猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽及其制备方法和应用，抗菌肽TP(i+4)5的序列如SEQ ID No.1所示。选取猪源TP肽，在氢键形成位置(i，i+4)处用赖氨酸替换猪源TP肽的亲水面的成对氨基酸，得到一条效果最优肽TP(i+4)1，2，在其基础上再用色氨酸替换(i，i+4)处位置氨基酸以增加抗菌肽的疏水面，得到具有高活性、低毒性，高稳定性的抗菌肽TP(i+4)5，同时具有较低的溶血活性；并且公开该抗菌肽TP(i+4)5在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病的抗菌药物中的应用。本发明的抗菌肽具有成为高效抗生素替代品的发展潜力。

权利要求

1.一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5的制备方法，其特征在于，方法如下：基于α‑螺旋折叠原理，以猪源TP肽为模板，在氢键形成处：(i，i+4)位置用正电荷赖氨酸取代猪源TP肽的N5、G9、G13位置的氨基酸，形成肽TP(i+4)1，2，在其基础上，用色氨酸取代T8、A12位置的氨基酸，并在C端酰胺化，形成肽TP(i+4)5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，最后利用固相化学合成法和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

3.根据权利要求1所述的一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+

4)5在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病的抗菌药物中的应用。

说明书

猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽及其制备方

法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 抗生素的过度使用和不当使用促进了药物残留和细菌耐药性的出现，而日渐增多的耐药菌正严重威胁着公众健康。同时随着畜牧业禁抗时代的到来，科学家对于高效无毒且不易使细菌产生耐药性的替抗产品的研究越来越多。

[0003] 抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)广泛存在于昆虫、植物、动物等各种生物体中，是抵御入侵病原体天然防御系统的重要组成部分。它们不仅对细菌、真菌、病毒具有直接活性，而且在宿主体内也具有间接免疫调节活性，与传统抗生素主要通过与细胞内特定靶点相互作用发挥作用不同，抗菌肽的靶点通常是细胞膜，这使抗菌肽不易使细菌产生耐药性，有望成为传统抗生素的高效替代品。

[0004] 目前，上千种抗菌肽已经被提取或者全新设计出来，然而，天然抗菌肽有一些缺陷，如一般活性低，毒性副作用大和高生产成本，这些缺陷限制了它们的应用。在AMPs开发的所有阶段中，针对这些问题，已经开发出许多方法来缓解这些弊端，例如根据抗菌肽的结构以及理化性质和结构参数设计并合成抗菌肽以提高活性。截短抗菌肽、以及疏水性氨基酸的替换以降低毒性。但是在实际设计出的抗菌肽，对其结构功能关系还是难以清晰有效的揭示，还是不能完全克服这些弊端。

[0005] 对于已经发现和分离出来的抗菌肽，α‑螺旋结构的抗菌肽占所发现的1/3‑1/2，是抗菌肽中较为普遍存在的结构。为了开发具有实际应用潜力的抗菌肽，天然的α‑螺旋抗菌肽改造越来越多。两亲性是α‑螺旋抗菌肽活性的先决条件之一。这一特性使抗菌肽能够通过静电吸引与细菌膜外的阴离子磷脂头部基团结合，紧随其后的是结构的疏水面残基插入细菌脂质双层，最终杀死细菌。但是对于α‑螺旋抗菌肽结构功能关系还是研究较少，改造的α‑螺旋抗菌肽在活性和稳定性上仍存在不足。

发明内容

[0006] 基于以上不足之处，本发明提供一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5，解决天然猪源TP肽活性低、稳定性差、合成成本高的问题。

[0007] 本发明所采用的技术方案如下：一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明的另一目的是提供一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5的制备方法，如下：基于α‑螺旋折叠原理，以猪源TP肽为模板，在氢键形成处：(i，i+4)位置用正电荷赖氨酸取代猪源TP肽的N5、G9、G13位置的氨基酸，形成肽TP(i+4)1，2，在其基础上，用色氨酸取代T8、A12位置的氨基酸，并在C端酰胺化，形成肽TP(i+4)5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，最后利用固相化学合成法和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

[0009] 本发明的另一目的是提供上述所述的一种猪源TP肽的i和i+4定点突变高活性衍生体抗菌肽TP(i+4)5在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病的抗菌药物中的应用。

[0010] 本发明的原理是：选取一条短链的天然抗菌肽TP，综合考虑α‑螺旋抗菌肽改造和设计时所需要的各种结构功能参数，以猪源TP肽为模板，在氢键形成处(i，i+4)位置用赖氨酸取代TP肽的亲水面氨基酸，得到一条正电荷替换所得的最优肽TP(i+4)1，2，在其基础上，再用色氨酸取代在氢键形成处(i，i+4)位置的氨基酸扩大抗菌肽的疏水面，进一步提高抗菌肽的活性，并在羧基末端酰胺化以增加肽的稳定性，最后设计改造出TP(i+4)5，TP(i+4)5具有高活性、低毒性，高稳定性的抗菌肽。

