一种TNIK抑制剂及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种TNIK抑制剂及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的系列化合物在体外对Traf2与Nck相互作用丝氨酸激酶(TNIK)具有良好的抑制活性，同时本发明的系列化合物在治疗结直肠癌方面具有显著作用，因此，本发明的系列化合物为本领域中的TNIK抑制剂的开发、抗肿瘤、抗炎症疾病的开发提供了新的选择，具有很好的应用前景。

权利要求

1.式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

n＝0、1；

环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、C1～C3烷氧基、C1～C3烷基、卤素取代的C1～C3烷氧基、卤素取代的C1～C3烷基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H、苯基；

R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述取代的6～10元芳基含有至少一个选自下组的取代基：‑NH2、卤素、氰基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或R2选自C1～C3烷氧基，L为‑C(O)NH‑；或者，R2和L组合成环B，环B选自未取代的5～7元杂环酮基、C1～C6烷基取代的5～7元杂环酮基、未取代的5元芳基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；所述杂芳基含有1杂原子，所述杂原子为N或O；环A通过化学键与环B上的N相连。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式Ⅱ结构：环A通过化学键与环B上的N相连；

环B选自未取代的5～7元杂环酮基、C1～C6烷基取代的5～7元杂环酮基、未取代的5元芳基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；所述杂芳基含有1杂原子，所述杂原子为N或O。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，

环B选自未取代的5～7元杂环酮基、C1～C3烷基取代的5～7元杂环酮基、未取代的吡咯基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O。

4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，

环B选自

5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，

环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、苯基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H。

6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，

环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有1～2个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、苯基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H。

7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式Ⅲ结构：R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述取代的6～10元芳基含有至少一个选自下组的取代基：‑NH2、卤素、氰基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或

8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，

R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述取代的6～10元芳基含有1～2个选自下组的取代基：‑NH2、卤素、氰基、甲氧基、甲基、乙基、 ‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或

9.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，

R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述6～10元芳基选自所述取代的6～10元芳基含有1～2个选自下组

的取代基：‑NH2、卤素、氰基、甲氧基、甲基、乙基、 ‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基并五元杂环基为 所述六元芳基并六元杂环酮基为

10.根据权利要求1～9任一项所述的化合物，其特征在于，具有以下结构：

11.权利要求1～10任一项所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：其中，n＝0、1；

环A、R1、R2、L如权利要求1～9任一项所定义；

(1)化合物1溶于有机溶剂后与碱，化合物2反应，即得到化合物3；

(2)化合物3，联硼酸频那醇酯，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得到化合物4；

(3)化合物4，化合物5，钯催化剂，碱和配体加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得到式Ⅰ所示的化合物；

步骤(1)中，所述碱选自氢化钠；

步骤(2)中，所述碱选自乙酸钾；

步骤(2)中，所述钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,

1'‑双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

步骤(3)中，所述钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,

1'‑双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

步骤(3)中，所述碱选自DIEA、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种；

步骤(3)中，所述配体为三环己基膦。

12.根据权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃；

步骤(1)中，所述化合物1、碱与化合物2的摩尔比为1.0：2.5～3.2：1～1.2；

步骤(1)中，所述化合物1先与碱于0±3℃反应0.5～0.7h，然后与化合物2于50±5℃反应6～8h；

步骤(2)中，所述溶剂选自无水二氧六环；

步骤(2)中，所述化合物3、联硼酸频那醇酯和碱的摩尔比为1.0：3.0～3.2：3.0～3.2；

步骤(2)中，所述惰性气体为氩气；

步骤(2)中，所述反应的温度为90～100℃；

步骤(2)中，所述反应的时间为12～15h；

步骤(3)中，所述溶剂选自二氧六环或二氧六环与水的混合溶剂；

所述混合溶剂中二氧六环与水的体积比为10：1；

步骤(3)中，所述化合物4和化合物5的摩尔比为1.0：1.0；

步骤(3)中，反应温度为100～110℃；

步骤(3)中，反应时间为10～15h；

步骤(3)中，所述惰性气氛为氩气。

13.权利要求1～10任一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备TNIK抑制剂类药物中的用途。

14.权利要求1～10任一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

15.根据权利要求14所述用途，其特征是，所述癌症为结直肠癌。

16.药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1～10任一项所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

说明书

一种TNIK抑制剂及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种TNIK抑制剂及其制备方法和用途，属于医药领域。

