一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域，包括以下步骤：(1)红松胚性愈伤组织的继代培养；(2)农杆菌侵染液的制备：将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.4～0.6，即得侵染液，备用；(3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养；(4)抗性愈伤组织的筛选培养；(5)抗性体胚培养。该方法操作简单、周期短，遗传转化效率高。

权利要求

1.一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在24 28~℃暗培养9 18天，即得遗传转化的受体；

~

(2)农杆菌侵染液的制备：将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600=0.4~0.6，即得侵染液，备用；

(3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，然后接种至共培养培养基中，在23 27℃暗培养1 3d，即得共培养的胚性愈伤组~ ~织；

(4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10~

15d，连续筛选1 3次，获得抗性愈伤组织；

~

(5)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，24 27℃黑暗培养40~ ~

60d，获得抗性体胚；

所述继代培养基由如下浓度的组分组成：0.1 0.5mg/L 2,4‑D、0.05 0.1mg/L 6‑BA、~ ~

340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·7H2O、3.1mg/L H3BO3、

4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·2H2O、0.415mg/L KI、

0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·

7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、 0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；所述继代培养基的pH为5.9；

所述共培养培养基为在所述继代培养基的基础上添加20 60μmol/L乙酰丁香酮；

~

所述体胚诱导培养基由如下浓度的组分组成：80μmol/L ABA、950mg/L KNO3、825mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、925mg/L MgSO4·7H2O、31mg/L H3BO3、43mg/L ZnSO4·7H2O、21mg/L MnSO4·2H2O、1.25mg/L Na2MoO4·2H2O、4.15mg/L KI、0.5mg/L CuSO4·5H2O、0.13mg/L CoCl2·6H2O、28mg/L FeSO4·7H2O、37mg/L Na2‑EDTA、11mg/L CaCl2·2H2O、0.5mg/L Vitamin B5、0.1mg/L Vitamin B6、0.1mg/L Vitamin B1、20g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、12g/L结冷胶，2g/L活性炭；所述体胚诱导培养基的pH为5.8；

所述筛选培养基为在所述继代培养基的基础上添加10 50mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻~肟钠。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(4)之后，还包括抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织进行GUS染色和/或PCR检测，根据是否有蓝色显色反应和/或目的基因的条带，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因和/或目的基因的表达，若有GUS基因和/或目的基因的表达，表明红松遗传转化成功。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，在转入乙酰丁香酮溶液前，还包括将含有目的基因的农杆菌菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述农杆菌为农杆菌GV3101，乙酰丁香酮溶液的浓度为20 60μmol/L。

~

5.根据权利要求3所述的遗传转化方法，其特征在于，所述固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。

6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4。

说明书

一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法。

背景技术

[0002] 红松(Pinus koraiensis)作为阔叶红松林的优势种，是我国东北地区特有的珍贵用材和经济林树种，具有极高的经济和生态价值。但因大规模的开发利用，目前天然红松林基本消失殆尽，为了恢复和扩大红松资源，充分发挥红松的生态功能和经济价值，人工造林就显得极其重要。且由于红松基因组巨大、杂合度高、生长周期长，缺乏遗传转化系统，其发育调控机制的分子基础研究受到很大局限。

[0003] 目前以离体再生和遗传转化为基础的现代生物技术手段可以将外源基因导入针叶树基因组并使之稳定遗传，产生定向变异，实现大幅度遗传改良，缩短育种周期。将体细胞胚胎发生途径与遗传转化技术相结合，通过体胚发生途径能够将遗传转化过程中筛选的抗性愈伤组织进一步发育成体胚，经体胚萌发后获得完整的抗性植株，从理论上会比传统的器官外植体转化效率更高，获得的转化植株也会更纯合。因此，为了恢复红松资源、深入研究红林发育调控机制的分子基础，进行红松胚性愈伤组织遗传转化技术的开发和应用至关重要，但迄今为止，并未有关红松胚性愈伤组织的遗传转化方法的相关报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，该方法操作简便、周期短、转化效率高。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0007] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在24～28℃暗培养9～18天，即得遗传转化的受体；

