木犀草素在增效没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌作用中的新用途

摘要

本申请公开木犀草素在增效没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌作用中的新用途，属于医药技术领域，具体涉及木犀草素(Luteolin，LU)在增效没食子酸烷基酯类化合物(Alkyl gallates，AGs)抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作用中的新用途。经体外抗菌药物敏感性试验(简称药敏试验)证明：LU在与没食子酸烷基酯类化合物(乙酯～十二烷基酯)联合给药时，能不同程度地提高各自对S.aureus的抑制活性，发挥协同作用。因此，可制备没食子酸烷基酯类化合物与LU的组合药物，通过口服、外用或注射等方式治疗细菌感染。在全球耐药性日趋严峻的情况下，本申请新用途可以在降低用药剂量的同时提高抗菌治疗效果，具有重要的参考价值。

权利要求

1.木犀草素在制备没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌增效剂中的用途，没食子酸烷基酯类化合物与木犀草素的质量比为2～32:1；

所述木犀草素的结构式如式(1)所示：

所述没食子酸烷基酯类化合物的结构式如式(2)所示：

2.木犀草素和没食子酸烷基酯类化合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的用途，所述没食子酸烷基酯类化合物与木犀草素的质量比为2～32:1；

所述木犀草素的结构式如式(1)所示：

所述没食子酸烷基酯类化合物的结构式如式(2)所示：

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌选择Newman S.aureus ATCC 25904。

4.一种金黄色葡萄球菌抑制剂，其特征在于，以没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素组合物为唯一活性成分；所述金黄色葡萄球菌抑制剂中，没食子酸烷基酯类化合物与木犀草素的质量比为2～32:1；

所述木犀草素的结构式如式(1)所示：

所述没食子酸烷基酯类化合物的结构式如式(2)所示：

5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌抑制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的所有载体或赋形剂；所述没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素组合物与与赋形剂制成制剂的形态为口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

6.一种金黄色葡萄球菌抑制试剂盒，其特征在于，包括：以没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素组合物为唯一活性成分的混合制剂；没食子酸烷基酯类化合物与木犀草素的质量比为2～32:1；

所述木犀草素的结构式如式(1)所示：

所述没食子酸烷基酯类化合物的结构式如式(2)所示：

说明书

木犀草素在增效没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌

作用中的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及木犀草素(LU)在增效没食子酸烷基酯类化合物(Alkyl gallates，AGs)抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作用中的新用途。

背景技术

[0002] 没食子酸及其衍生物被广泛应用于食品、化妆品和医药行业。由于多酚官能团的存在，没食子酸具有很高的氧自由基清除活性(Shen et al.,Food Res.Int.2021,143,110280)，可防止脂肪和油脂的酸败和变质，促进其作为食品添加剂应用于各种可食用材料，如烘焙食品和糖果(Singleton,Adv.Food Res.1981,27,149‑242)。没食子酸能保护细胞免受紫外线或电离辐射的伤害，可用于化妆品。据报道，没食子酸对包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌在内的多种病原体具有抗菌作用。它还具有许多其他治疗作用，如抗过敏、抗炎、抗突变和抗癌等(Choubey et al.,Pharmaceutical patent analyst 
2015,4,305‑315)。

[0003] 没食子酸酯类衍生物具有强大的治疗性能，包括抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗胆汁溶解、抗血管生成和抗抑郁等(Locatelli et al.,Eur.J.Med.Chem.2013,60,233‑239)。没食子酸通过调控肿瘤细胞内氧化应激和细胞内钙离子水平诱导细胞凋亡(Saeed et al.,BMC Complement.Altern.Med.2012,12,221)。与没食子酸相比，没食子酸烷基酯类衍生物(Alkyl gallates，AGs)如没食子酸月桂酯和没食子酸辛酯对肿瘤细胞具有更高的抗增殖潜力(Singleton,Adv.Food Res.1981,27,149‑242)。2011年，Guthery制定了一种治疗寻常痤疮的改进方法，可以在不使用抗生素的情况下抑制或杀死微生物原细菌。其方法即利用没食子酸烷基酯(优选没食子酸丙酯)减少毛囊反应性炎症来抑制痤疮(Guthery BE:EP2378872A1 2011)。此外，没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和没食子酸戊酯对葡萄糖转运有良好的抑制作用，可用于控制餐后血糖水平(Wang et al.,Food Funct.2021,12,5399‑
5406)。

