一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记及其用途

摘要

本发明提供了一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低猪死胎数、提高活仔率，协同选择上述两个性状的优良种质，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

权利要求

1.一种筛选低死胎数、高活仔率的猪品种的方法，包含如下步骤：检测猪的国际猪基因组11 .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变的基因型，淘汰所述第9581427位C>T突变的基因型5’端第158位单核谷氨酸是C的个体，保留所述基因型的5’端第158位单核谷氨酸是T的个体为种猪，所述猪为纯种美系杜洛克猪。

2.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用核苷酸序列如P001‑F:5’‑AGCAGCGCTACCGATAGATTCA‑3’和P001‑R:5’‑CCACAGTGTAGACCTTGTGCTAGAC‑3’所示的引物对对步骤（1）所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

(4)基于所述的测序结果，确定所述待测猪所述第9581427位C>T突变的基因型；

(5)并根据所述第9581427位C>T突变的基因型，淘汰所述待测猪CC基因型个体，保留TT、TC基因型个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的死胎数、提高后代猪的活仔率。

3.用于检测一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对在鉴定猪死胎数的育种中的用途；所述猪为纯种美系杜洛克猪，所述SNP分子标记的位点为国际猪基因组11  .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变，所述分子标记为TT型或TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。

4.用于检测一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对在活仔率性状的育种中的用途；所述猪为纯种美系杜洛克猪，所述SNP分子标记的位点为国际猪基因组11  .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变，所述分子标记为TT型或TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。

5.用于检测一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对在筛选低死胎数的育种中的用途；所述猪为纯种美系杜洛克猪，所述SNP分子标记的位点为国际猪基因组11  .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变，所述分子标记为TT型或TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。

6.用于检测一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对在高活仔率的猪品种或降低猪死胎数的育种中的用途；所述猪为纯种美系杜洛克猪，所述SNP分子标记的位点为国际猪基因组11 .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变，所述分子标记为TT型或TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。

7.用于检测一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对在提高猪活仔率的育种中的用途；所述猪为纯种美系杜洛克猪，所述SNP分子标记的位点为国际猪基因组11  .1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变，所述分子标记为TT型或TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。

说明书

一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记

及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记及其用途。

背景技术

[0002] 在生猪养殖中，提高母猪的繁殖性能是提高经济效益的重要途径之一，主要体现在母猪发情配种率、空怀率、窝产仔数、健仔率和仔猪断奶重等指标上。通过长期的育种措施，母猪的繁殖性状在近40多年来已经有大幅度的提高。随着育种目标的完善，育种者们对母猪繁殖性能选育不再一味在数量上求多，而是从降低死胎数、提高活仔率等关键性状进行遗传改良，以期经济效益最大化。

[0003] 死胎是指胎儿在子宫内已完成发育阶段，已接近怀孕足期或怀孕期满时产出的已死胎儿，故其大小与同窝活仔相似，眼睛不下陷。死胎可能死于产前，亦可能母猪分娩产程过长，仔猪在产道时间过长无法呼吸，导致缺氧而死。活仔率是指断奶仔猪数占分娩出生仔猪总数的比例，是衡量母猪繁殖性能的关键指标。同时，死胎数、健仔率性状也是影响经济效益及母猪使用年限的重要因素之一。

[0004] 前期通过基于系谱、表型等数据的选育方式，母猪繁殖性状获得一定的遗传进展。然而，母猪的繁殖性状属于低遗传力性状，即使已利用后代的数据，育种可靠性水平依然相对较低，这也是降低育种计划有效性的限制因素之一。当前商品化种猪的繁殖性状相较于其经选育的祖先几乎没有显著的提高，且随着遗传性状的不断进展，其进一步的提高也变得越发缓慢和困难。因此，在原有的数据基础加入基因分型数据可提高母猪死胎数、活仔率性状育种效率，从而使选育标准更加客观、准确。