[0008] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.4～0.6，即得侵染液，备用；

[0009] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，然后接种至共培养培养基中，在23～27℃暗培养1～3d，即得共培养的胚性愈伤组织；

[0010] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10～15d，连续筛选1～3次，获得抗性愈伤组织；

[0011] (5)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，24～27℃黑暗培养40～60d，获得抗性体胚。

[0012] 优选地，步骤(4)之后，还包括抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织分别进行GUS染色和/或PCR检测，根据是否有蓝色显色反应和/或目的基因的条带，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因和/或目的基因的表达，若有GUS基因和/或目的基因的表达，表明红松遗传转化成功。

[0013] 优选地，步骤(2)中，在转入乙酰丁香酮溶液前，还包括将含有目的基因的农杆菌菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体。

[0014] 优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101，乙酰丁香酮溶液的浓度为20～60μmol/L。

[0015] 优选地，所述继代培养基由如下浓度的组分组成：0.1～0.5mg/L 2,4‑D、0.05～0.1mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·7H2O、
3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·2H2O、
0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、
13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·
2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、
30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；所述继代培养基的pH为5.9。

[0016] 优选地，所述固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。

[0017] 优选地，所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4。

[0018] 优选地，所述共培养培养基为在所述继代培养基的基础上添加20～60μmol/L乙酰丁香酮。

[0019] 优选地，所述筛选培养基为在所述继代培养基的基础上添加10～50mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠。

[0020] 优选地，所述体胚诱导培养基由如下浓度的组分组成：80μmol/LABA、950mg/L KNO3、825mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、925mg/L MgSO4·7H2O、31mg/L H3BO3、43mg/L ZnSO4·7H2O、21mg/L MnSO4·2H2O、1.25mg/L Na2MoO4·2H2O、4.15mg/L KI、0.5mg/L CuSO4·5H2O、0.13mg/L CoCl2·6H2O、28mg/L FeSO4·7H2O、37mg/L Na2‑EDTA、11mg/L CaCl2·2H2O、0.5mg/L Vitamin B5、0.1mg/L Vitamin B6、0.1mg/L Vitamin B1、20g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、12g/L结冷胶，2g/L活性炭；所述体胚诱导培养基的pH为5.8。

[0021] 与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：

[0022] 本发明首次提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，将胚性愈伤组织增殖培养9～18天后得到遗传转化的受体，然后利用农杆菌介导将目的基因导入红松胚性愈伤组织，筛选培养，即能获得抗性愈伤组织，该方法操作简单、周期短，遗传转化效率高。

附图说明

[0023] 图1为红松野生型胚性愈伤组织GUS组织化学染色图；

[0024] 图2为实施例1红松抗性愈伤组织GUS组织化学染色图；

[0025] 图3为实施例1红松胚性愈伤组织继代10d后的示意图；

[0026] 图4为实施例2红松胚性愈伤组织继代15d后的示意图；

[0027] 图5为对比例1红松胚性愈伤组织继代20d后的示意图；

[0028] 图6为实施例3红松抗性体胚发生示意图；

[0029] 图7为实施例3红松抗性愈伤组织PCR电泳示意图，其中M为2000DNA marker；H为水(阴性对照)；N为野生型红松愈伤组织；P为农杆菌菌液(阳性对照)；1～8为抗性愈伤组织。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0031] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在24～28℃暗培养9～18天，即得遗传转化的受体；

[0032] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.4～0.6，即得侵染液，备用；

[0033] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，然后接种至共培养培养基中，在23～27℃暗培养1～3d，即得共培养的胚性愈伤组织；

[0034] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10～15d，连续筛选1～3次，获得抗性愈伤组织；

[0035] (5)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，24～27℃黑暗培养40～60d，获得抗性体胚。

