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.22。
[0019] 优选地，所述的同源重组AAV载体Ⅱ区选自：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23。
[0020] 具体地，所述的融合基因的编辑方法包括以下步骤：
[0021] （1）相关sgRNA的设计，AAV载体的制备；
[0022] （2）sgRNA转染细胞和重组AAV载体感染细胞；
[0023] （3）融合基因mRNA的检测。
[0024] 进一步具体地，所述的步骤（2）包括：将两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合，采用电穿孔的方法转染细胞。电穿孔结束后，使用重组AAV感染细胞。
[0025] 优选地，所述的两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合比例为1：3（质量比）。重组AAV的感染复数（AAV病毒基因组拷贝数与细胞数量的比值）为100000。
[0026] 优选地，所述的融合基因为融合基因COSF571，为ETV6基因（ENST00000396373.8）第5外显子与NTRK3基因（ENST00000394480.6）第15外显子之间的融合；针对ETV6基因的
sgRNA1为SEQ ID NO.2，针对NTRK3基因的sgRNA2：SEQ ID NO.3；重组AAV载体Ⅰ区的序列为
SEQ ID NO.4；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.5。
sgRNA1为SEQ ID NO.2，针对NTRK3基因的sgRNA2：SEQ ID NO.3；重组AAV载体Ⅰ区的序列为
SEQ ID NO.4；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.5。
[0027] 优选地，所述的融合基因为融合基因ROR1‑DNAJC6，为ROR1基因（ENST00000371079.6）第9外显子部分区域与DNAJC6基因（ENST00000371069.5）第1内含子
之间的融合；针对ROR1基因的sgRNA1为SEQ ID NO.15；针对DNAJC6基因sgRNA2为SEQ ID
NO.16；重组AAV载体Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.17，Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.18。
之间的融合；针对ROR1基因的sgRNA1为SEQ ID NO.15；针对DNAJC6基因sgRNA2为SEQ ID
NO.16；重组AAV载体Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.17，Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.18。
[0028] 优选地，所述的融合基因为融合基因COSF1347，为FGFR3基因（ENST00000440486.8）第17内含子与BAIAP2L1基因（ENST00000005260.9）第1内含子之间的
融合；针对FGFR3基因的sgRNA1为SEQ ID NO.20；针对BAIAP2L1基因的sgRNA2为SEQ ID
NO.21；重组AAV载体Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.22；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.23。
融合；针对FGFR3基因的sgRNA1为SEQ ID NO.20；针对BAIAP2L1基因的sgRNA2为SEQ ID
NO.21；重组AAV载体Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.22；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.23。
[0029] 另一方面，本发明提供了一种融合基因。
[0030] 所述的融合基因通过前述的编辑方法制备。
[0031] 优选地，所述的融合基因为融合基因COSF571，为ETV6基因（ENST00000396373.8）第5外显子与NTRK3基因（ENST00000394480.6）第15外显子之间的融合；针对ETV6基因的
sgRNA1为SEQ ID NO.2，针对NTRK3基因的sgRNA2为SEQ ID NO.3；重组AAV载体Ⅰ区的序列为