[0005] 相较于常规的育种方法，新一代分子育种技术可对母猪死胎数、活仔率性状进行早期选育，加快对重要经济性状育种的进程，从降低选育成本。提升遗传进展最有效的方法是将影响母猪死胎数、活仔率的分子标记纳入育种计划中进行选育。全基因组关联分析(Genome‑wide association study,GWAS)正是筛选重要分子标记的最佳策略之一。GWAS凭借覆盖全基因组范围数以万计的分子标记(如：单核苷酸多态Single nucleotide polymorphisms,SNP)、无需提前构建家系及更容易实现更大有效群体规模等诸多优势，在种猪育种改良中发挥不可比拟的优势。GWAS目前是现代规模化养猪业分子育种的重要手段，可鉴别到影响猪要要经济性状的QTL和主效基因，继而进一步挖掘突变位点。因此，在母猪死胎数、活仔率性状遗传改良中可充分利用GWAS策略鉴别出分子标记，将其纳入育种计划，开展分子辅助标记选择及基因组选择，这将对筛选优异繁殖性能的母猪奠定分子基础，为进一步解析母猪死胎数、活仔率性状的遗传机制提供依据。本申请在杜洛克猪种猪群体中利用GWAS策略鉴定到一个SNP位点，结果表明该SNP位点与母猪死胎数、活仔率具有一定的关联性。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供了一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种筛选低死胎数、高活仔率的猪品种的方法，本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法。

[0007] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种猪7号染色体上与猪死胎数、活仔率相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第9581427位C>T突变。该位点碱基的多态性导致猪死胎数、活仔率的差异。

[0008] 优选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M是T或C。所述SNP分子标记的位点为SEQ ID NO:1序列所标注158位的T158–C158的核苷酸突变。

[0009] 优选地，所述猪为美系杜洛克猪及其合成系。

[0010] 本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，包含引物primer‑F和primer‑R，其核苷酸序列如下：

[0011] P001‑F:5’‑AGCAGCGCTACCGATAGATTCA‑3’

[0012] P001‑R:5’‑CCACAGTGTAGACCTTGTGCTAGAC‑3’。

[0013] 本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包含上述所述的引物对。

[0014] 本发明提供了一种筛选低死胎数、高活仔率的猪品种的方法，包含如下步骤：

[0015] 检测猪7号染色体上上述与死胎数、活仔率相关的SNP分子标记，淘汰所述SNP分子标记的5’端第158位单核谷氨酸是C的个体，保留所述SNP分子标记的5’端第158位单核谷氨酸是T的个体。

[0016] 本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

[0017] (1)提取待测猪的基因组DNA；

[0018] (2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

[0019] (3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

[0020] (4)基于所述的测序结果，确定所述待测猪上述所述的SNP分子标记的基因型；

[0021] (5)并根据所述SNP标记的基因型，淘汰所述待测猪CC基因型个体，保留TT、TC基因型个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的死胎数、提高后代猪的活仔率。

[0022] 优选地，所述猪为美系杜洛克猪及其合成系。

[0023] 本发明还提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪死胎数、活仔率性状、筛选低死胎数、高活仔率的猪品种或降低猪死胎数、提高猪活仔率中的用途。

[0024] 本发明还提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在猪遗传育种中的用途。

[0025] 有益效果：

[0026] (1)本发明研究并确定影响猪死胎数、活仔率相关的分子标记位于猪7号染色体上的核苷酸序列上，验证其对死胎数、活仔率性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪降低死胎数、调高活仔率的遗传改良中，从而提高后代猪的繁殖性能，提高企业经济效益，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低猪死胎数、提高活仔率，协同选择上述两个性状的优良种质，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

[0027] (2)本发明提供了一种检测猪7号染色体上与死胎数、活仔率相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对繁殖性能进行选育，加快育种进程。

附图说明

[0028] 图1是美系杜洛克猪在7号染色体上关于死胎数、活仔率性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示‑logP值；A：死胎数，B：活仔率。

[0029] 图2是不同基因型猪的死胎数、活仔率的表型比例结果分析图；其中，A：死胎数，B：活仔率。

具体实施方式

[0030] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

[0031] 实施例1

[0032] (1)实验动物

[0033] 本发明所使用的的实验猪群体为温氏食品集团股份有限公司养猪实验部的纯种美系杜洛克母猪604头，为养猪事业部核心群。

[0034] 本实验共选取该资源群体中美系杜洛克种母猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一直，为常规方法。