背景技术

[0002] Traf2与Nck相互作用丝氨酸激酶(TNIK)属于胚中心激酶家族(GCKs)的一员，参与细胞骨架的构成和神经数突细胞的伸展过程。NF‑κB系统几乎存在于所有细胞中，它涉及多种重要的细胞功能的调节，如细胞存活、生长及免疫反应。TNIK对于经典NF‑κB信号通路及JNK信号通路都是必须的。因而TNIK被作为抗肿瘤靶标被广泛研究。据文献报道，TNIK激酶在各种癌细胞系和组织中过表达，与不良预后密切相关。

[0003] 结直肠癌是导致癌症患者死亡的一个重要原因，全世界每年有大约70万人死于该病。其中超过90％的结直肠癌携带Wnt信号途径的体细胞突变，比如APC肿瘤抑制基因，导致Wnt信号途径的持续性激活。这反过来导致癌症干细胞的产生，癌症干细胞是肿瘤抵抗传统化疗的一个本质性因素。因此阻断Wnt信号途径的治疗方法可能是清除癌症干细胞治愈该疾病的关键。尽管已经获得了许多研发数据，但是至今仍然没有Wnt抑制药物可以用于临床实践。研究发现，TNIK是调节TCF4/β‑catenin的一种重要的调控因子。TNIK在Wnt信号途径的最下游发挥调控作用。因而，TNIK可以作为调控Wnt通路针对结直肠癌开发靶向药物的新靶标。

[0004] 现有针对于结直肠癌治疗的上市药物，从传统的一线化疗药物，到单抗类的贝伐珠、西妥昔，再到替尼类的瑞戈非尼，都伴随着治愈率低、毒副作用高、个体化差异明显的问题。开发新型结直肠癌药物是当前亟待NIK通过调控Wnt信号解决的问题。TNIK抑制剂通过调控Wnt信号，进一步抑制结直肠癌细胞的增殖是一条新的途径。同时，即使结直肠癌细胞中存在APC基因突变，对TNIK的药物学抑制仍然有望阻断该信号途径。因此，开发TNIK小分子抑制剂并用于结直肠癌等肿瘤在临床上具有重要的应用价值。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种TNIK抑制剂及其制备方法和用途。

[0006] 本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

[0007]

[0008] n＝0、1；

[0009] 环A选自取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基；

[0010] R1选自取代或未取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述五元杂环基和六元杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；

[0011] R2选自C1～C3烷氧基，L为‑C(O)NH‑；或者，R2和L组合成环，所述环为取代或未取代的5～7元杂环酮基、取代或未取代的5～6元杂芳基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；所述杂芳基含有1～2个杂原子，所述杂原子为N或O。

[0012] 其中，上述的化合物具有式Ⅱ结构：

[0013]

[0014] 环A通过化学键与环B上的N相连；

[0015] 环B选自未取代的5～7元杂环酮基、取代的5～7元杂环酮基、未取代的5～6元杂芳基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；所述杂芳基含有1～2个杂原子，所述杂原子为N或O；

[0016] 优选的，环B选自未取代的5～7元杂环酮基、C1～C6烷基取代的5～7元杂环酮基、未取代的5元芳基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；所述杂芳基含有1杂原子，所述杂原子为N或O；

[0017] 更优选的，环B选自未取代的5～7元杂环酮基、C1～C3烷基取代的5～7元杂环酮基、未取代的吡咯基；所述杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；

[0018] 最优选的，环B选自

[0019] 其中，上述的化合物，环A选自未取代的3～6元环烷基、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、卤素取代的C1～C6烷氧基、卤素取代的C1～C6烷基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H、苯基；

[0020] 优选的，环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、C1～C3烷氧基、C1～C3烷基、卤素取代的C1～C3烷氧基、卤素取代的C1～C3烷基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H、苯基；

[0021] 更优选的，环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、苯基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H；

[0022] 最优选的，环A选自环己烷、取代的苯基，所述取代的苯基含有1～2个选自下组的取代基：卤素、硝基、氰基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、苯基、‑C(O)OCH3、‑C(O)H。

[0023] 其中，上述的化合物具有式Ⅲ结构：

[0024]

[0025] R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述五元杂环基和六元杂环酮基的环上含有1～2个杂原子，杂原子为N或O；

