谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料及其制备方法与应用。该制备方法包括如下步骤：将氯金酸与非巯基配体在溶剂中搅拌反应；加入还原剂，搅拌反应，提纯得到谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料。本发明将该不发光的非巯基金纳米材料应用于谷胱甘肽的检测，与常用的谷胱甘肽检测试剂相比较，具有较低的背景干扰和较优的生物相容性。该不发光的非巯基金纳米材料制备方法简单，成本低，易于工业化生产，且由于其谷胱甘肽点亮的性能，此不发光的非巯基金纳米材料用于细胞和肿瘤内谷胱甘肽检测也有很好的效果。

权利要求

1.一种谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将氯金酸与非巯基配体在溶剂中搅拌反应；

（2）加入还原剂，搅拌反应，提纯得到谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料；

所述非巯基配体为三苯基膦三间磺酸钠盐；所述还原剂为硼氢化钠；所述溶剂为水；

步骤（1）所述氯金酸与非巯基配体的物质的量的比值为1: 0.5至1: 4；所述氯金酸与步骤（2）所述还原剂的物质的量的比值为1: 3至1: 10；

步骤（1）所述搅拌反应的时间为10 ‑ 60 min；

步骤（2）所述搅拌反应的时间为6 ‑ 24 h；

所述非巯基金纳米材料为单分散纳米粒子，单颗金纳米粒子粒径为1.3 ‑ 2.5 nm；所述非巯基金纳米材料由一价金和零价金组成，其中一价金含量比零价金含量少。

2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述搅拌反应的温度为室温，转速为200 ‑ 1500 rpm/min；

步骤（2）所述搅拌反应的反应液pH为5  7，搅拌反应的温度为4 ‑ 40℃。

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3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述提纯为将搅拌反应后溶液离心去除大颗粒，再用超滤管超滤离心去除未反应的底物并浓缩；

步骤（2）所述离心的温度为4 ‑ 10℃，离心转数为15000 ‑ 21000 rpm，离心时间为30 ‑ 60 min；所述超滤管的膜孔径为3 ‑ 50 kDa，超滤离心温度为4 ‑ 10℃，超滤离心转数为

2000 ‑ 5000 rpm，超滤离心时间为10 ‑ 30 min。

4.权利要求1‑3任一项所述的制备方法制备的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料与待测材料混合均匀，孵育后，检测混合液的荧光强度。

5.根据权利要求4所述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述非巯基金纳米材料的浓度为50 ‑ 800 μM；所述孵育的时间为1 ‑ 48 h ，温度为20 ‑ 40 ℃，pH为2.0 ‑ 9.0；所述检测时激发波长范围250 ‑ 550 nm，发射波长范围600 ‑ 1200 nm；所述谷胱甘肽检测浓度为0.05 mM ‑ 10 mM。

6.权利要求1‑3任一项所述的制备方法制备的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于细胞内谷胱甘肽非诊断和非治疗检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞加入含有谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的DMEM完全培养基，在培养基中培养，然后去除培养基，加入无酚红的培养基，观察非巯基金纳米材料在细胞内被谷胱甘肽点亮的成像情况；

所述非巯基金纳米材料的浓度为50 ‑ 800 μM  , 所述无酚红的培养基为RPMI1640培养基，所述培养时间为3 ‑ 48 h，所述成像的激发波长范围250 ‑ 500 nm，发射波长范围