[0036] 在本发明中，将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在24～28℃暗培养9～18天，即得遗传转化的受体。本发明采用红松的胚性愈伤组织具有培养周期短、体胚发生率高、成苗快的特点。所述继代培养基优选地由如下浓度的组分组成：0.1～0.5mg/L 2,4‑D、0.05～0.1mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·
7H2O、3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·
2H2O、0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；
所述继代培养基的pH优选为5.9。本发明对继代培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的培养基制备方法即可。

[0037] 在本发明中，将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.4～0.6，即得侵染液，备用。在转入乙酰丁香酮溶液前，优选地还包括将含有目的基因的农杆菌菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体。所述目的基因优选为β‑葡萄糖苷酸酶基因，所述农杆菌优选为农杆菌GV3101，乙酰丁香酮溶液的浓度优选为20～60μmol/L。在本发明中，所述固体培养基优选为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。本发明对固体培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的培养基制备方法即可。在本发明中，所述YEB固体培养基优选地由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH优选为7.4。本发明对YEB固体培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的培养基制备方法即可。

[0038] 在本发明中，将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液。所述遗传转化的受体可为新鲜分散开的红松胚性愈伤组织。本发明将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染时，还优选地轻摇15～20min，本发明通过轻摇使遗传转化的受体充分接触浸染液。本发明沥干浸染液后，还优选地包括将沥干浸染液的遗传转化的受体放到无菌的滤纸上吸去遗传转化胚性愈伤组织表面多余的菌液。

[0039] 在本发明中，然后接种至共培养培养基中，在23～27℃暗培养1～3d，即得共培养的胚性愈伤组织。在本发明中，所述共培养培养基优选为在所述继代培养基的基础上添加20～60μmol/L乙酰丁香酮。本发明对共培养培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的培养基制备方法即可。

[0040] 在本发明中，将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10～15d，连续筛选1～3次，获得抗性愈伤组织。所述筛选培养基优选为在所述继代培养基的基础上添加10～50mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠。本发明对筛选培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的培养基制备方法即可。

[0041] 在本发明中，步骤(4)之后，优选地还包括抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织进行GUS染色和/或PCR检测，根据是否有蓝色显色反应和/或目的基因的条带，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因和/或目的基因的表达，若有GUS基因和/或目的基因的表达，表明红松遗传转化成功。本发明通过GUS染色、PCR检测进行抗性愈伤组织鉴定，可以提前将假阳性愈伤组织排除，减少后期的工作量，提高工作效率。

[0042] 在本发明中，将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，24～27℃黑暗培养40～60d，获得抗性体胚。在本发明中，所述体胚诱导培养基优选地由如下浓度的组分组成：80μmol/LABA、950mg/L KNO3、825mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、925mg/L MgSO4·7H2O、31mg/L H3BO3、43mg/L ZnSO4·7H2O、21mg/L MnSO4·2H2O、1.25mg/L Na2MoO4·2H2O、4.15mg/L KI、
0.5mg/L CuSO4·5H2O、0.13mg/L CoCl2·6H2O、28mg/L FeSO4·7H2O、37mg/L Na2‑EDTA、
11mg/L CaCl2·2H2O、0.5mg/L Vitamin B5、0.1mg/L Vitamin B6、0.1mg/L Vitamin B1、
20g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、12g/L结冷胶，2g/L活性炭；所述体胚诱导培养基的pH优选为5.8。

[0043] 在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

[0044] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 实施例1

[0046] 本实施例提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0047] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在25℃下暗培养10d，即得遗传转化的受体；其中继代培养基由如下浓度的组分组成：0.3mg/L 2,4‑D、0.07mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·
7H2O、3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·
2H2O、0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；
所述继代培养基的pH为5.9；

[0048] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有β‑葡萄糖苷酸酶基因的农杆菌GV3101菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体，转入40μmol/L乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.5，即得侵染液，备用；其中固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平；所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4；