[0026] 优选的，R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或

[0027] 进一步优选的，R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述取代的6～10元芳基含有至少一个选自下组的取代基：‑NH2、卤素、氰基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、 ‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或[0028] 更优选的，R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述芳基含有0～3个杂原子，杂原子为N或O；所述取代的6～10元芳基含有1～2个选自下组的取代基：‑NH2、卤素、氰基、甲氧基、甲基、乙基、‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基为苯基或吡啶基；所述五元杂环基为1,3‑二氧五环基或四氢吡咯基；所述六元杂环酮基为2‑氮己环酮基、3‑吗啉酮基或[0029] 最优选的，R1选自未取代的6～10元芳基、取代的6～10元芳基、六元芳基并五元杂环基、六元芳基并六元杂环酮基，所述6～10元芳基选自
所述取代的6～10元芳基含有1～2个选自下组的取代基：‑NH2、卤
素、氰基、甲氧基、甲基、乙基、 ‑C(O)H、‑C(NH2)＝N‑OH；所述六元芳基并五元杂环基为 所述六元芳基并六元杂环酮基为

[0030] 其中，上述的化合物，具有以下结构：

[0031]

[0032]

[0033]

[0034]

[0035]

[0036] 本发明还提供了上述化合物的制备方法，其合成路线为：

[0037]

[0038] (1)化合物1溶于有机溶剂后与碱，化合物2反应，即得到化合物3；

[0039] (2)化合物3，联硼酸频那醇酯，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得到化合物4；

[0040] (3)化合物4，化合物5，钯催化剂，碱和配体加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得到式Ⅰ所示的化合物。

[0041] 进一步的，上述的制备方法满足以下至少一项：

[0042] 步骤(1)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃；

[0043] 步骤(1)中，所述碱选自氢化钠；

[0044] 步骤(1)中，所述化合物1、碱与化合物2的摩尔比为1.0：2.5～3.2：1～1.2；

[0045] 步骤(1)中，所述化合物1先与碱于0±3℃反应0.5～0.7h，然后与化合物2于50±5℃反应6～8h；

[0046] 步骤(2)中，所述碱选自乙酸钾；

[0047] 步骤(2)中，所述钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'‑双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

[0048] 步骤(2)中，所述溶剂选自无水二氧六环；

[0049] 步骤(2)中，所述化合物3、联硼酸频那醇酯和碱的摩尔比为1.0：3.0～3.2：3.0～3.2；

[0050] 步骤(2)中，所述惰性气体为氩气；

[0051] 步骤(2)中，所述反应的温度为90～100℃；

[0052] 步骤(2)中，所述反应的时间为12～15h；

[0053] 步骤(3)中，所述钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'‑双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

[0054] 步骤(3)中，所述碱选自DIEA、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种；

[0055] 步骤(3)中，所述配体为三环己基膦；

[0056] 步骤(3)中，所述溶剂选自二氧六环或二氧六环与水的混合溶剂；

[0057] 优选地，所述混合溶剂中二氧六环与水的体积比为10：1；

[0058] 步骤(3)中，所述化合物4和化合物5的摩尔比为1.0：1.0；

[0059] 步骤(3)中，反应温度为100～110℃；

[0060] 步骤(3)中，反应时间为10～15h；

[0061] 步骤(3)中，所述惰性气氛为氩气。

[0062] 本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备TNIK抑制剂类药物中的用途。

[0063] 本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选的，所述癌症为结直肠癌。

[0064] 本发明还提供了一种药物组合物，它是以上述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

[0065] 术语定义：

[0066] 本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

[0067] 术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C1～C6烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3‑戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3‑甲基‑2‑丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。除非另外指明，否则烷基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。在一些实施方案中，所述C1～C6烷基是被卤素(氟、氯、溴、碘)取代的C1～C6烷基。在C1～C6烷基被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。

[0068] 术语“烷氧基”是指基团‑OR，其中R是上文所定义的烷基。C1～C6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2‑二甲基丁氧基。除非另外指明，否则烷氧基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，R是被卤基(氟、氯、溴、碘)取代的烷基。所述C1～C6烷氧基在R被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。

[0069] 术语“杂环酮基”是指羰基碳原子包括在杂环烷基内的饱和环酮。

[0070] 术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)。

[0071] 术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

[0072] 术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

[0073] 本发明的某些实施方式中，包括了同位素标记的化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入本发明化合物中的2 3 13 14 15 17 18 35
同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即H,H、C、C、N、O、O、S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的本发明化合物以及该化合物的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。

[0074] 本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

[0075] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

[0076] 固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

[0077] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3‑丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

[0078] 除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

[0079] 除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

[0080] 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

[0081] 用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

[0082] 本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质，该物质的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅料与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