600‑1200 nm, 所述观察细胞成像使用共聚焦成像系统；所述非巯基金纳米材料进入细胞含量检测使用电感耦合等离子体质谱仪。

说明书

谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于功能光学纳米材料领域，具体涉及一种谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 谷胱甘肽是一种天然三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。作为在细胞胞质溶胶中合成的最丰富的非蛋白质硫醇化合物，谷胱甘肽在调控细胞生理功能方面具有多种作用，包括:(1)直接清除活性氧、一氧化氮及其衍生物，从而保护电子传递链、DNA、脂质和蛋白质；(2)内源性化合物和外源性生物的解毒；(3)蛋白质硫醇基团的S‑谷胱甘肽硫酰化；(4)细胞周期进程和凋亡的调控。所以，谷胱甘肽不仅仅是一种自由基清除剂，它在控制细胞存活、坏死和凋亡以及在细胞信号传导和代谢中也起着重要作用。此外，谷胱甘肽在哺乳动物细胞具有较高的表达水平，在大多数正常细胞中，谷胱甘肽浓度约为1‑2mM。然而，谷胱甘肽含量的升高是临床上各种类型癌细胞的共同特征，癌细胞中的谷胱甘肽浓度可达到
10mM，是正常细胞的4倍之多。有研究表明，高水平的谷胱甘肽不仅会促进肿瘤的生长，而且许多肿瘤细胞的凋亡抗性也与细胞内谷胱甘肽较高的表达水平有关。癌细胞中谷胱甘肽含量使其成为癌症诊断最重要的信号分子之一，因此，开发新型、高效的纳米探针用于体内谷胱甘肽的检测对癌症的早期诊断与治疗具有十分重要的意义。

[0003] 目前，肿瘤的检测手段主要包括X光、电子计算机断层扫描(CT)、正电子发射计算机断层显像(PET‑CT)、磁共振成像和超声成像等。这些影像检测存在分辨率不高、灵敏度和特异性较低，采集时间长，电离辐射风险高等问题。相比之下，光学检测分析方法具有简便快速、低成本、高灵敏度、易于适应自动化分析等特点，且采用非电离辐射的方式，提供了一种独特的非破坏性、可视化的途径来对关键生物分子进行较小干扰的原位检测。然而，目前利用小分子染料通过荧光检测方法来分析生物体内谷胱甘肽含量的报道较多(J Hazard Mater,2021,413,125332)，但在分析检测过程中，染料小分子容易光漂白，光学性质稳定性差，结构中疏水部分较多导致较差的生物相容性，而且染料发射波长较短会受到生物体内蛋白背景荧光的干扰。由于金纳米粒子具有良好的生物相容性，光学性质稳定，并且具有低生物荧光背景干扰的近红外二区荧光，因此，设计与开发谷胱甘肽点亮型的金纳米探针，对提高生物体内谷胱甘肽检测的灵敏度与稳定性更具实际应用价值。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供了谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备及其在体外与细胞内对谷胱甘肽检测的应用方法。本发明提供的非巯基金纳米材料本身不发光，但与谷胱甘肽作用后能被点亮，发出近红外荧光。因此，这种非巯基金纳米材料可用于体外谷胱甘肽的检测，由于其稳定性好，生物毒性低，成像背景干扰低，灵敏度高，它也能用于细胞内谷胱甘肽成像，并通过共聚焦显微镜可观察材料进入细胞过程等方面的研究。

[0005] 本发明通过如下技术方案来实现。

[0006] 一种谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)将氯金酸与非巯基配体在溶剂中搅拌反应；

[0008] (2)加入还原剂，搅拌反应，提纯得到谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料。

[0009] 优选的，所述非巯基配体为三苯基膦三间磺酸钠盐，二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐，4‑二苯基膦苯甲酸，三(4‑氟苯基)膦，三苯基膦中的一种以上；所述还原剂为硼氢化钠，二甲胺硼烷，四丁基硼氢化铵，四羟甲基氯化磷中的一种以上。

[0010] 优选的，步骤(1)所述氯金酸与非巯基配体的物质的量的比值为1:0.5至1:4；所述氯金酸与步骤(2)所述还原剂的物质的量的比值为1:3至1:10。

[0011] 优选的，步骤(1)所述搅拌反应的温度为室温，转速为200‑1500rpm/min，时间为10‑60min；

[0012] 优选的，所述溶剂为水；

[0013] 优选的，步骤(2)所述搅拌反应的反应液pH为5～7，搅拌反应的温度为4‑40℃，搅拌反应的时间为6‑24h；

[0014] 优选的，步骤(2)所述提纯为将搅拌反应后溶液离心去除大颗粒，再用超滤管超滤离心去除未反应的底物并浓缩；

[0015] 进一步优选的，步骤(2)所述离心的温度为4‑10℃，离心转数为15000‑21000rpm，离心时间为30‑60min；所述超滤管的膜孔径为3‑50kDa，超滤离心温度为4‑10℃，超滤离心转数为2000‑5000rpm，超滤离心时间为10‑30min。

