一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法转让专利
申请号 : CN202111030177.2
文献号 : CN113750297B
文献日 : 2022-04-15
发明人 : 王宝秀 , 陈仕艳 , 欧康康 , 张茗皓 , 吴擢彤 , 盛楠 , 韩志良 , 梁欠倩 , 贾宇航 , 王华平
申请人 : 东华大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种结构和功能仿生尿道支架,其特征在于,由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成;水凝胶层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维、改性或未改性天然高分子材料和水组成;多孔层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维和脱细胞基质组成,脱细胞基质为仅脱除细胞成份后的基质。
2.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架,其特征在于,天然高分子材料为海藻酸钠;改性天然高分子材料为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸;脱细胞基质为猪膀胱脱细胞基质、猪小肠黏膜脱细胞基质、猪真皮脱细胞基质或猪食管脱细胞基质;所有的氧化细菌纤维素纳米纤维都为通过
2,2,6,6‑四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维,直径为30~100nm。
3.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架,其特征在于,水凝胶层的厚度为0.5~1mm,弹性模量为30~136kPa;多孔层的厚度为4~5mm,平均孔径为56~185μm。
4.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架,其特征在于,结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2~5层完整的上皮层,血管密度达到6.5~8.6%。
5.制备如权利要求1~4任一项所述的一种结构和功能仿生尿道支架的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后,将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并冷冻干燥得到未交联的多孔支架;
(2)将未交联的多孔支架放入交联剂溶液中,在室温下交联后用去离子水反复漂洗,随后冷冻干燥得到交联的多孔支架;
(3)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充,将交联的多孔支架固定在模具II上,使其与混合液II接触,静置一段时间得到仿生尿道支架;
材料X为海藻酸钠,成胶助剂为摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯;
材料X为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸,成胶助剂为苯基‑2,4,6‑三甲基苯甲酰基次膦酸锂;静置的同时还采用功率为2
25mW/cm的紫外灯照射。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的质量比为3:7~7:3,氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的总浓度为8~15mg/mL;冷冻干燥的温度为‑20℃,冷冻干燥的时间为24h。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,脱细胞基质溶液制备过程为:首先将脱细胞基质均质、冷冻研磨成粉末,然后将脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为10~25mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为300~450W的超声波细胞粉碎机处理6~12min。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,交联剂为质量比为1:0.6~1:1的EDC和NHS的混合物,或者为京尼平;步骤(1)中脱细胞基质的质量加入量与步骤(2)中交联剂的质量加入量之比为1:1~3.2;交联的时间为12~24h;漂洗的时间为5~10h;冷冻干燥的温度为‑20℃,冷冻干燥的时间为24h。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9~5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为15~
100mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为10~180mM;一段时间为1~24h。
说明书 :
一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法
技术领域
背景技术
是泌尿外科临床面临的一大难题。自体组织移植,如口腔内黏膜、阴茎皮瓣、膀胱黏膜,是目
前临床上治疗尿道狭窄的主要措施。但这种方法存在“以牺牲正常组织为代价”、“可供移植
的组织来源有限”的局限性。近年来,组织工程技术的发展为尿道修复重建开辟了新途径,
而组织工程的核心要素是支架材料。
段过长、面积过大时,往往出现缺血坏死、瘢痕化、尿道再狭窄的情况。究其原因,是因为二
维支架材料无法在体内快速血管化,而尿道修复过程中细胞的迁移、增殖、组织的生成依赖
于血管网络为其提供氧气和营养物质。这些血管网络中毛细血管间的最大距离是200μm,毛
细血管只能为这个距离以内的细胞提供氧气和营养物质。因此,对于长段尿道缺损组织,在