[0083] 本发明提供了苯并氧氮杂卓酮类衍生物，并提供了本发明苯并氧氮杂卓酮类衍生物的简便、高效、成本低廉的制备方法。本发明的系列化合物在体外对Traf2与Nck相互作用丝氨酸激酶(TNIK)具有良好的抑制活性，同时本发明的系列化合物在治疗结直肠癌方面具有显著作用，因此，本发明的系列化合物为本领域中的TNIK抑制剂的开发、抗肿瘤、抗炎症疾病的开发提供了新的选择，具有很好的应用前景。

附图说明

[0084] 图1为化合物6的激酶选择性树图；

[0085] 图2为化合物6对TNIK信号通路的蛋白质印迹图；

[0086] 图3为化合物6对HCT116细胞克隆的抑制图；

[0087] 图4为化合物6对HUVECs细胞的划痕图；

[0088] 图5为化合物6抑制HUVEC细胞Transwell迁移图；

[0089] 图6为化合物6抑制HUVEC细胞的管腔图；

[0090] 图7为化合物6的抗肿瘤生长效果图；

[0091] 图8为化合物6给药后动物体重变化图。

具体实施方式

[0092] 本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

[0093] 实施例1 4–(3–甲氧基苄基)–8–(1H–吡咯并[2,3–b]吡啶–5–基)–3,4–二氢–1,4–苯并氧氮杂卓–5(2H)–酮(化合物38)的制备

[0094]中间体1：8–溴–3,4–二氢–1,4–苯并氧氮杂卓–5(2H)–酮的制备。

[0095]

[0096] 将原料1(7–溴–4–二氢色原酮1.0g，4.40mmol)、叠氮钠(858.97mg，13.21mmol)和二氯甲烷(80mL)置于圆底烧瓶常温搅拌，逐滴加入甲烷磺酸(9mL)，反应24h后，分别用水、饱和氯化钠萃取，硫酸镁干燥有机相后抽滤、柱层析得白色固体。收率85％。

[0097] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.41(d,J＝6.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.5Hz,1H),7.31(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.24(d,J＝1.9Hz,1H),4.36–4.28(m,2H),3.33(q,J＝5.1Hz,2H).[0098] 中间体2：8–溴–4–(3–甲氧基苄基)–3,4–二氢–1,4–苯并氧氮杂卓–5(2H)–酮的制备。

[0099]

[0100] 将中间体1(1g，4.13mmol)溶于无水四氢呋喃(40mL)，0度条件下缓慢加入氢化钠(297.52mg，12.39mmol)，反应0.5h后，加入3–甲氧基苄溴(578μL，4.13mmol)，反应0.5h后由0度转移至50度下反应6h，冷却后柱层析得白色固体。收率98％。

[0101] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.82(d,J＝2.6Hz,1H),7.64(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),7.28(t,J＝8.1Hz,1H),7.00(d,J＝8.6Hz,1H),6.93–6.88(m,2H),6.88–6.83(m,1H),4.72(s,2H),4.28–4.20(m,2H),3.74(s,3H),3.54(t,J＝5.0Hz,2H).

[0102] 中间体3：8–硼酸频哪醇酯–4–(3–甲氧基苄基)–3,4–二氢–1,4–苯并氧氮杂卓–5(2H)–酮的制备。

[0103]

[0104] 将中间体2(1g，2.76mmol)、联硼酸频那醇酯(2.103g，8.28mmol)、[1,1'–双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(303mg，0.414mmol)和乙酸钾(812.8mg，8.28mmol)溶于无水二氧六环(60mL)，在氩气环境、95度下反应12h，反应液垫硅藻土抽滤、柱层析得白色固体。收率70％。

[0105] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.47(dd,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.31–7.25(m,2H),6.94–6.89(m,2H),6.88–6.84(m,1H),4.72(s,2H),4.21(t,J＝5.2Hz,
2H),3.74(s,3H),3.48(t,J＝5.2Hz,2H),1.30(s,12H).