[0004] 近年来，多种基于没食子酸酯类衍生物的组合药物已被报道用于治疗不同疾病。例如，没食子酸酯与偶氮嘧啶胺(BASF SE:WO2011138345A2 2011)、没食子酸氨基甲酸酯(BAYER AKTIENGESELLSCHAFT:US4034104A 1977)的混合物具有杀菌作用。含药没食子酸酯能有效治疗肠道细菌感染(Masakazu A et al.,WO1998043990A1 1998)。Bojun公开了一种由70‑95％的没食子酸螯合钙、0‑8％的没食子酸螯合锌、0‑2％的没食子酸螯合镁、0‑2％的没食子酸螯合物和5‑18％的菊粉组合物，其具有抗病毒、抗肿瘤、抗突变和抗氧化活性，可用于治疗和预防螨病或胆囊病(QUINTILES FINE CHEMICAL CO.,LTD:CN101327203B 
2011)。没食子酰葡萄糖酸、没食子酸甲酯和槲皮素苷的组合物被用作脂肪酸合成酶抑制剂，可用于制备减肥和防癌药物，也可用作食品、保健品和日用化学添加剂(CAPITAL MEDICAL UNIVERSITY:CN101768081B(2013)。Brading等人报道了没食子酸酯混合物在口腔护理中提高性能和稳定性的用途(UNILEVER PLC,UNILEVER NV,HINDUSTAN UNILEVER LIMITED:WO2011124573A1 2011)。Brading等人则配制了一种没食子酸烷基酯和柠檬酸根离子化合物的组合物用于改善牙龈炎或牙周炎(UNILEVER PLC,UNILEVER NV:EP2555828A1 
2013)。没食子酸烷基酯还可以与其他常用抗氧化剂组合，优化其抗氧化剂效果(Shen et al.,Food Res.Int.2021,143,110280)。总的来说，大量以没食子酸及其酯类衍生物为基础的研究表明，全球不同科学领域的人们对此类天然物质的兴趣与日俱增。涉及没食子酸及其酯类衍生物天然或合成用途的进一步研究可能为这些化合物新性质或生物学潜力的探索和开发提供依据。

[0005] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种革兰氏阳性细菌，是最常见的食源性病原体，可引起许多急性和慢性感染，并导致许多脓肿、败血症、关节炎和心内膜炎(Qian et al.,Microb.Pathog.2020,142)。因此，人们进行了广泛的研究来控制金黄色葡萄球菌引起的感染。尽管多种没食子酸酯类组合药物已被报道用于不同医药途径，然而，关于组合药物基于协同作用机制进行金黄色葡萄球菌感染治疗的研究尚未报道。

[0006] 木犀草素(LU)是一种存在于多种植物中的天然化合物，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为16～32μg/mL(Qian et al.,Microb.Pathog.2020,142)，在天然抗菌剂的制备方面具有潜在的用途。

发明内容

[0007] 本申请的目的是提供一种木犀草素(Luteolin，LU)在增效没食子酸烷基酯类化合物(Alkyl gallates，AGs)抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作用中的新用途。

[0008] 经体外抗菌药物敏感性试验(简称药敏试验)证明：LU在与没食子酸烷基酯类化合物(乙酯～十二烷基酯/月桂酯)联合给药时，能不同程度地提高各自对S.aureus的抑制活性，发挥协同作用。可制备没食子酸烷基酯类化合物与LU的组合药物，通过口服、外用或注射等方式治疗细菌感染。本申请为木犀草素(LU)与没食子酸烷基酯类化合物(AGs)的联合应用开辟了一种新用途。该类组合药物能不同程度地提高各自对S.aureus的生长抑制活性，在降低用药剂量的同时提高抗菌治疗效果，具有极其重要的参考价值。

[0009] 基于上述发现：

[0010] 本申请提供一种木犀草素在增效没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作用中的用途。

[0011] 本申请提供一种木犀草素在制备没食子酸烷基酯类化合物抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)增效剂中的用途。

[0012] 本申请提供一种木犀草素和没食子酸烷基酯类化合物在制备金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑制剂中的用途。

[0013] 所述木犀草素的结构式如式(1)所示：

[0014]