[0035] (2)样本采集

[0036] 收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于‑20℃冰箱保存备用。

[0037] (3)猪全基因组50K SNP判型

[0038] 从上述资源群体中选取604头杜洛克种猪种的每个个体采集的断尾组织或耳组织，用标准的苯酚‑氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

[0039] DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用PLINK v1.9对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错‑6误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代‑温伯格平衡显著性水平高于10 的SNP，最终得到42141个SNP的有效基因型数据。

[0040] (4)全基因组关联(GWAS)分析

[0041] 为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合GEMMA软件进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与死胎数、活仔率性状关联程度的显著性阈值，染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，及染色体水平阈值为2.27e‑7，即1/42141(有效SNP数量)。

[0042] GWAS分析结果如图所示。从图1可知，杜洛克猪中，在7号染色体中存在显著影响死胎数、活仔率的位点，最强关联的SNP为g.158C>T(P值分别为5.95e‑6、1.05e‑5)。

[0043] (5)显著关联位点不同基因型与死胎数、活仔率表型的关联性分析

[0044] 根据表1可知，分子标记SNP位点g.158C>T(SEQ NO:1中第位核苷酸，及对应于国际猪11.1版本参考基序列7号染色体上9581427位C>T突变)与死胎数性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪死胎数性状，可以通过对猪此SNP位点的辅助选择，从而较少该群体死胎数，从而加快育种进程。

[0045] 根据表2可知，分子标记SNP位点g.158C>T(SEQ NO:1中第位核苷酸，及对应于国际猪11.1版本参考基序列7号染色体上9581427位C>T突变)与活仔率性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪活仔率性状，可以通过对猪此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体活仔率，从而加快育种进程。

[0046] 另外根据表1～2及图2可知，分子标记SNP位点g.158C>T的TT型、TC型比CC型的死胎数少、活仔率高。对于死胎数性状，TT型个体表型平均值比CC型个体表型平均值小0.64；对于活仔率性状，TT型个体表型平均值比CC型个体表型平均值大8.18。因此，在育种中逐步保留TT、TC基因型的种猪，以逐步提高该位点的等位基因T的频率，可以显著减少死胎数、提高活仔率，为企业带来更大的经济效益。

[0047] 表1分子标记位点g.158C>T与死胎数的相关性分析

[0048]

[0049] 表2分子标记位点g.158C>T与活仔率的相关性分析

[0050]

[0051] 实施例2目的DNA序列扩增及测序

[0052] (1)引物设计

[0053] 通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的7号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计引物的DNA序列如下所示：

[0054] P001‑F：5’‑AGCAGCGCTACCGATAGATTCA‑3’

[0055] P002‑R：5’‑CCACAGTGTAGACCTTGTGCTAGAC‑3’

[0056] (2)PCR扩增

[0057] 10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix with Loading Dye 5μL，引物P001‑F和P002‑R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

[0058] (3)DNA序列测定

[0059] DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

[0060]

[0061] 注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

[0062] 实施例3分子标记的SNP位点g.158C>T效应分析

[0063] 本发明提供一个能显著降低杜洛克猪死胎数并提高活仔率的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能极大地影响杜洛克种猪繁殖相关性状的育种进程。通过对分子标记辅助选择，若本发明将影响猪死胎数、活仔率性状的分子标记CC型个体全部选育成TT型个体，每窝死胎数将减少0.64头，假设母猪年产2.5胎，则每头母猪每年将减少1.6头死胎；按照母猪年产仔数为20头计算，则每头母猪每年将多产1.6头活仔。假设猪场存栏2000头能繁母猪，对该分子标记进行选择则每年可多产出6400头仔猪。

[0064] 本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第158位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪死胎数、活仔率之间的关联分析的应用，为猪的分子辅助选择提供了一个新的分子标记。

[0065] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。