[0016] 上述的制备方法制备得到的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，所述非巯基金纳米材料为单分散纳米粒子，单颗金纳米粒子粒径为1.5‑2.8nm。所述非巯基金纳米材料不发光。

[0017] 上述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于检测谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

[0018] 将所述谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料与待测材料混合均匀，孵育一段时间后，检测混合液的荧光强度；

[0019] 优选的，所述非巯基金纳米材料的浓度为50‑800μM；所述孵育的时间为1‑48h，温度为20‑40℃，pH为2.0‑9.0；所述检测时激发波长范围250‑550nm，发射波长范围600‑1200nm；所述谷胱甘肽检测浓度为0‑10mM。

[0020] 上述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于细胞内谷胱甘肽检测的方法，包括以下步骤：

[0021] 将细胞加入含有谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的DMEM完全培养基，在培养基中培养，然后去除培养基，加入无酚红的培养基，观察非巯基金纳米材料在细胞内被谷胱甘肽点亮的成像情况。

[0022] 优选的，所述非巯基金纳米材料的浓度为50‑800μM,所述无酚红的培养基为RPMI1640培养基，所述培养时间为3‑48h，所述成像的激发波长范围250‑500nm，发射波长范围600‑1200nm,所述观察细胞成像使用共聚焦成像系统；所述非巯基金纳米材料进入细胞含量检测使用电感耦合等离子体质谱仪。

[0023] 进一步的：所述检测细胞为MDA‑MB‑231细胞，而不仅限于MDA‑MB‑231细胞。

[0024] 上述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于活体肿瘤内谷胱甘肽检测的方法，包括以下步骤：

[0025] 将肿瘤细胞接种于小鼠，正常饲养后，注射所述非巯基金纳米材料的DPBS溶液，最后，观察非巯基金纳米材料在活体肿瘤内被谷胱甘肽点亮的成像情况；

[0026] 优选的，所述非巯基金纳米材料的浓度为1–20mM，肿瘤细胞为MDA‑MB‑231细胞、4T‑1细胞，接种方式为皮下注射，小鼠品系为BALB/c裸鼠，饲养天数为1–4周，所述观察时间为0‑72h，所述成像的激发波长范围250‑700nm，发射波长范围500‑1200nm,所述观察活体成像使用活体荧光成像仪。

[0027] 上述的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料进入细胞途径的研究过程，包括以下步骤：

[0028] 将接种有细胞密度为20％‑30％的细胞培养24h后，用DPBS洗涤两次后，加入非巯基金纳米材料，在培养基中培养不同的时间后，用共聚焦显微镜观察材料在细胞内的成像情况，并收集细胞用电感耦合等离子体质谱仪检测不同时间内细胞对材料的摄取情况。

[0029] 优选的，所述谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料使用的浓度为50‑500μM，细胞摄取时间观察为0‑48h，细胞成像环境为无酚红的RPMI1640培养基。

[0030] 优选的，所述非巯基金纳米材料不发光，谷胱甘肽点亮后，检测时激发波长范围250‑500nm，发射波长范围600‑1200nm,细胞成像过程观察使用共聚焦成像系统，细胞摄取材料含量的检测使用电感耦合等离子体质谱仪。

[0031] 本发明合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料具有良好的生物相容性，较低的毒性，低的背景干扰等优点，可以应用于谷胱甘肽检测，同时用共聚焦显微镜可以明显的观察到细胞内谷胱甘肽分布的情况，故此谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在细胞成像、活体示踪、肿瘤诊断与治疗等领域具有较大的应用前景。

[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

[0033] (1)本发明合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，合成工艺简单，成本低，易于工业化生产。

[0034] (2)本发明合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料生物相容性好，毒性低，荧光背景干扰低，检测灵敏度高。

[0035] (3)本发明合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，点亮后激发和发射波长范围广，用于研究细胞成像操作简单，可以通过共聚焦显微镜来观察，同时也可以通过活体荧光成像仪对肿瘤进行成像。