SEQ ID NO.4；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.5。
sgRNA1为SEQ ID NO.2，针对NTRK3基因的sgRNA2为SEQ ID NO.3；重组AAV载体Ⅰ区的序列为
SEQ ID NO.4；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.5。
[0032] 优选地，所述的融合基因为融合基因ROR1‑DNAJC6，为ROR1基因（ENST00000371079.6）第9外显子部分区域与DNAJC6基因（ENST00000371069.5）第1内含子
之间的融合；针对ROR1基因的sgRNA1为SEQ ID NO.15；针对DNAJC6基因sgRNA2为SEQ ID
NO.16；重组AAV载体Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.17，Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.18。
之间的融合；针对ROR1基因的sgRNA1为SEQ ID NO.15；针对DNAJC6基因sgRNA2为SEQ ID
NO.16；重组AAV载体Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.17，Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.18。
[0033] 优选地，所述的融合基因为融合基因COSF1347，为FGFR3基因（ENST00000440486.8）第17内含子与BAIAP2L1基因（ENST00000005260.9）第1内含子之间的
融合；针对FGFR3基因的sgRNA1为SEQ ID NO.20；针对BAIAP2L1基因的sgRNA2为SEQ ID
NO.21；重组AAV载体Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.22；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.23。
融合；针对FGFR3基因的sgRNA1为SEQ ID NO.20；针对BAIAP2L1基因的sgRNA2为SEQ ID
NO.21；重组AAV载体Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.22；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.23。
[0034] 再一方面，本发明提供了一种细胞。
[0035] 所述的细胞中包括前述的表达载体。
[0036] 所述的细胞包括但不限于：人类细胞、动物细胞。
[0037] 所述的细胞包括但不限于：CHO细胞。
[0038] 本发明的有益效果：
[0039] 本发明提供了一种编辑基因融合的方法，涉及成对的sgRNA的设计及同源重组AAV载体的设计，尤其是重组AAV载体中包含的两个结构区域的设计，对于该方法的成功实施至
关重要。其中，结构域Ⅰ区为同源左臂，起始于上游基因天然断点上游的100‑1000 bp区域，
终止于上游基因的天然断点；Ⅱ区为同源右臂，起始于下游基因的天然断点，包含天然断点
下游的100‑1000 bp区域。利用该方法得到的融合基因，能够保证融合基因的序列与天然的
序列完全一致，克服了现有方法断点序列不准确的问题，以此满足基因融合研究的需求。同
时，本方法利用AAV载体作为同源重组修复的模板，提高了同源重组修复的成功率，不需要
使用筛选标记，避免在断点位置引入LoxP序列。
关重要。其中，结构域Ⅰ区为同源左臂，起始于上游基因天然断点上游的100‑1000 bp区域，
终止于上游基因的天然断点；Ⅱ区为同源右臂，起始于下游基因的天然断点，包含天然断点
下游的100‑1000 bp区域。利用该方法得到的融合基因，能够保证融合基因的序列与天然的
序列完全一致，克服了现有方法断点序列不准确的问题，以此满足基因融合研究的需求。同
时，本方法利用AAV载体作为同源重组修复的模板，提高了同源重组修复的成功率，不需要
使用筛选标记，避免在断点位置引入LoxP序列。
[0040] 利用本发明中的方法，进行基因融合的编辑，天然断点无论是在外显子内部、外显子边界或是内含子区域，均能得到序列准确的融合基因。
附图说明
[0041] 图1为基于同源重组方法构建融合基因示意图。
[0042] 图2为同源重组方法构建融合基因效果图。
[0043] 图3为实施例1编辑方法示意图。
[0044] 图4为正确细胞克隆中ETV6基因5号外显子与NTRK3基因15号外显子DNA水平融合的Sanger测序结果。