支架材料植入体内后,宿主的滋养血管延伸到缺损的中心区域较为困难,而植入材料往往
因不能及时建立有效的血管网络影响细胞迁移、增殖和存活,最终导致修复失败。
段组织的血管化程度明显提高,但新生尿道的黏膜上皮层数比正常尿道明显薄弱,影响修
复段尿道长期功能的发挥。因此,三维支架材料上皮化不足,引起上皮的保护性屏障功能失
调,尿液中的细胞毒性成份如硫酸鱼精蛋白和低分子量的阳离子毒性因子,会影响支架内
细胞活力,引起纤维化、尿道再狭窄。因此,快速构建血管网络和尿道黏膜上皮再生是以组
织工程技术实现尿道生理性修复的关键,二者相辅相成,缺一不可。
诱导因子,能促进血管内皮细胞增殖,诱导新生血管形成)结合。授权号为CN102488926B的
中国发明专利“一种用于尿道重建的组织工程支架及其制备方法”公布了一种以含VEGF的
再生丝素蛋白溶液为纺丝液,通过静电纺丝工艺将其喷涂在脱细胞基质上,制备了用于尿
道重建的组织工程支架的方法,但生长因子半衰期较短、易失活、成本高,该类方法在临床
应用方面还有很长的距离。
织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用”公布了一种接种有上皮细胞和平滑肌细胞
的高分子材料可降解纳米纤维管作为组织工程化尿道移植物,以上皮细胞为种子细胞促进
移植物植入后快速形成上皮层,然而上皮细胞来源有限,培养过程繁琐,取材部位会出现后
遗症。
发明内容
后快速上皮化及血管化,促进尿道修复重建。
水组成;多孔层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维和脱细胞基质组成,脱细胞基质为仅脱除
细胞成份后的基质,基质中含有胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等成份,仅脱
除细胞成份,脱细胞基质溶解后,胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等成份还保
留着,因此最终制得的支架的多孔层中含有这些成份,硫酸化的糖胺聚糖能够与生长因子
结合,保护生长因子的活性。
性的透明质酸;脱细胞基质为猪膀胱脱细胞基质、猪小肠黏膜脱细胞基质、猪真皮脱细胞基
质或猪食管脱细胞基质;所有的氧化细菌纤维素纳米纤维都为通过2,2,6,6‑四甲基哌啶氧
化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维,直径为30~100nm。
压缩速率为10mm/min,最大压缩量为40%,平行样n=3,取应力与应变的线性区间的斜率计
算弹性模量,例如海藻酸钠的线性区间是前10%,明胶的线性区间是10~20%)为30~
136kPa;多孔层的厚度为4~5mm,平均孔径为56~185μm。
通过动物实验免疫组化染色测试的,具体过程为:建立犬尿道缺损模型,把支架植入体内;
实验犬分别于术后3个月处死,对重建的尿道组织用10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,制
备组织切片;分别对切片进行苏木精和伊红(H&E)、Masson组织学染色,以及血管内皮标记
物(CD31)、上皮细胞标记物(AE1/AE3)的免疫组化染色;根据H&E、Masson组织学染色及AE1/
AE3的免疫组化染色可以观察到上皮形成情况,根据CD31免疫组化染色结果定量分析计算
(用显微镜对切片进行拍摄,对图像中的CD31血管结构用Image J软件进行图像分析计算)
得到血管密度。
多孔支架;
合液II接触,静置一段时间得到仿生尿道支架;
剂,葡萄糖酸内酯是一种缓释酸,碳酸钙与葡萄糖酸内酯发生反应生成钙离子,钙离子与海
藻酸钠中的羧酸根发生离子结合,从而生成海藻酸钠水凝胶;碳酸钙与葡萄糖酸内酯、氯化
钙、硫酸钙都可以与海藻酸钠发生离子交联生成海藻酸钠水凝胶,但通过碳酸钙与葡萄糖
酸内酯生成的水凝胶最均匀,因此选择碳酸钙与葡萄糖酸内酯;
2
率为25mW/cm的紫外灯照射。
冻干燥的温度为‑20℃,冷冻干燥的时间为24h。
胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为10~25mg/mL的悬浮液,最
后将悬浮液用功率为300~450W的超声波细胞粉碎机处理6~12min。
剂溶液的浓度为0.2~1wt%;步骤(1)中脱细胞基质的质量加入量与步骤(2)中交联剂的质
量加入量之比为1:1~3.2;交联的时间为12~24h;漂洗的时间为5~10h;冷冻干燥的温度
为‑20℃,冷冻干燥的时间为24h。
摩尔浓度为10~180mM(当成胶助剂为混合物时,成胶助剂的摩尔量为各组分的摩尔量之
和);一段时间为1~24h。
然尿道上皮组织中的胶原纳米纤维,又具备水凝胶高含水量、机械性能类似软组织的特性,
可为上皮细胞提供合适的微环境,在植入体内后有利于促进缺损组织周围的细胞集体迁
移、增殖,在缺损部位形成上皮层,从而恢复其屏障功能,本发明提供的仿生支架通过材料
特性诱导原位组织再生,避免使用大量种子细胞促进上皮化,节约时间、降低成本。上皮细
胞快速迁移爬行覆盖创面,才能快速上皮化,相较于现有技术以丝素蛋白、细菌纤维素、明
胶等构建的三维多孔支架,本发明光滑的水凝胶层更有利于上皮细胞的爬行。
在结构上高度模拟尿道的海绵体,仿生支架的组成材料之一为脱细胞基质,脱细胞基质经
溶解后仍然保留其细胞外基质成份(胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等),从
成份上来说,本发明提供的支架高度仿生天然组织的成份。而且,本发明提供的仿生支架的
微纳结构为细胞的长入和增殖提供了空间,仿生成份(胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的
糖胺聚糖等)能够促进细胞的迁移、增殖,尤其是生长因子能够诱导血管生成,使得支架植
入后血管网络的快速建立。现有技术促进血管化大都是把材料和生长因子结合,所用的生
长因子都是体外重组制备的生长因子,再使其与材料结合,首先价格昂贵,其次在使用过程
中容易失活。本发明的仿生成份生长因子来源于脱细胞基质,价格便宜,且脱细胞基质中含
有硫酸化的糖胺聚糖,能够与生长因子结合,保护生长因子的活性。