附图说明

[0036] 图1为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料紫外光谱随反应时间延长的变化图。

[0037] 图2为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图。

[0038] 图3为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在不同NaCl浓度下紫外变化图。

[0039] 图4为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图。

[0040] 图5为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的粒径统计图。

[0041] 图6为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的Zeta电势图。

[0042] 图7为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的水合粒径图。

[0043] 图8为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图。

[0044] 图9a为实施例2中非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮的400～900nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0045] 图9b为实施例2中非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮的900～1200nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0046] 图10为实施例3中非巯基金纳米材料被不同浓度谷胱甘肽点亮的800nm处荧光强度(a)和1026nm(b)处荧光强度图。

[0047] 图11a为实施例4中非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的400～900nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0048] 图11b为实施例4中非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的900～1200nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0049] 图12为实施例5中非巯基金纳米材料在FBS存在下被不同浓度谷胱甘肽点亮的800nm处荧光强度(a)和1026nm(b)处荧光强度图。

[0050] 图13为实施例6中非巯基金纳米材料在不同浓度下对MDA‑MB‑231细胞的毒性实验结果图。

[0051] 图14a为实施例6中MDA‑MB‑231细胞对非巯基金纳米材料在FBS存在下对不同孵育时间内其摄取含量的分析图。

[0052] 图14b为实施例6中MDA‑MB‑231细胞对非巯基金纳米材料对不同孵育时间内其摄取含量的分析图。

[0053] 图15为实施例6中不同抑制剂对细胞摄取非巯基金纳米材料的影响。

[0054] 图16为实施例7中非巯基金纳米材料检测细胞内谷胱甘肽的荧光成像图。

[0055] 图17为实施例8中非巯基金纳米材料在FBS存在下对细胞内谷胱甘肽检测的荧光成像图。

[0056] 图18为实施例9中非巯基金纳米材料点亮后与细胞内溶酶体共定位的荧光成像图。

[0057] 图19为实施例10中非巯基金纳米材料在活体瘤内注射后在肿瘤处点亮情况随时间变化的活体荧光成像图。

[0058] 图20为实施例11中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图。

[0059] 图21为实施例11中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图。

[0060] 图22为实施例11中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的粒径统计图。

[0061] 图23为实施例11中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图。

[0062] 图24为实施例12中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图。

[0063] 图25为实施例12中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图。

[0064] 图26为实施例12中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的粒径统计图。

[0065] 图27为实施例12中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图。

[0066] 图28为本发明谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备流程图和发光原理图。

具体实施方式

[0067] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0068] 在以下具体实施例中，所涉及的到的氯金酸和三苯基膦三间磺酸钠购买于上海迈瑞尔化学技术有限公司，四周龄左右的BALB/c裸鼠购买于广东省实验动物中心，所有动物实验程序均严格按照实验动物研究伦理委员会规定执行。MDA‑MB‑231细胞购自ATCC，DMEM培养基(gibico，货号：LOT8118192)，胎牛血清(FBS，LONSA SCIENCE SRL，CAS号：S711‑001S)。DMEM完全培养基为包含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基。观察谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料性质与细胞和活体成像分析等方面的仪器主要包含日本电子株式会社JEM‑2100F透射电子显微镜、美国PerkinElmer荧光/磷光/发光光度计(LS‑55)、奥林巴斯共聚焦荧光成像系统，德国Thermo Scientific电感耦合等离子体质谱仪(iCAP RQ)以及UVP ChemStudio PLUS 815体内成像系统(Alalytikjena，美国)等。

[0069] 图28为本发明谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备流程图和发光原理图。

[0070] 实施例1

[0071] 谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备步骤如下：

[0072] 在室温条件下，在装有20.8mL的去离子水的50mL圆底烧瓶中加入28.5μL氯金酸水溶液(0.355M)，随后加入1.8mL三苯基膦三间磺酸钠盐水溶液(10mM)，室温下500rpm/min转速搅拌30min，溶液由浅黄色变为无色透明时，加入2.4mL硼氢化钠水溶液(25mM)，溶液立即变为棕黄色，常温下搅拌12h后，停止反应，然后在4℃、21000rpm下离心1h去除大颗粒，再用10kDa超滤管在4℃、4000rpm下离心10min超滤去除未反应的底物并浓缩，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