[0106] 化合物38：4–(3–甲氧基苄基)–8–(1H–吡咯并[2,3–b]吡啶–5–基)–3,4–二氢–1,4–苯并氧氮杂卓–5(2H)–酮的制备。

[0107]

[0108] 将中间体3(100mg，244.3μmol)、5–溴–7–氮杂吲哚(48.14mg，244.3μmol)[1,1'–双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(59.86mg，73.29μmol)、三环己基膦(6.85mg，24.43μmol)和碳酸铯(238.8mg，7.329mmol)溶于二氧六环(10mL)和水(1mL)中，在氩气环境、100度下反应12h，冷却后柱层析得淡黄色固体。收率50％。

[0109] 1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ11.76(s,1H),8.57(d,J＝1.9Hz,1H),8.28(d,J＝1.7Hz,1H),7.82(d,J＝8.1Hz,1H),7.59–7.51(m,2H),7.38(s,1H),7.31–7.26(m,1H),6.93(d,J＝6.9Hz,2H),6.87(d,J＝9.2Hz,1H),6.55–6.48(m,1H),4.76(s,2H),4.29(t,J＝
4.9Hz,2H),3.75(s,3H),3.58(t,J＝4.7Hz,2H).

[0110] 其余化合物的制备方法同化合物38的制备相似，表1为化合物的氢谱数据。

[0111] 表1化合物1H NMR

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123] 试验例1、化合物药理活性评价

[0124] 1、苯并氧氮杂卓酮类衍生物的体外激酶实验

[0125] 体外激酶试验采用Eurofins公司提供的Kinase Profiler服务完成。实验方法简述如下：将待测系列小分子化合物10μM、TNIK激酶、与包含底物、10mM醋酸镁和[γ‑33P‑ATP]的缓冲液共同孵育，通过加入Mg\ATPmix以开始反应，在室温下孵育一段时间后，向缓冲液中加入3％的磷酸盐溶液以终止反应。随后定量吸取10μL反应混合液滴在P30滤纸上，并用75mM的磷酸盐溶液清洗3次，再用甲醇清洗一次，将P30滤纸晾干后加入闪烁液进行闪烁计数。化合物的抑制活性用酶活抑制率来表示，结果见表2。

[0126] 表2、苯并氧氮杂卓酮类化合物TNIK的单浓度抑制活性

[0127] 化合物 10μM@TNIK 序号 10μM@TNIK 化合物 10μM@TNIK1 + 33 ++ 65 +
2 +++ 34 ++ 66 +
3 ++ 35 ++++ 67 ++
4 ++++ 36 ++ 68 +
5 ++++ 37 +++ 69 +++
6 ++++ 38 +++ 70 +++
7 +++ 39 +++ 71 ++++
8 ++ 40 ++ 72 +++
9 ++++ 41 + 73 +++
10 ++ 42 ++ 74 +
11 ++++ 43 ++++ 75 +++
12 +++ 44 + 76 +
13 +++ 45 ++ 77 ++
14 ++ 46 ++ 78 +
15 ++ 47 ++++ 79 +
16 + 48 ++++ 80 +
17 + 49 ++ 81 +
18 + 50 + 82 +
19 +++ 51 + 83 +
20 ++++ 52 + 84 +
21 +++ 53 + 85 +++
22 ++++ 54 +++ 86 +
23 ++++ 55 + 87 +
24 + 56 ++++ 88 +
25 + 57 +++ 89 +
26 + 58 + 90 ++
27 ++ 59 ++ 91 +
28 ++ 60 + 92 +
29 ++ 61 ++++ 93 +
30 ++ 62 ++++ 94 +
31 + 63 ++++ 95 ++
32 ++++ 64 ++++ 96 +++

[0128] 注：++++代表抑制率≧100％，+++代表100％>抑制率≧90％，++代表90％>抑制率≧50％，+代表抑制率<50％。

[0129] 2、激酶选择性实验

[0130] 首先将化合物6在浓度为10μM的条件下对Eurofins公司现有的413种激酶(含突变体)进行单浓度抑制率的筛选试验，结果如表3所示。根据表3的数据绘制了化合物6的选择性图谱，如图1所示，红色圆形斑点表示有抑制活性的激酶，其中，红色斑点的半径越大，说明酶抑制活性越高，反之越小，由表3和图1可得出化合物6对TNIK具有很高的激酶选择性。

[0131] 表3化合物6对413种激酶(含突变体)单浓度抑制活性

[0132]

[0133]

[0134]

[0135]

[0136]