[0045] 图5为正确细胞克隆中ETV6基因5号外显子与NTRK3基因15号外显子RNA水平融合的Sanger测序结果。
[0046] 图6为实施例2编辑方法示意图。
[0047] 图7为正确细胞克隆中ROR1基因第9外显子与DNAJC6基因第1内含子融合的DNA水平Sanger测序结果。
[0048] 图8为正确细胞克隆中ROR1基因第9外显子与DNAJC6基因第1内含子融合的RNA水平Sanger测序结果。
[0049] 图9为实施例3编辑方法示意图。
[0050] 图10为正确细胞克隆中FGFR3基因第17内含子与BAIAP2L1基因第1内含子融合的DNA水平Sanger测序结果。
[0051] 图11为正确细胞克隆中FGFR3基因第17内含子与BAIAP2L1基因第1内含子融合的RNA水平Sanger测序结果。
具体实施方式
[0052] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明
具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊
说明，均可从商业途径得到。
具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊
说明，均可从商业途径得到。
[0053] 实施例1融合基因COSF571的编辑
[0054] COSF571为ETV6基因（ENST00000396373.8）第5外显子与NTRK3基因（ENST00000394480.6）第15外显子之间的融合，分别选取天然断点处上下游各200 bp的序
列进行展示，序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
列进行展示，序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
[0055] CAGCCCCATCATGCACCCTCTGATCCTGAACCCCCGGCACTCCGTGGATTTCAAACAGTCCAGGCTCTCCGAGGACGGGCTGCATAGGGAAGGGAAGCCCATCAACCTCTCTCATCGGGAAGACCTGGCTTACATGAACCACAT
CATGGTCTCTGTCTCCCCGCCTGAAGAGCACGCCATGCCCATTGGGAGAATAGCAG//ATGTGCAGCACATTAAGA
GGAGAGACATCGTGCTGAAGCGAGAACTGGGTGAGGGAGCCTTTGGAAAGGTCTTCCTGGCCGAGTGCTACAACCT
CAGCCCGACCAAGGACAAGATGCTTGTGGCTGTGAAGgtaaaccccagaggcatgccggcaccaggaggagggctg
gctgagggcccagggagggaaggaagaggc
CATGGTCTCTGTCTCCCCGCCTGAAGAGCACGCCATGCCCATTGGGAGAATAGCAG//ATGTGCAGCACATTAAGA
GGAGAGACATCGTGCTGAAGCGAGAACTGGGTGAGGGAGCCTTTGGAAAGGTCTTCCTGGCCGAGTGCTACAACCT
CAGCCCGACCAAGGACAAGATGCTTGTGGCTGTGAAGgtaaaccccagaggcatgccggcaccaggaggagggctg
gctgagggcccagggagggaaggaagaggc
[0056] 其中，斜体部分为ETV6基因序列；下划线部分为NTRK3基因序列，“//”为融合基因的天然断点位置，NTRK3基因序列中大写字母为外显子，小写字母为内含子。
[0057] 本实施例编辑方法示意图如图3所示，具体包括以下步骤：
[0058] 1、相关sgRNA及重组载体的设计
[0059] （1）参照图3，针对上游基因ETV6的sgRNA与针对下游基因NTRK3的sgRNA，分别在两个基因天然断点上游或下游的100bp以内的区域。
[0060] 针对ETV6基因和NTRK3基因分别设计两条sgRNA，分别为：
[0061] 针对ETV6基因的sgRNA1：SEQ ID NO.2；
[0062] 针对NTRK3基因的sgRNA2：SEQ ID NO.3；
[0063] 上述sgRNA通过化学合成的方法直接获得，本实施例的sgRNA 委托金斯瑞公司进行合成；
[0064] （2）参照图3要求：Ⅰ区，同源左臂，起始于ETV6天然断点上游的100‑1000 bp区域，终止于ETV6的天然断点；Ⅱ区，同源右臂，起始于NTRK3的天然断点，包含其下游的100‑1000