[0015] 所述没食子酸烷基酯类化合物的结构式如式(2)所示，包含没食子酸乙酯(n＝1)、没食子酸丙酯(n＝2)…没食子酸辛酯(n＝8)…没食子酸月桂酯(n＝11)：

[0016]

[0017] 可选的，所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的菌株为敏感菌株，优选Newman S.aureus ATCC 25904。

[0018] 本申请提供一种没食子酸烷基酯类抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)增效剂，以木犀草素为活性成分。

[0019] 本申请提供一种金黄色葡萄球菌抑制剂，以没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素组合物为活性成分。

[0020] 可选的，所述金黄色葡萄球菌抑制剂中，没食子酸烷基酯类化合物与木犀草素的质量比为2～32:1。根据所选择的没食子酸烷基酯类化合物不同，与木犀草素的质量配比不同。

[0021] 可选的，所述金黄色葡萄球菌抑制剂还包括药学上可接受的所有载体或赋形剂；所述没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素组合物与与赋形剂制成制剂的形态为口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

[0022] 本申请提供一种金黄色葡萄球菌抑制试剂盒，一种方案中：包括：包含没食子酸烷基酯类化合物的制剂和包含木犀草素的制剂；

[0023] 另一种方案中，包括：包含没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素的混合制剂。

[0024] 即包括没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素分别制成制剂用药时混合和没食子酸烷基酯类化合物和木犀草素直接制成混合制剂两种方式。两种用药方式具有基本相同的疗效。

[0025] 本申请通过单体化合物及其组合对Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904的活性筛选，得知没食子酸甲酯(MG)和没食子酸乙酯(EG)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)呈现较弱的抑制作用，最小抑菌浓度均为512μg/mL；没食子酸丙酯(PG)对S.aureus呈现弱抑制作用，最小抑菌浓度为128μg/mL；随烷基疏水链的延长，没食子酸酯类作用于细菌膜的作用增强；没食子酸辛酯(OG)对S.aureus呈现强抑制作用，最小抑菌浓度为32μg/mL；没食子酸月桂酯(DG)对S.aureus具有显著的抑制作用，最小抑菌浓度为16μg/mL；LU对S.aureus的最小抑菌浓度为32μg/mL。

[0026] 由于没食子酸烷基酯(n≤11)膜结合力随着烷基链长的增加而增加，其抗菌活性也随之增强。LU与没食子酸甲酯联合给药发挥协同抗菌作用。在LU与没食子酸酯类(乙酯～月桂酯)联合给药时，LU对S.aureus的最小抑菌浓度降低至0.5～4μg/mL，没食子酸酯类化合物的最小抑菌浓度降低为原来的1/2～1/4，发挥协同抗菌作用。因此，本申请所述没食子酸烷基酯类化合物与LU组合物可用于制备金黄色葡萄球菌抑制剂。该类药物组合可能在预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病(如化脓感染、肺炎、乳腺炎、肠炎、心内膜炎)的药物领域有巨大的潜在用途。

[0027] 与现有技术相比，本申请的没食子酸烷基酯类化合物与LU联合用药的应用至少具有下列有益效果之一：

[0028] 一方面，本申请提供一种没食子酸烷基酯类(AGs)抗菌增效剂；所述抗菌增效剂以LU为活性成分，与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

[0029] 另一方面，本申请提供没食子酸烷基酯类化合物与LU的组合药物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂或金黄色葡萄球菌感染性疾病(如化脓感染、肺炎、乳腺炎、肠炎、心内膜炎)治疗药物中的用途。所述药物以没食子酸烷基酯类化合物和LU组合药物为活性成分，与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

[0030] 再一方面，本申请提供没食子酸烷基酯类化合物与LU的联合用药，分别制成药物制剂，联合使用。

附图说明

[0031] 图1为实施例4中药敏板示意图。

具体实施方式

[0032] 下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0033] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

[0034] 上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了更清晰的了解本申请的技术手段，以下依据本发明的优选实施案例进行详细说明。

[0035] 下述抗菌活性测试例中，供试金黄色葡萄球菌为Newman S.aureus ATCC25904，获赠于中科院上海药物研究所。钙离子调节M‑H肉汤(CAMHB)和脑心浸液(BHI)琼脂培养基购买于上海索莱宝股份有限公司。立式压力蒸汽灭菌器(YXQ‑LS‑SII)和生化培养箱(SPX‑250B‑Z)为上海博讯实业有限公司生产；超净工作台(SW‑CJ‑2F)为苏州安泰空气技术有限公司生产；酶标仪(Cytation5)为美国伯腾仪器有限公司生产。