[0049] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，将侵染后的遗传转化的受体放到无菌的滤纸上吸去其表面多余的菌液，然后接种至共培养培养基中，在25℃暗培养2d，即得共培养的胚性愈伤组织；所共培养培养基在所述继代培养基的基础上添加40μmol/L乙酰丁香酮；

[0050] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10d，连续筛选3次，获得抗性愈伤组织；所述筛选培养基在所述继代培养基的基础上添加30mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠；

[0051] (5)抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织分别进行GUS染色检测，根据是否有蓝色显色反应，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因的表达，若有GUS基因的表达，表明红松遗传转化成功；

[0052] (6)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，26℃黑暗培养50d，获得抗性体胚。

[0053] 其中所述GUS染色检测的方法如下：将抗性愈伤组织浸入适量的GUS染液，进行抽真空处理，将抗性愈伤组织与GUS染液余37℃水浴7天，观察并记录愈伤组织的显色状况。其中以红松野生型胚性愈伤组织作为阴性对照，显蓝色的组织为转基因抗性愈伤组织，无色透明略带黄色为对照组织，所述的红松野生型胚性愈伤组织GUS组织化学染色图如图1，所述红松抗性胚性愈伤组织GUS组织化学染色图如图2。

[0054] 结果表明，继代10d的胚性愈伤组织状态较好(见图3)，经过连续3次抗性筛选，共获得38个抗性愈伤组织，经GUS染色，有11块愈伤组织呈蓝色，GUS染色效率为28.9％。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例除以下步骤外，其余与实施例1相同：步骤(1)中，在25℃下暗培养15d，步骤(1)中其余步骤与实施例1相同；步骤(4)中将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养15d。

[0057] 采用实施例1所述的GUS染色检测的方法采用实施例1所述的方法进行观察并记录愈伤组织的显色状况。

[0058] 结果表明，本实施例继代15d的胚性愈伤组织状态比实施例1较差(见图4)，经过连续3次抗性筛选，共获得22个抗性愈伤组织，经GUS染色，有5块愈伤组织呈蓝色，GUS染色效率为22.7％。

[0059] 对比例1

[0060] 本对比例除以下步骤外，其余与实施例1相同：步骤(1)中，在25℃下暗培养20d，步骤(1)中其余步骤与实施例1相同；步骤(4)中将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养20d。

[0061] 采用实施例1所述的GUS染色检测的方法采用实施例1所述的方法进行观察并记录愈伤组织的显色状况。

[0062] 结果表明，对比例1继代20d的胚性愈伤组织状态较差(见图5)，经过连续3次抗性筛选，未获得抗性愈伤组织，对其组织进行GUS染色，未呈现蓝色。

[0063] 实施例3

[0064] 本实施例提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0065] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在25℃下暗培养10d，即得遗传转化的受体；其中继代培养基由如下浓度的组分组成：0.3mg/L 2,4‑D、0.07mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·
7H2O、3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·
2H2O、0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；
所述继代培养基的pH为5.9；

[0066] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有β‑葡萄糖苷酸酶基因的农杆菌GV3101菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体，转入40μmol/L乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.5，即得侵染液，备用；其中固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平；所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4；

[0067] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化胚性愈伤组织浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，将侵染后的遗传转化胚性愈伤组织放到无菌的滤纸上吸去其表面多余的菌液，然后接种至共培养培养基中，在25℃暗培养2d，即得共培养的胚性愈伤组织；所共培养培养基在所述继代培养基的基础上添加40μmol/L乙酰丁香酮；

[0068] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10d，连续筛选3次，获得抗性愈伤组织；所述筛选培养基在所述继代培养基的基础上添加30mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠；

[0069] (5)抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织分别进行PCR检测，根据是否有β‑葡萄糖苷酸酶基因表达，确定抗性愈伤组织中是否有β‑葡萄糖苷酸酶基因的表达，若有β‑葡萄糖苷酸酶基因表达，表明红松遗传转化成功；

[0070] (6)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，26℃黑暗培养50d，获得抗性体胚(如图6)。

