一种百菌清单克隆抗体及其应用转让专利
申请号 : CN202111345322.6
文献号 : CN113773390B
文献日 : 2022-01-18
发明人 : 魏单平 , 吴迪 , 赵荣茂 , 杨晓霞 , 孙海霞
申请人 : 北京纳百生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一种百菌清单克隆抗体，编码抗体的基因序列包括轻链可变区的序列和重链可变区的序列，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。轻链可变区和重链可变区序列在纽普生物（NovoPro）分析得出其CDR区，氨基酸序列如SEQ ID NO:3‑8所示。本发明采用上述的一种百菌清单克隆抗体，对百菌清具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
权利要求 :
1.一种百菌清单克隆抗体，其特征在于：编码抗体的基因序列包括轻链可变区的基因序列和重链可变区的基因序列，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的一种百菌清单克隆抗体，其特征在于：抗体包含抗体轻链CDR区和抗体重链CDR区，其中：
抗体轻链CDR区由CDR1、CDR2、CDR3组成，抗体重链CDR区由CDR4、CDR5、CDR6组成。
3.根据权利要求2所述的一种百菌清单克隆抗体，其特征在于：轻链CDR1序列如SEQ ID NO:3所示，轻链CDR2序列如SEQ ID NO:4所示，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求2所述的一种百菌清单克隆抗体，其特征在于：重链CDR4序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR5序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR6序列如SEQ ID NO:8所示。
5.一种如权利要求1‑4任一项所述的百菌清单克隆抗体在制备胶体金试纸条或ELISA试剂盒的应用。
说明书 :
一种百菌清单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及百菌清快速检测技术领域，尤其是涉及一种百菌清单克隆抗体。
背景技术
[0002] 百菌清（Chlorothalonil，CTN，又名百菌清胶悬剂、百菌清悬浮剂、百菌清烟剂），CAS号为1897‑45‑6，化学名为四氯间苯二腈（2,4,5,6‑四氯‑1,3‑苯二甲腈），分子式为
C8Cl4N2。百菌清对水稻、小麦、果蔬、茶叶等多种作物的病虫害具有强力的防治效果，能在体
表上有良好的黏着性，不易被雨水冲刷掉，因此药效期较长，是一种高效、低毒的非内吸性
广谱有机氯杀菌剂。百菌清虽然急性毒性低，但在我国也出现过急性中毒事故。百菌清在环
境中较稳定，大部分进入土壤并造成严重的污染，并具有明显的蓄积毒性。该农药在自然界
中的主要代谢产物之一是4‑羟基‑2,4,5‑三氯间苯二腈，其毒性是母体的30倍。
C8Cl4N2。百菌清对水稻、小麦、果蔬、茶叶等多种作物的病虫害具有强力的防治效果，能在体
表上有良好的黏着性，不易被雨水冲刷掉，因此药效期较长，是一种高效、低毒的非内吸性
广谱有机氯杀菌剂。百菌清虽然急性毒性低，但在我国也出现过急性中毒事故。百菌清在环
境中较稳定，大部分进入土壤并造成严重的污染，并具有明显的蓄积毒性。该农药在自然界
中的主要代谢产物之一是4‑羟基‑2,4,5‑三氯间苯二腈，其毒性是母体的30倍。
[0003] 美国国家环境保护总署（U.S.EPA）已经把百菌清列为可能使人类致癌的物质之一，很多国家都规定了百菌清在农产品中的最高限量。我国《食品安全国家标准 食品中农
药最大残留限量》GB2763‑2021规定了植物源性食品为百菌清，小麦、大豆、洋葱、苹果和茶
叶的最大残留量分别为0.1mg/kg、0.2mg/kg、10mg/kg、1mg/kg、10mg/kg；动物源性食品为4‑
羟基‑2,5,6‑三氯异二苯腈，哺乳动物肉类、哺乳动物内脏、禽肉类和生乳的最大临时限量
为0.02mg/kg、0.2mg/kg、0.01mg/kg、0.07mg/kg。
药最大残留限量》GB2763‑2021规定了植物源性食品为百菌清，小麦、大豆、洋葱、苹果和茶
叶的最大残留量分别为0.1mg/kg、0.2mg/kg、10mg/kg、1mg/kg、10mg/kg；动物源性食品为4‑
羟基‑2,5,6‑三氯异二苯腈，哺乳动物肉类、哺乳动物内脏、禽肉类和生乳的最大临时限量
为0.02mg/kg、0.2mg/kg、0.01mg/kg、0.07mg/kg。
[0004] 目前百菌清已经建立的检测方法有高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱法（Gas chromatography，LCMS）、气质联用法（Gas
chromatography ‑ mass spectrometry，GC‑MS）、酶联免疫吸附法（Enzyme linked
immunosorbent assay，ELISA）和胶体金免疫分析法（Immune colloidal gold technique，
GICA）等。仪器法进行定量分析具有较低的检测限，但是仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到
现场规模快速检测的要求。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对
要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。
chromatography ‑ mass spectrometry，GC‑MS）、酶联免疫吸附法（Enzyme linked
immunosorbent assay，ELISA）和胶体金免疫分析法（Immune colloidal gold technique，
GICA）等。仪器法进行定量分析具有较低的检测限，但是仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到
现场规模快速检测的要求。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对
要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种对百菌清具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种百菌清单克隆抗体，编码抗体的基因序列包括轻链可变区的基因序列和重链可变区的基因序列，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:
1所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
1所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007] 优选的，抗体包含抗体轻链CDR区和抗体重链CDR区，其中：
[0008] 抗体轻链CDR区由CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列组成，抗体重链CDR区由CDR4、CDR5、CDR6氨基酸序列组成。