[0073] 本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备为最优合成反应条件：

[0074] 图1为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料紫外光谱随反应时间延长的变化图。随反应时间的延长，溶液在4h之后的出现材料的特征峰，并且峰位置不再改变，表明4h及之后能合成上述非巯基金纳米材料。

[0075] 本实施例制得的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在不同溶剂中的稳定性：

[0076] (1)在4℃条件下储存的紫外稳定性

[0077] 取25.8μL以上合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，加入去离子水稀释至1mL，用紫外‑可见分光光度计检测其在不同时间点的紫外‑可见光谱。

[0078] 图2为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图，从图中可以看出谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在4℃条件下储存稳定性好。

[0079] (2)在不同浓度NaCl溶液中的荧光稳定性

[0080] 分别取25.8μL以上合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，加入不同体积的5M NaCl溶液，再加水稀释至1mL，用紫外‑可见分光光度计检测不同浓度NaCl对谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料紫外‑可见吸收光谱的影响。

[0081] 图3为实施例1中谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在不同NaCl浓度下紫外变化图。表示为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在不同NaCl浓度下较稳定。

[0082] 合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图，如图4所示，通过粒径分析软件(如Nano Measurer 1.2.5)对合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料进行统计，结果如图5所示，其粒径为1.3～2.5nm。

[0083] 图6为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的Zeta电势图；表示合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的zeta电势为‑10mV～‑100mV。

[0084] 图7为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的水合粒径图；表示合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的水合粒径为2.5nm～8.0nm。

[0085] 图8为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图，Au(I)的含量为36.8％，Au(0)的含量为63.2％，Au(I)含量比Au(0)要少。

[0086] 实施例2

[0087] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于谷胱甘肽检测的实施方案如下：将25.8μL以上制备的纳米材料(15.47mM)、250μL谷胱甘肽溶液(1.0mM，1x PB缓冲液中)、13.7μL的氯化钠(5M)和210.5μL的去离子水混合，pH约为7.4，在恒温孵育器上37℃孵育3‑24h，然后用荧光仪测试非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮效果。

[0088] 图9a为非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮的400～900nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0089] 图9b为非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮的900～1200nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0090] 从图9a和图9b可以看出，非巯基金纳米材料被谷胱甘肽点亮的荧光在600–1200nm范围内，而且荧光强度随孵育时间的延长而增强。

[0091] 实施例3

[0092] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于谷胱甘肽检测的实施方案如下：将25.8μL以上制备的纳米材料(15.47mM)、250μL不同浓度谷胱甘肽溶液(1x PB缓冲液中)、13.7μL的氯化钠(5M)和210.5μL的去离子水混合，pH约为7.4，在恒温孵育器上37℃孵育24h，然后用荧光仪测试非巯基金纳米材料被谷胱甘肽的点亮效果。

[0093] 图10a为非巯基金纳米材料与不同浓度的谷胱甘肽孵育后其在800nm处荧光强度的变化，当谷胱甘肽浓度为0.5mM时，其信噪比值高达25。

[0094] 图10a为非巯基金纳米材料与不同浓度的谷胱甘肽孵育后其在1026nm处荧光强度的变化，当谷胱甘肽浓度为0.5mM时，其信噪比值高达4。

[0095] 实施例4

[0096] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于FBS存在下对谷胱甘肽在不同孵育时间下检测的实施方案如下：将50μL的胎牛血清，25.8μL以上制备的纳米材料(15.47mM)、250μL谷胱甘肽溶液(1.0mM,1x PB缓冲液中)、13.7μL的氯化钠(5M)和210.5μL的去离子水混合，pH约为7.4，在恒温孵育器上于37℃下孵育3‑24h，然后用荧光仪测试非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮效果。

[0097] 图11a为实施例4中非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的400～900nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0098] 图11b为实施例4中非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的900～1200nm荧光光谱随孵育时间延长的变化图。

[0099] 从图11a和图11b可以看出，非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的荧光在600–1200nm范围内，而且荧光强度随孵育时间的延长而增强。