bp区域。其中，Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.4所示；Ⅱ区的序列如SEQ ID NO.5所示。
bp区域。其中，Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.4所示；Ⅱ区的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0065] 并且，为了方便后续的鉴定工作，按照图3设计相应的引物，如下所示：
[0066]引物名称 引物序列（5’‑3’）
F1 SEQ ID NO.6
F2 SEQ ID NO.7
R1 SEQ ID NO.8
R2 SEQ ID NO.9
Fa SEQ ID NO.10
Ra SEQ ID NO.11
Fb SEQ ID NO.12
Rb SEQ ID NO.13
F1 SEQ ID NO.6
F2 SEQ ID NO.7
R1 SEQ ID NO.8
R2 SEQ ID NO.9
Fa SEQ ID NO.10
Ra SEQ ID NO.11
Fb SEQ ID NO.12
Rb SEQ ID NO.13
[0067] 其中F1/R1目的扩增产物为Ⅰ区序列；
[0068] F2/R2目的扩增产物为融合基因天然断点序列；
[0069] Fa/Ra目的扩增产物为ETV6 mRNA序列；
[0070] Fb/Rb目的扩增产物为NTRK3 mRNA序列
[0071] 2、基因融合的编辑
[0072] （1）重组AAV载体的制备。重组AAV载体的制备，按照如下步骤进行：a）根据重组载体的设计，通过如下方法构建重组AAV表达质粒：将载体上的I区与II区通过化学合成的方
法合成，经过XbaI/NdeI双酶切后，连接至pAAV‑CMV‑GFP‑WPRE质粒（云舟生物，中国）上。将
连接产品转化T1感受态细胞（购自全式金公司，中国），通过PCR的方法对细菌克隆进行鉴
定，从中挑选出连接正确的克隆。将正确的克隆进行扩大培养，并提取得到大量的高纯度质
粒。将1‑3μg的pAAV helper质粒（购自GeneMedi公司，中国）、1‑3μg的pAAV9 Rep‑Cap质粒
（购自GeneMedi公司，中国）和1‑3μg表达质粒分别加入到20μL的Lipofactamine 3000（购自
Life techonologies公司，美国）中，吹打混合均匀，混匀后室温静置10min；将试剂加入2×
6
10的HEK293T细胞中，继续进行细胞培养。b）转染72h，收集上清液，使用0.22μm的滤膜对上
清液进行过滤。c）AAV病毒的收集：在一支超速离心管中加入10mL 40%的蔗糖，紧接着将细
胞上清液加入到离心管中，于4℃进行超速离心（30000rpm，3h）。离心结束后，小心弃掉上清
液，用适量的PBS溶液重悬AAV病毒。将病毒溶液分装，长期保存时置于‑80℃冰箱。
法合成，经过XbaI/NdeI双酶切后，连接至pAAV‑CMV‑GFP‑WPRE质粒（云舟生物，中国）上。将
连接产品转化T1感受态细胞（购自全式金公司，中国），通过PCR的方法对细菌克隆进行鉴
定，从中挑选出连接正确的克隆。将正确的克隆进行扩大培养，并提取得到大量的高纯度质
粒。将1‑3μg的pAAV helper质粒（购自GeneMedi公司，中国）、1‑3μg的pAAV9 Rep‑Cap质粒
（购自GeneMedi公司，中国）和1‑3μg表达质粒分别加入到20μL的Lipofactamine 3000（购自
Life techonologies公司，美国）中，吹打混合均匀，混匀后室温静置10min；将试剂加入2×
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10的HEK293T细胞中，继续进行细胞培养。b）转染72h，收集上清液，使用0.22μm的滤膜对上
清液进行过滤。c）AAV病毒的收集：在一支超速离心管中加入10mL 40%的蔗糖，紧接着将细
胞上清液加入到离心管中，于4℃进行超速离心（30000rpm，3h）。离心结束后，小心弃掉上清
液，用适量的PBS溶液重悬AAV病毒。将病毒溶液分装，长期保存时置于‑80℃冰箱。
[0073] （2）将上述两条sgRNA分别与Cas9蛋白（购自Life technologies公司，货号为A36498）按照1：3（质量比）混合，室温放置10 min，分别组成核糖核蛋白复合物RNP1与RNP2。
6
将RNP1、RNP2及0.5×10 细胞混合，并采用电穿孔的方法进行转染，具体的转染条件为：420
V，30 ms。
6
将RNP1、RNP2及0.5×10 细胞混合，并采用电穿孔的方法进行转染，具体的转染条件为：420
V，30 ms。
[0074] （3）电穿孔结束后，将制备好的重组AAV病毒按照感染复数为100000与细胞进行混11