[0036] 实施例1：直接菌落悬液法配制菌悬液

[0037] 将Newman S.aureus ATCC 25904接种至BHI培养平板，于35℃培养18～24h。采用8
直接菌落悬液法，从平皿中挑选单个菌落在CAMHB肉汤中配制成浓度为(1～2)×10CFU/mL
6
的菌悬液。进而，用CAMHB肉汤稀释100倍，使工作菌悬液A浓度为(1～2)×10 CFU/mL(药敏
5
板中终浓度约为5×10 CFU/mL)。用CAMHB肉汤稀释200倍，使工作菌悬液B浓度约为5×
5
10CFU/mL。

[0038] 实施例2：没食子酸烷基酯类对金黄色葡萄球菌的抑制活性测试

[0039] 取无菌96孔板，于A行和H行孔加入盐水防止内部菌液挥发，B～G行为以下内容操作区域，每孔终体积为200μL。

[0040] 第1列加入200μL CAMHB，作空白对照；第2～12列加入100μL CAMHB：第2～11列为药物孔(n＝3)，2列孔加入1024μg/mL的受试药物100μL，3～11列孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为512、216、128、64、32、16、8、4、2、1……μg/mL。12列不含药物，加入与2列等量的DMSO作为阳性生长对照；最后于第2～12列加入工作菌悬液A 100μL。

[0041] 将药敏反应板置于35℃培养箱孵育16～20h，以无菌落生成的最低受试药浓度为最小抑菌浓度(MIC)。抗菌活性测定结果参见表1所示。

[0042] 以没食子酸甲酯(MG)、没食子酸乙酯(EG)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)和没食子酸月桂酯(DG)

[0043] 为例，其结构式如下：

[0044]

[0045] MG R＝CH3

[0046] EG R＝CH2CH3

[0047] DG R＝(CH2)11CH3

[0048] PG R＝(CH2)2CH3

[0049] OG R＝(CH2)7CH3

[0050] 表1.单体化合物的抗菌活性数据

[0051]

[0052]

[0053] 由表1可知，阳性对照甲氧西林和氯霉素对S.aureus的MIC值分别为2μg/mL和4μg/mL，符合标准；没食子酸甲酯(MG)和没食子酸乙酯(EG)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)呈现较弱的抑制作用，最小抑菌浓度均为512μg/mL；没食子酸丙酯(PG)对S.aureus呈现弱抑制作用，最小抑菌浓度为128μg/mL；没食子酸辛酯(OG)对S.aureus呈现强抑制作用，最小抑菌浓度为32μg/mL；没食子酸月桂酯(DG)对S.aureus具有较强的抑制作用，最小抑菌浓度为16μg/mL。表明，本申请所述没食子酸烷基酯类化合物对S.aureus具有不同程度的抑制作用，且在一定范围内(n≤11)随烷基疏水链的延长，没食子酸酯类抑菌作用逐步增强。

[0054] 实施例3：木犀草素(LU)对金黄色葡萄球菌的抑制活性测试

[0055] 取无菌96孔板，于A行和H行孔加入盐水防止内部菌液挥发，B～G行为以下内容操作区域，每孔终体积为200μL。

[0056] 第1列加入200μL CAMHB，作空白对照；第2～12列加入100μL CAMHB：第2～11列为药物孔(n＝3)，2列孔加入128μg/mL的受试药物100μL，3～11列孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125……μg/mL。12列不含药物，加入与2列等量的DMSO作为阳性生长对照；最后于第2～12列加入工作菌悬液A 100μL。

[0057] 将药敏反应板置于35℃培养箱孵育16h，以无菌落生成的最低受试药浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