[0137] 试验例2、细胞水平测试

[0138] (1)实验材料

[0139] 本试验例以上述实施例提供的TNIK小分子化合物，具体化学结构为苯并氧氮杂卓酮骨架，来测试本发明受试化合物对于抑制HCT116细胞的生物活性。

[0140] 胎牛血清(Cell box)；RPMI‑1640细胞培养基(Gibco)；HCT116细胞；康宁(corning)96孔培养板(Corning Incorporated)；生理盐水(四川科伦)；MTT(sigma)；二氧化碳培养箱(Thermo Scientific)；二甲基亚砜(Sinophma chemical reagent company)；化学发光仪(Promega)；100mm细胞培养皿(Jet Biofil)；涡旋混匀器(Crystac)。

[0141] (2)实验方法：

[0142] 具体步骤如下：

[0143] ①将HCT116细胞增殖于100mm培养皿在生长基(以RPMI‑1640+10％胎牛血清为培养液)中进行培养(37℃，5％二氧化碳)，直至细胞充分贴壁生长；

[0144] ②吸除100mm培养皿中的培养基，以胰蛋白酶消化细胞后，再将细胞接种在康宁96孔细胞培养板上，浓度为30000细胞/mL(即3000细胞/孔)，每个板边孔用200μL的生理盐水填充(即只有中间60个孔加入100μL含细胞培养基)；

[0145] ③在37℃，5％二氧化碳条件下，将细胞在96孔板中培养24小时；

[0146] ④用DMSO溶解受试化合物，配置100mM(即100mmol/L)母液，使用细胞培养基千倍稀释上面所配置的化合物溶液，配成的溶液再用细胞培养基三倍稀释6次，即得到含化合物浓度为100μM，33.3μM，11.1μM，3.7μM，1.2μM，0.4μM的溶液，各取上述溶液100μL加入上述已有细胞的96孔板中，同时做3个复孔，每个板留6个孔只加100μL细胞培养基；

[0147] ⑤在37℃，5％二氧化碳条件下，培养72小时；

[0148] ⑥72小时后，向96孔细胞板中加入20μL已配好的MTT溶液(5mg/mL，生理盐水配制，超声溶解，滤膜过滤，4℃保存)，在37℃、5％CO2的孵箱中放置2h。

[0149] ⑦2h后，将96孔板中的液体甩掉，并于每孔中加入150μL的二甲基亚砜溶液，在摇床上摇5‑10min后用酶标仪检测570nm波长下的吸光度。

[0150] 使用以下方法计算细胞存活率：

[0151] 存活率＝[(加药组吸光值‑空白吸光值)/(对照不诱导‑空白吸光值)]*100％；

[0152] 化合物抑制率＝1‑存活率；

[0153] 数据处理：用Graphpad Prism 5.0软件拟合增殖抑制曲线，并计算半数抑制浓度。结果件表4。

[0154] 表4、苯并氧氮杂卓酮类化合物对HCT116细胞抑制活性

[0155]化合物 HCT116 IC50 序号 HCT116 IC50 化合物 HCT116 IC50
1 + 33 +++ 65 ++
2 ++++ 34 ++ 66 +
3 + 35 ++++ 67 ++
4 ++++ 36 ++ 68 +
5 ++++ 37 ++++ 69 +++
6 ++++ 38 ++++ 70 ++
7 ++++ 39 +++ 71 ++++
8 ++ 40 ++ 72 ++
9 +++ 41 ++ 73 ++
10 + 42 ++ 74 ++
11 +++ 43 ++++ 75 +++
12 ++ 44 + 76 +
13 +++ 45 +++ 77 ++
14 +++ 46 ++ 78 ++
15 ++ 47 ++++ 79 ++
16 ++ 48 ++++ 80 ++
17 + 49 ++ 81 +
18 + 50 ++ 82 ++
19 +++ 51 ++ 83 +
20 +++ 52 + 84 +
21 ++ 53 + 85 ++++
22 ++++ 54 ++ 86 +
23 ++++ 55 + 87 +
24 + 56 ++++ 88 ++++
25 + 57 +++ 89 +
26 + 58 + 90 +++
27 +++ 59 +++ 91 ++++
28 +++ 60 + 92 +
29 ++ 61 ++++ 93 ++++
30 +++ 62 +++ 94 ++++
31 + 63 ++ 95 ++
32 +++ 64 ++++ 96 ++++

[0156] 注：++++代表10μM>IC50≧1μM，+++代表30μM>IC50≧10μM，++代表100μM>IC50≧30μM，+代表IC50>100μM。

[0157] 试验例3、本发明化合物6对TNIK信号通路的作用机制

[0158] 1)实验材料

[0159] RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，PMSF蛋白酶抑制剂购自Sigma公司，十二烷基磺酸钠SDS、甘氨酸、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷Tris、过硫酸铵APS、N，N，N'，N'‑四甲基乙二胺TEMED、羧甲基纤维素钠均购自Sigma公司。