合，即0.5×10 拷贝重组AAV病毒加入到细胞中，培养24h。
合，即0.5×10 拷贝重组AAV病毒加入到细胞中，培养24h。
[0075] （4）将细胞进行单细胞克隆，具体如下：a)消化并收集细胞。b)按照倍比稀释的方法，对细胞准确计数，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞充分混匀。c)取10 mL细胞
悬液，均匀分到一块96孔板中，每孔0.1 mL。
悬液，均匀分到一块96孔板中，每孔0.1 mL。
[0076] （5）将细胞放至细胞培养箱中培养，待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，加入少量TrypLE Express 酶（10 μL，购自Life technologies公司，货号为12604021）消化细胞，
取部分细胞作为扩增模板，分别使用引物对F1/R1，F2/R2，对克隆进行扩增及Sanger测序验
证；剩余细胞扩大培养，备用。
取部分细胞作为扩增模板，分别使用引物对F1/R1，F2/R2，对克隆进行扩增及Sanger测序验
证；剩余细胞扩大培养，备用。
[0077] 如图4所示，筛选得到的正确细胞克隆，包含了ETV6基因与NTRK3基因准确的天然断点，与天然序列一致，且与图3设计的效果一致。
[0078] 3、融合基因mRNA的检测
[0079] 将步骤3中得到的克隆进行扩大培养，并提取细胞的RNA及反转录，以cDNA为模板采用引物Fa与Rb进行PCR扩增，目标扩增产物为融合基因mRNA序列，sanger测序检测融合基
因在RNA水平的融合是否准确。
因在RNA水平的融合是否准确。
[0080] 如图5所示，通过本发明提供的方法，能够将发生在外显子之间的断点准确连接，并保证DNA水平及RNA水平的序列准确无误。
[0081] 实施例2融合基因ROR1‑DNAJC6的编辑
[0082] ROR1‑DNAJC6为ROR1基因（ENST00000371079.6）第9外显子部分区域与DNAJC6基因（ENST00000371069.5）第1内含子之间的融合，分别选取天然断点处上下游各200 bp的序列
进行展示，序列如SEQ ID NO.14所示，具体如下：
进行展示，序列如SEQ ID NO.14所示，具体如下：
[0083] TCTCTTCTGATTCAGATATCTGGTCCTTTGGGGTTGTCTTGTGGGAGATTTTCAGTTTTGGACTCCAGCCATATTATGGATTCAGTAACCAGGAAGTGATTGAGATGGTGAGAAAACGGCAGCTCTTACCATGCTCTGAAGACT
GCCCACCCAGAATGTACAGCCTCATGACAGAGTGCTGGAATGAGATTCCTTCTAGG//aaacaacttcccaaggtt
gtacagcgattacagggtgaagctgccacctgtttatcttagtgcactggagcctgaggtcattgcccactcagtt
tgatgccagacagaccagagttgctcattaacacttcataaagccctctcatgttcctcataataaccagacattt
ctaattataacttgagcagcaaatgttgtt
GCCCACCCAGAATGTACAGCCTCATGACAGAGTGCTGGAATGAGATTCCTTCTAGG//aaacaacttcccaaggtt
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[0084] 序列中斜体部分为ROR1基因序列，下划线部分为DNAJC6基因序列，“//”为融合基因的天然断点位置，大写字母为外显子，小写字母为内含子。
[0085] 1、相关sgRNA及重组载体的设计
[0086] （1）参照图6的要求，具体为：针对上游基因ROR1的sgRNA与针对下游基因DNAJC6的sgRNA，分别在两个基因天然断点上游或下游的100bp以内的区域。
[0087] 针对这两个基因分别设计两条sgRNA，分别为：
[0088] 针对ROR1基因的sgRNA1：SEQ ID NO.15；
[0089] 针对DNAJC6基因sgRNA2：SEQ ID NO.16；
[0090] 上述sgRNA通过化学合成的方法直接获得，本实施例的sgRNA 委托金斯瑞公司进行合成。
[0091] （2）参照图6的要求：Ⅰ区，同源左臂，起始于ROR1天然断点上游的100‑1000 bp区域，终止于ROR1的天然断点；Ⅱ区，同源右臂，起始于DNAJC6的天然断点，包含其下游的100‑
1000 bp区域。
1000 bp区域。