[0058] 结果显示，LU对S.aureus的最小抑菌浓度为32μg/mL。表明，本申请所述LU对S.aureus具有一定的抑制作用。

[0059] 实施例4：木犀草素(LU)与没食子酸烷基酯类化合物联合用药对金黄色葡萄球菌的抑制活性测试

[0060] 采用棋盘式微量液基稀释法考察组合物的抗菌作用。

[0061] 取无菌96孔板，于A～H行的第1列孔加入液体培养基200μL，12列孔加入与2列等量DMSO的工作菌悬液B 100μL作为阳性生长对照；采用二倍稀释法于无菌EP管中配制A药不同5
浓度的菌液(5×10 CFU/mL)各1.5mL(例如LU：取2mg/mL LU的DMSO溶液129μL，加入CAMHB 
2871μL，配成86μg/mL的工作液3mL,采用二倍稀释法得系列浓度A药的菌液各1.5mL(86、43、
21.5、10.75、5.38、2.69μg/mL，对应药敏板中A～F行终浓度64、32、16、8、4、2μg/mL)。第2列孔加入含A药菌悬液148.8μL，3～11列孔加入含A药菌悬液100μL；向含A药的药敏反应板第2列孔加入B药(2mg/mL)51.2μL，采用二倍稀释法稀释至11列，则B药对应终浓度分别为512、
256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL。G～H行分别为A药和B药单用，第2列分别加入A药和B药，采用二倍稀释法稀释至11列。

[0062] 药敏板示意图如图1所示。

[0063] 将药敏反应板置于35℃培养箱孵育16h，以无菌落生成的最低受试药浓度为MIC。组合物活性结果用部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)评价，公式如下：

[0064]

[0065] 判定标准如表2。以LU分别和MG、EG、PG、OG和DG联合抗菌为例，测定结果参见表3所示。

[0066] 表2.联合药敏试验结果判定标准

[0067]

[0068] 表3.联合用药(AGs‑LU)的抗菌活性数据

[0069]

[0070] 由表3可知联合药敏结果如下：

[0071] 1)没食子酸甲酯‑木犀草素(MG‑LU)

[0072] 没食子酸甲酯(MG)的MICMG为512μg/mL，木犀草素(LU)的MICLU为32μg/mL，联合给药时MICMG‑LU为256μg/mL，MICLU‑MG为4μg/mL，计算得FICMG‑LU为0.62，故MG和LU相互作用为相加作用。

[0073] 2)没食子酸乙酯‑木犀草素(EG‑LU)

[0074] 没食子酸乙酯(EG)的MICEG为512μg/mL，木犀草素(LU)的MICLU为32μg/mL，联合给药时MICEG‑LU为128μg/mL，MICLU‑EG为4μg/mL，计算得FICEG‑LU为0.37，故EG和LU相互作用为协同作用。

[0075] 3)没食子酸丙酯‑木犀草素(PG‑LU)

[0076] 没食子酸丙酯(PG)的MICPG为128μg/mL，木犀草素(LU)的MICLU为32μg/mL，联合给药时MICPG‑LU为32μg/mL，MICLU‑PG为4μg/mL，计算得FICPG‑LU为0.37，故PG和LU相互作用为协同作用。

[0077] 4)没食子酸辛酯‑木犀草素(OG‑LU)

[0078] 没食子酸辛酯(OG)的MICOG为32μg/mL，木犀草素(LU)的MICLU为32μg/mL，联合给药时MICOG‑LU为8μg/mL，MICLU‑OG为4μg/mL，计算得FICOG‑LU为0.37，故OG和LU相互作用为协同作用。

[0079] 5)没食子酸月桂酯‑木犀草素(DG‑LU)

[0080] 没食子酸月桂酯(DG)的MICDG为16μg/mL，木犀草素(LU)的MICLU为32μg/mL，联合给药时MICDG‑LU为4μg/mL，MICLU‑DG为0.5μg/mL，计算得FICDG‑LU为0.27，故DG和LU相互作用为协同作用。

[0081] 结果表明，本申请所述木犀草素(LU)在分别与没食子酸烷基酯类化合物(乙酯～月桂酯)联合给药时，能不同程度地提高各自对S.aureus的生长抑制活性，发挥协同作用，组合药物(AGs‑LU)中各成分优选终浓度见表4。

[0082] 表4.组合药物(AGs‑LU)中各成分优选终浓度

[0083]

[0084] 综上，本申请所述没食子酸烷基酯类化合物(包含没食子酸乙酯、没食子酸丙酯……没食子酸十二烷基/月桂酯)与LU的组合药物可用于制备金黄色葡萄球抑制剂，在制备预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病(如化脓感染、肺炎、乳腺炎、肠炎、心内膜炎)的药物领域有巨大的潜在价值。

[0085] 以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。