[0160] 2)实验方法

[0161] 细胞总蛋白的提取：在细胞上清中加入相应浓度的化合物6或空白溶剂处理细胞一定时间后，弃尽上清，用预冷的PBS或生理盐水洗三次，再加入适当体积的RIPA裂解液(含1％cocktail和1％PMSF蛋白酶抑制剂)立即置于冰上平放裂解15min，15min后将细胞裂解液用刮刀刮下转移至1.5ml的EP管中，用超声破碎仪破碎细胞。随后将离心管置于低温高速离心机中离心(12000rpm，15min)以除去细胞碎片。再用BCA法进行蛋白定量，并用蛋白标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度，再通过计算将各组蛋白样品浓度调平，加入5x蛋白上样缓冲液后置于100℃干式恒温器中保持10min。随后直接上样电泳或分装后或分装后保存于‑20℃备用。蛋白样品避免反复冻融。

[0162] 蛋白样品制备好后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶制胶配方如表5所示，一般采用10％的分离胶进行分离。电泳分离后，用槽式湿转法将蛋白充分转移至PVDF膜上，然后将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉(脱脂奶粉用TBS/T配制)中室温封闭2h以上，按照所需蛋白的分子量取得含相应蛋白的PVDF膜带，按抗体说明书推荐的稀释比例稀释一抗并在4℃孵育蛋白条带过夜。次日，取出各条带，用TBS/T缓冲液漂洗(5min，3次)后加入1:10000稀释的HRP标记的二抗，在37℃下摇动孵育1h，随后用TBS/T洗脱除去过量抗体，在PVDF膜上均匀滴加HRP底物后，置于快速凝胶成像系统中显影并拍照。

[0163] 表5 SDS‑PAGE中分离胶和浓缩胶配方

[0164]试剂 6％浓缩胶(mL) 10％分离胶(mL)
超纯水 1.4 1.9
30％丙烯酰胺 0.33 1.7
1.5mol/L Tris‑HCl － 1.3
1.0mol/L Tris‑HCl 0.25 －
10％SDS 0.02 0.05
10％过硫酸铵 0.02 0.05
TEMED 0.002 0.002
Total 2 5

[0165] 实验结果：实验结果如图2所示，化合物6能够有效下调AXIN、CMYC、LPR6的表达水平。

[0166] 试验例4本发明化合物6对HCT116细胞克隆形成的作用

[0167] 1)实验材料

[0168] 12孔板购自Corning公司，PBS粉末购自赛维尔生物，4％多聚甲醛购自武汉谷歌生物，结晶紫溶液购自碧云天生物技术研究所。

[0169] 2)实验方法

[0170] 取对数生长的细胞适量的铺在12孔板中，置于37℃5％CO2的细胞培养箱中，每三天加入含有相应浓度的化合物6或空白溶剂的培养基，经常观察，当培养基出现肉眼可见的克隆时终止培养。

[0171] 弃去上清，用PBS轻洗2次，用4％多聚甲醛固定活体细胞20分钟，用0.5％结晶紫溶液染色10分钟，用PBS轻洗3次。空气干燥后用数码相机拍摄照片。

[0172] 实验结果：实验结果如图3所示，化合物6在5‑10μM能够有效抑制HCT116细胞克隆形成。

[0173] 试验例5本发明化合物6抑制HUVEC细胞迁移的作用

[0174] 1)实验材料

[0175] DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，青、链霉素购自Hyclone公司，HUVEC细胞购自ATCC。

[0176] 2)实验方法

[0177] HUVEC细胞采用DMEM+10％FBS+青/链霉素培养基培养。收集对数生长期的HUVEC细胞，接种于12孔板，于37℃、5％CO2条件下培养过夜。第二日，细胞融合度为90％以上。用无菌黄色吸头将细胞划出一条直线，用无血清培养基轻轻清洗细胞3次，以去除培养基中漂浮的细胞。加入含不同浓度化合物6(10μM，3.3μM，1.1μM)或DMSO(0.1％)的培养基(含0.5％胎牛血清)，每组设置3个复孔。立即于显微镜下拍照记录划痕宽度，此时为0h。继续在37℃、5％CO2条件下培养12h及24h。于显微镜下观察拍照12h及24h时各孔划痕宽度。