[0092] 制备重组AAV载体，其中，Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.17，Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.18。
[0093] 2、基因融合的编辑参考实施例1。取鉴定正确的克隆，进行测序验证。
[0094] 图7为正确细胞克隆中ROR1基因第9外显子与DNAJC6基因第1内含子融合的DNA水平Sanger测序结果。
[0095] 3、融合基因mRNA表达的检测
[0096] 图8为正确细胞克隆中ROR1基因第9外显子与DNAJC6基因第1内含子融合的RNA水平Sanger测序结果。
[0097] 由图7和图8可知，按照本发明提供的方法，能够将外显子内部与内含子之间的断点准确连接起来，并保证DNA水平及RNA水平序列准确无误。
[0098] 实施例3融合基因COSF1347的编辑
[0099] COSF1347为FGFR3基因（ENST00000440486.8）第17内含子与BAIAP2L1基因（ENST00000005260.9）第1内含子之间的融合，分别选取天然断点处上下游各200 bp的序列
进行展示，序列如SEQ ID NO.19所示，具体如下：
进行展示，序列如SEQ ID NO.19所示，具体如下：
[0100] CTTCAAGCAGCTGGTGGAGGACCTGGACCGTGTCCTTACCGTGACGTCCACCGACgtgagtgctggctctggcctggtgccacccgcctatgcccctccccctgccgtccccggccatcctgccccccagagtgctgaggtgtg
gggcgggccttctggggcacagcctgggcacagaggtggctgtgcgaagaggggct//ctttccacctcggggttc
agaaggggactttacgcgggaaggtactttccctccctccagctcccctcccccgcgtccttccacctctcccggt
ctctcccactcctcccctggccctccacagcccctcttcttcctcccctggccctctccttcctcccagtccctcc
ccatcccctcccccctacttttcctcctcc
gggcgggccttctggggcacagcctgggcacagaggtggctgtgcgaagaggggct//ctttccacctcggggttc
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ctctcccactcctcccctggccctccacagcccctcttcttcctcccctggccctctccttcctcccagtccctcc
ccatcccctcccccctacttttcctcctcc
[0101] 序列中斜体部分为FGFR3基因序列，下划线部分为BAIAP2L1基因序列，“//”为融合基因的天然断点位置，大写字母为外显子，小写字母为内含子。
[0102] 1.相关sgRNA及重组载体的设计
[0103] （1）参照图9所述的要求，针对上游基因FGFR3的sgRNA与针对下游基因BAIAP2L1的sgRNA，分别在两个基因天然断点上游或下游的100bp以内的区域。
[0104] 针对这两个基因分别设计两条sgRNA，分别为：
[0105] 针对FGFR3基因的sgRNA1：SEQ ID NO.20；
[0106] 针对BAIAP2L1基因的sgRNA2：SEQ ID NO.21；
[0107] 上述sgRNA通过化学合成的方法直接获得，本实施例的sgRNA 委托金斯瑞公司进行合成。
[0108] （2）参照图9的要求：Ⅰ区，同源左臂，起始于FGFR3天然断点上游的100‑1000 bp区域，终止于FGFR3的天然断点；Ⅱ区，同源右臂，起始于BAIAP2L1的天然断点，包含其下游的
100‑1000 bp区域。
100‑1000 bp区域。
[0109] 制备重组AAV载体，其中，Ⅰ区的序列如SEQ ID NO.22；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.23。
[0110] 2、基因融合的编辑参考实施例1。取鉴定正确的克隆进行测序验证。
[0111] 图10为正确细胞克隆中FGFR3基因第17内含子与BAIAP2L1基因第1内含子融合的DNA水平Sanger测序结果。
[0112] 3、融合基因mRNA表达的检测
[0113] 图11为正确细胞克隆中FGFR3基因第17内含子与BAIAP2L1基因第1内含子融合的RNA水平Sanger测序结果。
[0114] 由图10和图11可知，按照本发明提供的方法，能够将内含子之间的断点准确连接起来，并保证DNA水平及RNA水平序列准确无误。