[0009] 优选的，轻链CDR1序列如SEQ ID NO:3所示，轻链CDR2序列如SEQ ID NO:4所示，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:5所示。
[0010] 优选的，重链CDR4序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR5序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR6序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011] 优选的，百菌清单克隆抗体用于制备百菌清胶体金检测试纸条。
[0012] 因此，本发明采用上述一种百菌清单克隆抗体，对百菌清具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。免疫分析方法具
有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。
并且，单克隆抗体特异性强、灵敏度高，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。
并且，单克隆抗体特异性强、灵敏度高，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
[0013] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0014] 图1是采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的RIDA SOFT四参数法R2曲线图；
[0015] 图2是采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的Splinen拟合IC50曲线图；
[0016] 图3是单克隆抗体轻链基因序列同源性比对；
[0017] 图4是单克隆抗体重链基因序列同源性比对；
[0018] 图5单克隆抗体轻链氨基酸序列同源性比对；
[0019] 图6是单克隆抗体重链氨基酸序列同源性比对；
[0020] 图7是胶体金试纸条示意图。
具体实施方式
[0021] 以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0022] 实施例一
[0023] 单克隆抗体的制备
[0024] （1）初次免疫
[0025] 将百菌清人工抗原与弗氏完全佐剂1:1乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，免疫剂量为500μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗氏不完全佐
剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫。
剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫。
[0026] 第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.5mL，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融
合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌百菌清单克隆抗
体的杂交瘤细胞株。
合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌百菌清单克隆抗
体的杂交瘤细胞株。
[0027] （2）细胞复苏
[0028] 取出百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0029] 制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡5
油0.8 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8×10 个/只，10天后采集腹水。用辛酸‑饱和硫酸
铵法进行纯化，得到百菌清单克隆抗体。
油0.8 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8×10 个/只，10天后采集腹水。用辛酸‑饱和硫酸
铵法进行纯化，得到百菌清单克隆抗体。
[0030] （3）百菌清单克隆抗体的特异性及亚类鉴定
[0031] 采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见表1、图1和图2。以百菌清各浓度（0，0.01，0.03，0.06，0.12，0.24ng/ml）为横坐标，以百菌清各浓度对应的OD值为纵
坐标，使用RIDA SOFT四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。结果表明，使用四
2
参数法拟合标准曲线，曲线R=0.9996，使用Splinen拟合，IC50=0.043ng/ml，方法检出限为
0.01ng/ml，相对于专利CN101412756A（检测的最低限0.016mg/kg）及专利CN104020290A（最
低检测限0.06ng/ml，IC50=0.3ng/ml）更灵敏。
坐标，使用RIDA SOFT四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。结果表明，使用四
2
参数法拟合标准曲线，曲线R=0.9996，使用Splinen拟合，IC50=0.043ng/ml，方法检出限为
0.01ng/ml，相对于专利CN101412756A（检测的最低限0.016mg/kg）及专利CN104020290A（最
低检测限0.06ng/ml，IC50=0.3ng/ml）更灵敏。
[0032] 表1 间接Elisa方法检测不同百菌清浓度下灵敏度及特异性
[0033]
[0034] 使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒检测百菌清单克隆抗体的亚类，结果显示百菌清单克隆抗体为IgM。
[0035] 实施例二
[0036] 轻链和重链可变区基因克隆
[0037] （1）杂交瘤细胞培养及总RNA提取
[0038] 用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳培养杂交瘤细胞1×107。培养细胞总RNA提取试剂盒试剂盒（购自天根）提取细胞总RNA。
[0039] （2）cDNA第一链的合成
[0040] Takara翻转录试剂盒（日本）合成cDNA。
[0041] （3）基因扩增
[0042] 设计Lambda链，Kappa链，Heavy链下游引物及上游通用引物。
[0043] 引物：F:AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
[0044] Rκ:AACATTGATGTCTTTGGGGTAGAA
[0045] Rλ:AATCGTACACACCAGTGTGTGGG
[0046] RH:AGGGATCCAGAGTTCCAGGT
[0047] 以cDNA第一链为模板进行PCR，反应体系50μl。
[0048] 降落PCR反应体系：模板3μl，dNTPs 1μl，上下游引物（10uM）各2.5μl，5×PCR buffer 10μl，ddH2O 30.5μl，Taq酶（5μ/μl）0.5μl。
