一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1及其应用

摘要

本发明公开了一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1及其应用，本专利分离筛选和鉴定得到了一个新的降解烟碱微生物的菌株——烟草肠杆菌NLB1，所述菌株于2021年3月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，菌种保藏号为GDMCC NO：61569。利用该菌株能够降低烟碱含量；降解过程不仅高效、安全，而且该菌株在烟草工业和环境保护中也具有很好的应用前景。

权利要求

1.一种降解烟碱的烟草肠杆菌（Enterobacter tabaci）NLB1，其特征在于，所述菌株于

2021年3月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，菌种保藏号为GDMCC NO：61569。

2.权利要求1所述的烟草肠杆菌NLB1在烟碱的降解中的应用。

3.一种用于降解烟碱的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的烟草肠杆菌NLB1。

4.权利要求1所述的烟草肠杆菌NLB1在制备降解烟碱的产品中的应用。

说明书

一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及烟碱降解技术领域，具体地，涉及一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1及其应用。

背景技术

[0002] 烟草是我国主要的经济作物之一，无论面积还是总产量，都居世界首位。烟草虽然是产量、品质兼顾的嗜好类作物，但是卷烟是通过吸食消费，品质尤为重要，在保证品质的基础上提高产量。烟草中具有很多有害物质，最主要的是烟碱和焦油，严重危害人体健康。

[0003] 烟碱俗称尼古丁(Nicotine)，是烟草生物碱中的主要成分，它作为烟草植株特有的生物碱，其含量约占烟草栽培品种生物碱总量的90％～95％。占烟草干重的0.05％～6.0％。烟碱是评价烟叶品质的主要指标，也是衡量烟草制品吃味的主要指标。烟碱在烟叶中的含量一般要求在1.5％～3.5％之间，以2.5％左右为宜。烟碱含量过高，生理强度大，吃味变劣，刺激性增强，同时增大烟气的辛辣刺激性，影响吸味，且安全性差，损害健康；烟碱含量过低，吃味平淡，不能满足吸食需要。在烟叶燃吸过程中，尼古丁会被亚硝酸化，生成烟草中特有的强致癌剂N‑亚硝胺。因此，在烟叶中维持适量稳定的尼古丁含量，对保证卷烟质量及维护消费者健康都是非常重要的。因此培育适宜烟碱含量的优良品种已成为烟草产业可持续发展亟需解决的问题。

[0004] 由于目前烟草种植过程中，使用了较多的氮肥，导致烟草中的烟碱含量超出正常水平。目前，我国烤烟烟碱含量偏高，烟碱达到3％～4％，白肋烟烟碱含量甚至高达6％。当前国内采用较多的传统手段如选择适时打顶、选育低烟碱品种种植、适量施肥等，虽然可降低一些烟碱含量，但是操作繁琐且成本髙、劳动强度高、效果较低，因此这些传统手段已不适宜有效降解当今烟草中过高的烟碱含量。如何降低烟叶中的烟碱含量是各卷烟企业所面临的现实问题。

[0005] 利用有益微生物及其代谢产物降低烟碱含量不仅高效、安全，而且对香烟主要品质不会产生不利影响，是极具潜力的方法。1947年，Enders等人(Enders C,Windisch S.The decomposition of nicotine by yeast[J].Biochem.,1947,318:54‑62)就开始利用酵母对烟碱的分解研究，发现酵母不能完全降解烟碱。同年，Giovannozzi(Giovannozzi.Industrial experiments of f erment ation with addition of microbic cultures[J].Tobacco,1947,573(51):6‑15)应用Deharyomyces nicotianae和Micrococcus nicotianae两种菌种的培养液对烟草进行工业发酵处理的试验结果表明，这两种菌液除了能够改善烟草的风味和香气外，还分别使烟草的烟碱含量降低了0.45和0.83个百分点，而用以上两种菌液混合处理过的烟草烟碱含量则降低了0.61个百分点。Newton等人(Newton,Richard P,Geiss,et a.l Process for reduction of nicotine content of tobacco by microbial treatmen:USA,4037609.1977‑07‑26)将从土壤中分离出来的假单胞菌属(Pseudomonas)对烟碱溶液进行了24h处理，结果烟碱含量大幅度降低，溶液的pH值也由6.4降至4.6。但由于pH值的降低和菌落数的增大，烟碱的分解停止，约有35％的烟碱未发生降解。1957年，Frankenburg等人(Frankenburg W G,Vaitekunas AA.Chemical studies on nicotine degradation by microorganism derived from the surface of tobacco seeds[J].Coresta,1957,1:0034.)通过改进烟叶的发酵处理过程不仅降解了5％～20％的烟碱，而且加速了烟叶的其它氧化反应，改善了烟草的吸味质量，进一步研究发现，对雪茄烟叶晾制过程中烟碱的降解进行了研究，发现烟碱主要是在晾制的初始阶段被降解；1978年，Lawrence等人(Lawrence E,Gravely,Louisville K Y,Vernon L.Geiss,et al.Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment[P].US Patent:4557280,1978)利用假单胞杆菌(Pseudomonas putid)对烟草中的烟碱进行降解，发现用假单胞杆菌液对白肋烟和烤烟的混合烟丝(1：1)处理后，烟碱含量平均从2.0％降到了0.85％，通过烟气分析发现，每支卷烟的烟碱含量从
1.58mg降到了0.98mg。同时，该公司还筛选出纤维单胞菌和假单胞菌两种细菌。用37.2kg菌液处理20.4kg去梗的烟叶，保持含水率68％～70％，处理完后再将烟叶干燥到14.5％。经此处理后，烟叶的烟碱含量从3.5％降至1.65％。