[0011] 本发明的有益效果及优点：抗菌肽TP(i+4)5具有高活性、低毒性，高稳定性的优点，通过本方法制备改造的抗菌肽，序列长度短，功能参数明确，结构特征清晰，合成技术便捷，对得到的抗菌肽进行抗菌、溶血和稳定性活性检测，发现TP(i+4)5对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株有高效的抑制作用，且在生理盐离子浓度环境下依旧活性良好；TP(1+4)5在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到33.68。综上所述，TP(i+4)5是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

[0012] 图1为抗菌肽TP(i+4)5的质谱图。

[0013] 图2为抗菌肽TP(i+4)1，2的质谱图。

具体实施方式

[0014] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0015] 实施例1

[0016] 抗菌肽的设计

[0017] 抗菌肽TP的氨基酸序列为：

[0018]

[0019] 抗菌肽TP(i+4)1，2的氨基酸序列为：

[0020]

[0021] 抗菌肽TP(i+4)5的氨基酸序列为：

[0022]

[0023] 以猪源TP肽为模板，在氢键形成处(i，i+4)位置用赖氨酸取代猪源TP肽的亲水面氨基酸，替换不同对的氨基酸分别命名为1、2、3、4活性最好的为同时替换的1、2对，将电荷替换所得的最优肽命名为TP(i+4)1，2，在其基础上，再用色氨酸取代在氢键形成处(i，i+4)位置的氨基酸扩大肽的疏水面，对色氨酸替换的不同对的氨基酸分别命名5、6、7活性最好替换为第5对，所以将肽命名为TP(i+4)5。将肽的羧基末端酰胺化以增加肽的稳定性。抗菌肽的序列如表1所示。

[0024] 表1衍生肽的氨基酸序列

[0025]

[0026] TP(i+4)5的序列长度为16个氨基酸，净电荷数为+5。用两个色氨酸扩大了抗菌肽的疏水面，提高了肽的活性。将肽的C端酰胺化以增加一个正电荷，该方法使多肽具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性。

[0027] 实施例2

[0028] 将上述抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：

[0029] 1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc‑X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X‑Wang树脂；再将Fmoc‑Y‑Trt‑OH(9‑芴甲氧羧基‑三甲基‑Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

[0030] 2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，‑20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

[0031] 3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

[0032] 4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，如图1所示，质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

[0033] 实施例3

[0034] 抗菌肽生物学活性的测定

[0035] 抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。挑取细菌单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期,使用时稀释至OD600＝0.4，菌液在使用前被稀释1000倍。在96孔板中加入等体积(50μL)牛血清白蛋白溶液(牛血清白蛋白溶液：BSA 0.2％；0.0 1％醋酸)。第一排体系为90μL+10μL(抗菌肽)，倍比至第十列，96孔板中的最终肽浓度范围为1至128μM/L。然后在96孔板中加入等体积(5 0μL)菌液。这些平板在37℃下孵育18‑24小时，MIC值是肉眼观察不到细菌生长的最低浓度，在492nm的光密度(OD＝492nm)下用分光光度法测定，每项测定在三个独立的场合进行六次重复。检测结果见表2。通过表2可以看出，抗菌肽TP(i+4)5对于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌均表现出明显的抑菌活性。

[0036] 表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

[0037]

[0038]

[0039] 通过表2可以看出，TP(i+4)5对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较高的抑菌活性。

[0040] 2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2ml PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx‑100作为阳性对照。溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度检测结果见表2。通过表2可以看出，TP(1+4)5在32μM/L范围内没有溶血活性。

[0041] 表3抗菌肽溶血活性的测定

[0042]

[0043] TP(1+4)5在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到33.68。

[0044] 3、稳定性的测定：将每种浓度(300mM NaCl，9mM KCl，2mM MgCl2、16μM ZnCl2、12μM NH4Cl和6μM FeCl3)的盐粉末溶解在BSA溶液中，后续步骤与抗菌活性的测定方法一致。检测结果见表4。

[0045] 表4抗菌肽TP(1+4)5在生理盐浓度条件下对大肠杆菌25922和金黄色葡萄球菌29213的抑菌活性(μM)

[0046]

[0047] 根据实验结果可以看出，TP(1+4)5在生理浓度的盐粒子水平下依旧保持着良好的抑菌活性。

[0048] 综合以上结果显示，具有较高的治疗指数和生物学功能稳定性，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。