促进上皮化;水凝胶层通过快速上皮化为下层组织提供物理屏障,防止尿液毒性成分影响
下层组织,并恢复排尿功能,上皮化和血管化相辅相成,植入体内3个月,可形成2~5层完整
的上皮层,血管密度可达6.5~8.6%,接近正常组织的血管密度,具有良好的尿道缺损修复
效果。
具体实施方式
人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围内。
弹性模量,例如海藻酸钠的线性区间是前10%,明胶的线性区间是10~20%。
10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,制备组织切片;分别对切片进行苏木精和伊红(H&E)、
Masson组织学染色,以及血管内皮标记物(CD31)、上皮细胞标记物(AE1/AE3)的免疫组化染
色;根据H&E、Masson组织学染色及AE1/AE3的免疫组化染色可以观察到上皮形成情况,根据
CD31免疫组化染色结果定量分析计算(用显微镜对切片进行拍摄,对图像中的CD31血管结
构用Image J软件进行图像分析计算)得到血管密度。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为12mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为450W的
超声波细胞粉碎机处理6min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比
为5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为8mg/mL;
联的多孔支架;步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入
量之比为1:3.2;
12h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9,氧
化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
维、海藻酸钠和水组成;多孔层的厚度为4mm,平均孔径为185μm,由氧化细菌纤维素纳米纤
维和猪膀胱脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成3~4层完整
的上皮层,血管密度达到7.3%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为12mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为450W的
超声波细胞粉碎机处理6min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比
为5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为10mg/mL;
的多孔支架;步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量
之比为1:2.5;
12h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为2:8,氧
化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
维、海藻酸钠和水组成;多孔层的厚度为5mm,平均孔径为150μm,由氧化细菌纤维素纳米纤
维和猪膀胱脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成3~4层完整
的上皮层,血管密度达到8.4%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为15mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为450W的
超声波细胞粉碎机处理6min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比
为5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为15mg/mL;
联的多孔支架;步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入
量之比为1:1.6;
12h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9,氧
化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
维、海藻酸钠和水组成;多孔层的厚度为4mm,平均孔径为56μm,由氧化细菌纤维素纳米纤维
和猪膀胱脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2~3层完整的
上皮层,血管密度达到6.5%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为15mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为450W的
超声波细胞粉碎机处理6min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比
为3:7,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为12mg/mL;
联的多孔支架;步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入
量之比为1:1.6;
12h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为2:8,氧
化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
维、海藻酸钠和水组成;多孔层的厚度为5mm,平均孔径为95μm,由氧化细菌纤维素纳米纤维