[0049] 降落PCR反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃‑58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min。
[0050] （4）PCR扩增产物的克隆和筛选
[0051] PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（北京天根）回收抗体Kappa链，Lambda链和Heavy链片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（北京天根）将该片段插入
pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆测序。
pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆测序。
[0052] PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示Kappa链未见条带，Lambda链和Heavy链测序，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
[0053] （5）可变区基因序列和氨基酸序列及同源性分析
[0054] 在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果表明：百菌清单克隆抗体轻链可变区基因与小鼠免疫球蛋白Lambda链可变区（Sequence ID:AY178831.1）同源性最高，同源性为
419/429，同源性百分比为98%，见图3。
419/429，同源性百分比为98%，见图3。
[0055] 百菌清单克隆抗体重链可变区基因与小鼠克隆IgM重链可变区（Sequence ID:AY090905.1）同源性最高，同源性为320/345，同源性百分比为93%，见图4。
[0056] 百菌清单克隆抗体轻链可变区氨基酸与小鼠免疫球蛋白G轻链可变区（Sequence ID:AAO20093.1）同源性最高，同源性为136/140，同源性百分比为97%，见图5。
[0057] 百菌清单克隆抗体重链可变区氨基酸与小鼠免疫球蛋白gama链（Sequence ID:AAA37946.1）同源性最高，同源性为118/143，同源性百分比为83%，见图6。
[0058] 编码百菌清单克隆抗体的轻链和重链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。此结果与使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA
试剂盒鉴定百菌清单克隆抗体为IgM相一致。
试剂盒鉴定百菌清单克隆抗体为IgM相一致。
[0059] 将轻链可变区和重链可变区序列，在纽普生物（NovoPro）分析，得出其CDR区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3‑8所示。
[0060] 应用实施例
[0061] 一、制备百菌清胶体金试纸条
[0062] 试纸条结构，如图7所示，试纸条由底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、结合物释放垫4、样品吸收垫5组成；样品吸收垫5、结合物释放垫4、硝酸纤维素膜3、吸水垫2依次按顺序粘
贴在底板1上；结合物释放垫4从起始端有1/4区域被样品吸收垫5覆盖，结合物释放垫4的末
端与硝酸纤维素膜3的始端连接，硝酸纤维素膜3的末端与吸水垫2的始端相连，样品吸收垫
5的始端与底板1的始端对齐，吸水垫2的末端与底板1的末端对齐；
贴在底板1上；结合物释放垫4从起始端有1/4区域被样品吸收垫5覆盖，结合物释放垫4的末
端与硝酸纤维素膜3的始端连接，硝酸纤维素膜3的末端与吸水垫2的始端相连，样品吸收垫
5的始端与底板1的始端对齐，吸水垫2的末端与底板1的末端对齐；
[0063] 硝酸纤维素膜3上有检测线7和质控线6，检测线7和质控线6均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线7位于靠近结合物释放垫4的末端的一侧；质控线6位于远离结合
物释放垫4的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，以铝箔袋密封，2～30℃条
件下可保存12个月。
物释放垫4的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，以铝箔袋密封，2～30℃条
件下可保存12个月。
[0064] 二、试纸条的制备方法及步骤
[0065] 该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
[0066] 1)制备具有百菌清人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线的硝酸纤维素膜；
[0067] 2)制备喷涂有胶体金标记的百菌清单克隆抗体的结合物释放垫；
[0068] 3)将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。
[0069] 三、检测小麦中百菌清的含量
[0070] 称取2g（精确到0.01g）小麦，破碎均质后，取1g倒入离心管中加入8 mL纯净水混匀后，配制待测样本1（百菌清10ppb），待测样本2（百菌清5ppb），待测样本3（百菌清0ppb），备
用。待测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵变质的沉淀块，否则会影响检测结果。将上
述制备好的试纸条插入待测样本溶液中，室温反应10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。
用。待测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵变质的沉淀块，否则会影响检测结果。将上
述制备好的试纸条插入待测样本溶液中，室温反应10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。
[0071] 结果判定
[0072] （1）阴性(－)：C线和T线均显色，T线显色远比C线强，表示样本中不含百菌清或远低于检出限。
[0073] （2）阳性(＋)：C线显色；T线显色与C线相同、T线显色比C线弱或者T线不显色，均表示样本中百菌清浓度等于或高于检出限。
[0074] （3）无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。
[0075] 结果显示：待测样本1（百菌清10ppb）为阳性，待测样本2（百菌清5ppb）为阴性，待测样本3（百菌清0ppb）为阴性。此结果表明试纸条检测限为10ppb。
[0076] 因此，本发明采用上述一种百菌清单克隆抗体，对百菌清具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
[0077] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修
改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修
改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。