[0071] 以红松抗性愈伤组织DNA为模板对本实施例随机挑选的8个抗性细胞系进行PCR分子检测，上游引物为'‑CAAAGCAAGTGGATTGATGTGAT‑3'(SEQ ID NO:1)；下游引物为5'‑AGAGAAAAGGGTCCTAACCAAGA‑3'(SEQ ID NO:2)。反应体系为：MIX 10μL、DNA模板及上下游引物各1μL、ddH2O 7μL。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸42s，重复上述过程35次；最后72℃延伸10min。进行琼脂糖凝胶电泳实验。

[0072] 结果如图7显示，8个抗性细胞系均显示出不同亮度的目的条带，对照的愈伤组织未显出目的条带，说明β‑葡萄糖苷酸酶基因已成功转入红松胚性愈伤组织的基因组中。

[0073] 实施例4

[0074] 本实施例提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0075] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在25℃下暗培养9d，进行增殖培养，即得遗传转化的受体；其中继代培养基由如下浓度的组分组成：0.1mg/L 2,4‑D、0.1mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·7H2O、3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·2H2O、0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·
4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、
0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；所述继代培养基的pH为5.9；

[0076] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有β‑葡萄糖苷酸酶基因的农杆菌GV3101菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体，转入60μmol/L乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.6，即得侵染液，备用；其中固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平；所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4；

[0077] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，将侵染后的遗传转化受体放到无菌的滤纸上吸去其表面多余的菌液，然后接种至共培养培养基中，在25℃暗培养2d，即得共培养的胚性愈伤组织；所共培养培养基在所述继代培养基的基础上添加60μmol/L乙酰丁香酮；

[0078] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10d，连续筛选2次，获得抗性愈伤组织；所述筛选培养基在所述继代培养基的基础上添加10mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠；

[0079] (5)抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织分别进行GUS染色检测和PCR检测，根据是否有蓝色显色反应和β‑葡萄糖苷酸酶基因表达，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因的表达和β‑葡萄糖苷酸酶基因的表达，若有GUS基因的表达和β‑葡萄糖苷酸酶基因表达，表明红松遗传转化成功；

[0080] (6)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，26℃黑暗培养60d，获得抗性体胚。

[0081] 实施例5

[0082] 本实施例提供了一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

[0083] (1)红松胚性愈伤组织的继代培养：将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中，在25℃下暗培养18d，进行增殖培养，即得遗传转化的受体；其中继代培养基由如下浓度的组分组成：0.5mg/L 2,4‑D、0.05mg/L 6‑BA、340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·7H2O、3.1mg/L H3BO3、4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、
0.125mg/L Na2MoO4·2H2O、0.415mg/L KI、0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·
6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶；所述继代培养基的pH为5.9；

[0084] (2)农杆菌侵染液的制备：将含有β‑葡萄糖苷酸酶基因的农杆菌GV3101菌株在固体培养基上培养，培养至对数期，收集菌体，转入20μmol/L乙酰丁香酮溶液中，重悬菌体至OD600＝0.4，即得侵染液，备用；其中固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平；所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成：5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂；所述YEB固体培养基pH为7.4；

[0085] (3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养：将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染，沥干侵染液，将侵染后的遗传转化的受体放到无菌的滤纸上吸去其表面多余的菌液，然后接种至共培养培养基中，在25℃暗培养2d，即得共培养的胚性愈伤组织；所共培养培养基在所述继代培养基的基础上添加20μmol/L乙酰丁香酮；

[0086] (4)抗性愈伤组织的筛选培养：将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养13d，连续筛选1次，获得抗性愈伤组织；所述筛选培养基在所述继代培养基的基础上添加50mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻肟钠；

[0087] (5)抗性愈伤组织的鉴定：将抗性愈伤组织分别进行GUS染色检测，根据是否有蓝色显色反应，确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因的表达，若有GUS基因的表达，表明红松遗传转化成功；

[0088] (6)抗性体胚培养：将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，26℃黑暗培养40d，获得抗性体胚。

[0089] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。