[0178] 3)实验结果

[0179] 图4显示移液枪划痕后继续培养HUVECs细胞12h，24h后，与对照组(0μM，予以溶剂DMSO)相比，药物干预组细胞迁移率显著降低。

[0180] 试验例6本发明化合物6抑制HUVEC细胞Transwell迁移实验

[0181] 1)实验材料

[0182] DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，青、链霉素购自Hyclone公司，HUVEC细胞购自ATCC，Transwell小室购自Millipore。

[0183] 2)实验方法

[0184] 细胞接种至上层小室：将培养基重悬的浓度为1×104细胞/ml的细胞悬液接种至上层小室内，加入化合物6计算调整药物终浓度为10μM，0μM。下层小室加入800μl完全细胞培养液，置于培养箱(37℃，5％CO2)中继续孵育。

[0185] 24h后取出孔板，1×PBS清洗5分钟×3次，加入4％多聚甲醛，室温固定半小时，1×PBS清洗5分钟×3次，0.1％结晶紫染色半小时。1×PBS洗去多余染色液，棉签擦去培养皿底部上室面未穿过膜细胞，倒置显微镜采集图像。HUVEC细胞穿膜面积即结晶紫阳性区域。

[0186] 3)实验结果

[0187] 图5显示Transwell迁移实验经药物干预后穿过PET膜迁移到下室的内皮细胞数明显小于对照组，说明化合物6对内皮细胞迁移存在抑制作用。

[0188] 试验例7本发明化合物6抑制HUVEC细胞管腔形成的作用

[0189] 1)实验材料

[0190] DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，青、链霉素购自Hyclone公司，HUVEC细胞购自ATCC，Matrigel基质胶购自BD公司。

[0191] 2)实验方法

[0192] Matrigel胶自‑20℃冰箱取出，预置4℃冰箱过夜使之成液态。预冷枪头抽吸、铺被到预冷的96孔板中，每孔50μl，37℃、5％CO2孵箱中放置30min使其凝固。操作尽量冰上进行，动作轻柔，避免气泡注入胶中。

[0193] 将饥饿培养的HUVEC细胞胰酶消化，PBS洗涤2次，重悬计数，调整至1×104个/孔，加入化合物6调整终浓度至10μM，3.3μM，1.1μM，0μM，每孔接种50μl细胞悬液，37℃，5％CO2孵箱中继续孵育。分别于2、4、6、8小时在倒置显微镜下观察管腔形成长度。

[0194] 3)实验结果

[0195] 图6显示了不同浓度化合物干预作用下，Matrigel胶上培养的HUVECs所形成的三维管腔样结构，与对照组相比(0μM，予以溶剂DMSO)相比，药物干预组内皮细胞管腔形成明显减少，且存在剂量依赖性。

[0196] 试验例7本发明化合物6抗肿瘤生长效果

[0197] 1)实验材料

[0198] 6周龄的NOD‑SCID雌性小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。所有动物均饲养在无特定病原体的设施中。

[0199] 2)实验方法

[0200] 本文中有关动物处理，护理和治疗的程序均按照四川大学实验动物管理委员会的协议执行。收集在对数生长期的HCT116细胞，并用无血清培养基洗涤3次并计数重悬。将5×6 3
10个细胞皮下接种于小鼠的右胁腹，进行肿瘤发育。当肿瘤长到合适大小时(100–120mm)，将小鼠随机分为四组(每组5只)，分别口服灌胃给药：对照组(溶剂：10％DMSO、40％PEG300、
5％吐温80、45％无菌PBS)，低剂量测试化合物组(化合物6,100mg/kg,bid),高剂量测试化合物组(化合物6,150mg/kg,bid)，阳性化合物组(甲苯咪唑，100mg/kg,bid)。每隔一天测量小鼠的体重，每三天测量一次肿瘤大小。体积的计算如下：肿瘤大小＝l×w2/2(l,长直径；
w,短直径)。用Graph‑Pad Prism 5.0软件拟合肿瘤大小‑时间曲线及体重‑时间曲线。

[0201] 3)实验结果

[0202] 如图7所示，口服化合物6对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖性，小鼠口服150mg/kg的化合物6时肿瘤生长明显受到抑制。据报道甲苯咪唑具有抑制TNIK的作用，我们用其作为阳性对照，甲苯咪唑在给药后体重迅速减轻，并且在给药3‑4天后开始死亡，故停止给药。在治疗期间，化合物6给药组体重没有明显下降(图8)，也没有观察到其他副作用。