和猪膀胱脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2~3层完整的
上皮层,血管密度达到7%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为12mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为300W的
超声波细胞粉碎机处理6min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比
为3:7,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为10mg/mL;
联的多孔支架;步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入
量之比为1:3.2;
12h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为5:5,氧
化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL,成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
纤维、海藻酸钠和水组成;多孔层的厚度为5mm,平均孔径为150μm,由氧化细菌纤维素纳米
纤维和猪膀胱脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成4~5层完
整的上皮层,血管密度达到8.6%。
散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为10mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率
为400W的超声波细胞粉碎机处理8min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪小肠黏膜脱细胞基质的质
量比为4:6,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪小肠黏膜脱细胞基质的总浓度为12mg/mL;
交联的多孔支架;步骤(2)中猪小肠黏膜脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质
量加入量之比为1:1.8;
2
率为25mW/cm的紫外灯照射,静置1h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳米
纤维与材料X的质量比为2:8,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为100mg/mL,成胶
助剂的摩尔浓度为10mM。
维、甲基丙烯酸酐改性的明胶和水组成;多孔层的厚度为5mm,平均孔径为98μm,由氧化细菌
纤维素纳米纤维和猪小肠黏膜脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月
后形成3~4层完整的上皮层,血管密度达到7.1%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为15mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为350W的
超声波细胞粉碎机处理9min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪真皮脱细胞基质的质量比
为5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪真皮脱细胞基质的总浓度为13mg/mL;
的多孔支架;步骤(2)中猪真皮脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量
之比为1:2;
2
率为25mW/cm的紫外灯照射,静置10h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳
米纤维与材料X的质量比为3:7,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为40mg/mL,成
胶助剂的摩尔浓度为15mM。
维、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和水组成;多孔层的厚度为5mm,平均孔径为78μm,由氧化细
菌纤维素纳米纤维和猪真皮脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后
形成2~3层完整的上皮层,血管密度达到6.9%。
为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为25mg/mL的悬浮液,最后将悬浮液用功率为300W的
超声波细胞粉碎机处理12min,即得脱细胞基质溶液;
到未交联的多孔支架;混合液I中,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪食管脱细胞基质的质量比
为7:3,氧化细菌纤维素纳米纤维与猪食管脱细胞基质的总浓度为8mg/mL;
的多孔支架;步骤(2)中猪食管脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量
之比为1:1;
2
率为25mW/cm的紫外灯照射,静置24h得到仿生尿道支架;混合液II中,氧化细菌纤维素纳
米纤维与材料X的质量比为5:5,氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为100mg/mL,成
胶助剂的摩尔浓度为17mM。
纤维、甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和水组成;多孔层的厚度为4mm,平均孔径为180μm,由
氧化细菌纤维素纳米纤维和猪食管脱细胞基质组成;结构和功能仿生尿道支架植入体内3
个月后形成4~5层完整的上皮层,血管密度达到8.5%。