[0100] 实施例5

[0101] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在FBS存在下对不同浓度谷胱甘肽的检测的实施方案如下：将50μL的胎牛血清，25.8μL以上制备的纳米材料(15.47mM)、250μL不同浓度谷胱甘肽溶液(1x PB缓冲液中)、13.7μL的氯化钠(5M)和210.5μL的去离子水混合，pH约为7.4，在恒温孵育器上37℃孵育48h，然后用荧光仪测试非巯基金纳米材料在FBS存在下被谷胱甘肽点亮的荧光图。

[0102] 图12a为非巯基金纳米材料与不同浓度的谷胱甘肽孵育后其在800nm处荧光强度的变化，当谷胱甘肽浓度为0.5mM时，其信噪比值较高。

[0103] 图12b为非巯基金纳米材料与不同浓度的谷胱甘肽孵育后其在800nm处荧光强度的变化，当谷胱甘肽浓度为0.5mM和1.0mM时，其信噪比值较高.

[0104] 实施例6

[0105] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于研究细胞对材料的摄取情况，其具体实施方案如下：当细胞生长至培养皿底部覆盖率为80‑90％左右时，用胰蛋白酶消化，将细胞从培养皿中消化收集后离心去除培养液，加入1mL新的培养基重新分散细胞，细胞计数后移植至24孔细胞培养板中，每孔50000个细胞，且每组设置4个复孔，待细胞完全贴壁后，加入6.5μL以上制备的金纳米材料(15.47mM)，在含有FBS的培养基中培养不同时间(1h，3h，6h，12h，24h)，最后收集细胞，用王水消解，用电感耦合等离子体质谱仪测得细胞内金的含量来研究细胞的摄取情况。

[0106] 以MDA‑MB‑231细胞和HEK‑293T细胞为受试细胞，通过CCK8检测试剂盒对谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料进行不同浓度下的毒性实验研究。

[0107] 图13为谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在不同浓度下的毒性实验，如图所示材料基本无毒。

[0108] 图14a为MDA‑MB‑231细胞对非巯基金纳米材料在FBS存在下不同孵育时间内其摄取含量的分析。

[0109] 图14b为MDA‑MB‑231细胞对非巯基金纳米材料在不同孵育时间内其摄取含量的分析。

[0110] 从图14a和图14b可以看出，在0‑24h内，细胞摄取量随着时间的延长而增多。

[0111] 图15为不同内吞抑制剂对谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的细胞内吞抑制结果，如图所示，甲基‑β‑环糊精对其细胞摄取抑制较明显，表明谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料主要通过胞膜窖介导的內吞方式进入细胞。

[0112] 实施例7

[0113] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于细胞内谷胱甘肽成像检测的实施方案如下：将接种有细胞密度为20％‑30％共聚焦培养皿的细胞培养24h后，用DPBS洗涤两次后，分别加入0μL、6.5μL、13μL、19.4μL以上制备的纳米材料(15.47mM)，在1mL无FBS培养基中共孵育24h，最后，用共聚焦显微镜观察非巯基金纳米材料对细胞内谷胱甘肽检测的成像情况。

[0114] 图16表示非巯基金纳米材料在MDA‑MB‑231细胞中能检测谷胱甘肽，且基本无细胞背景荧光。

[0115] 实施例8

[0116] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在FBS存在下对细胞内谷胱甘肽成像检测的实施方案如下：将接种有细胞密度为20％‑30％共聚焦培养皿的细胞培养24h后，用DPBS洗涤两次后，分别加入0μL、6.5μL、13μL、19.4μL以上制备的纳米材料(15.47mM)，在1mL含有FBS培养基中共孵育24h，最后，用共聚焦显微镜观察非巯基金纳米材料对细胞内谷胱甘肽检测的成像情况。

[0117] 图17表示非巯基金纳米材料在FBS存在下能检测MDA‑MB‑231细胞中谷胱甘肽，材料浓度越高，其点亮效果越好。

[0118] 实施例9

[0119] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于细胞内谷胱甘肽成像检测的实施方案如下：将接种有细胞密度为20％‑30％共聚焦培养皿的细胞培养24h后，用DPBS洗涤两次后，加入19.4μL以上制备的纳米材料(15.47mM)，在1mL无FBS培养基中共孵育23.5h后，加入靶向溶酶体染料，再孵化0.5h，用DPBS洗涤出去材料和染料后加入无酚红的RPMI1640培养基，最后，用共聚焦显微镜观察点亮后的非巯基金纳米材料与细胞内溶酶体的共定位荧光成像情况。

[0120] 图18为实施例9中非巯基金纳米材料点亮后与细胞内溶酶体共定位的荧光成像图。表示材料被细胞内吞后主要在溶酶体中被谷胱甘肽点亮。

[0121] 实施例10

[0122] 实施例1制备谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料用于活体内肿瘤谷胱甘肽成像检测的实施方案如下：将接种有MDA‑MB‑231细胞的BALB/c裸鼠正常饲养10天后，瘤内注射150μL以上制备的纳米材料的DPBS溶液(10mM)，最后，用活体成像仪分别在不同时间下观察活体内上述非巯基金纳米材料在肿瘤部位的点亮情况。

[0123] 图19为实施例10中非巯基金纳米材料在活体瘤内注射后在肿瘤处点亮情况随时间变化的活体荧光成像图。表明上述非巯基金纳米材料能在肿瘤处被谷胱甘肽点亮，在不考虑饲料荧光下生物荧光背景干扰小，而且点亮荧光强度随时间延长而增强。

[0124] 实施例11

[0125] 谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备步骤如下：

[0126] 在室温条件下，在装有20.8mL的去离子水的50mL圆底烧瓶中加入28.5μL氯金酸水溶液(0.355M)，随后加入1.0mL三苯基膦三间磺酸钠盐水溶液(10mM)，室温下500rpm/min转速搅拌30min，溶液由浅黄色变为微黄透明时，加入2.4mL硼氢化钠水溶液(25mM)，溶液立即变为红棕色，常温下搅拌12h后，停止反应，然后在4℃、21000rpm下离心1h去除大颗粒，再用10kDa超滤管在4℃、4000rpm下离心10min超滤去除未反应的底物并浓缩，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

[0127] 本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在4℃条件下储存的紫外稳定性：

[0128] 取25.8μL以上合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，加入去离子水稀释至1mL，用紫外‑可见分光光度计检测其在不同时间点的紫外‑可见光谱。

[0129] 图20为本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图，从图中可以看出谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在4℃条件下储存稳定性好。

[0130] 本实施例合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图，如图21所示，通过粒径分析软件(如Nano Measurer 1.2.5)对合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料进行统计，结果如图22所示，其粒径为1.3～2.5nm。

[0131] 图23为本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图，Au(I)的含量为34.5％，Au(0)的含量为65.5％，Au(I)含量比Au(0)要少。

[0132] 实施例12

[0133] 谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的制备步骤如下：

[0134] 在室温条件下，在装有20.8mL的去离子水的50mL圆底烧瓶中加入28.5μL氯金酸水溶液(0.355M)，随后加入2.0mL三苯基膦三间磺酸钠盐水溶液(10mM)，室温下500rpm/min转速搅拌30min，溶液由浅黄色变为无色透明时，加入2.4mL硼氢化钠水溶液(25mM)，溶液立即变为黄色，常温下搅拌12h后，停止反应，然后在4℃、21000rpm下离心1h去除大颗粒，再用10kDa超滤管在4℃、4000rpm下离心10min超滤去除未反应的底物并浓缩，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

[0135] 本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在4℃条件下储存的紫外稳定性：

[0136] 取25.8μL以上合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料，加入去离子水稀释至1mL，用紫外‑可见分光光度计检测其在不同时间点的紫外‑可见光谱。

[0137] 图24为本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的紫外光谱随保存时间的变化图，从图中可以看出谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料在4℃条件下储存稳定性好。

[0138] 本实施例合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的透射电子显微镜图，如图25所示，通过粒径分析软件(如Nano Measurer 1.2.5)对合成的谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料进行统计，结果如图26所示，其粒径为1.3～2.5nm。

[0139] 图27为本实施例谷胱甘肽点亮型的非巯基金纳米材料的X射线光电子能谱图，Au(I)的含量为37.2％，Au(0)的含量为62.8％，Au(I)含量比Au(0)要少。

[0140] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。