[0006] 目前发现在烟株、土壤和陈化烟叶中存在的能够降解烟碱的微生物主要有假单胞菌(Pseudomonas putid)、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformils)、嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)以及Nicotiana plumbaginifolia等菌种。其中嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)和假单胞菌(Pseudomonas pulid)是较优良的能够降解烟碱的菌株。国外许多的烟碱降解菌已经成功应用到实际生产当中去，但主要用于烟叶发酵及加工后的烟碱降解。国内在这一领域还处于寻找有效降解烟碱的微生物这一初级阶段，且对微生物降解烟碱的分子机制尚缺乏深入的研究，尤其是直接在烟草栽培过程中，运用微生物调控烟碱的合成及降解烟碱的研究还处于空白。所以展开对烟碱降解菌的应用到大田降解烟叶中高浓度烟碱是国内值得深入研究的领域。

发明内容

[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1及其应用。

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种降解烟碱的烟草肠杆菌NLB1。

[0009] 本发明的第二个目的是提供所述的烟草肠杆菌NLB1在烟碱的降解中的应用。

[0010] 本发明的第三个目的是提供一种降低烟草烟碱的方法。

[0011] 本发明的第四个目的是提供一种用于降解烟碱的制剂。

[0012] 为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

[0013] 本发明提供的一株来自褐飞虱雌成虫的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1，该菌于2021年3月18日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC NO：61569。本专利利用烟碱为唯一碳源的培养基、16S rRNA及生理生化指标对菌株NLB1进行分离和鉴定；同时对菌株NLB1在不同pH值、温度和耐受性下对烟碱的降解能力进行测定。结果表明该菌株为烟草肠杆菌NLB1，菌株NLB1最大降解烟碱的最佳pH值和温度分别为30℃，pH＝7.0；将NLB1种子菌以5％接入烟碱液体培养基中培养72h。36h达到最大的降解量，菌株
9
NLB1浓度约为10cfu/mL，对烟碱的最大降解能力为50％。

[0014] 因此，本发明要求保护一种降解烟碱的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1，所述菌株于2021年3月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：61569。

[0015] 本发明还要求保护所述的烟草肠杆菌NLB1在烟碱的降解中的应用。

[0016] 本发明还要求保护一种降低烟草烟碱的方法，使用所述的烟草肠杆菌NLB1降解烟碱。

[0017] 优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在25℃～40℃降解烟碱。

[0018] 更优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在30℃～40℃降解烟碱。

[0019] 进一步优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在30℃降解烟碱。

[0020] 优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在pH 6.0～8.0降解烟碱。

[0021] 更优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在pH 7.0降解烟碱。

[0022] 最优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在30℃pH 7.0降解烟碱。

[0023] 优选地，所述的烟草肠杆菌NLB1在无机盐基础培养基中培养降解烟碱。

[0024] 优选地，以浓度为1×108～1×1010cfu/mL的权利要求1所述的烟草肠杆菌NLB1的菌液喷施。

[0025] 更优选地，以浓度为1×109cfu/mL的所述的烟草肠杆菌NLB1的菌液喷施。

[0026] 本发明还要求保护一种用于降解烟碱的制剂，含有所述的烟草肠杆菌NLB1。

[0027] 本发明还要求保护所述的烟草肠杆菌NLB1在烟碱的在制备降解烟碱的产品中的应用。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0029] 本专利分离筛选和鉴定得到了一个新的降解烟碱的微生物的菌株——烟草肠杆菌NLB1，利用该菌株及能够降低烟碱含量；降解过程不仅高效、安全，而且，该菌株在烟草工业和环境保护中也具有很好的应用前景。

附图说明

[0030] 图1为NLB1分离菌平板。

[0031] 图2为褐飞虱烟草肠杆菌NLB1 16S rDNA系统发育分析。注：每一分支上标示为：GenBank序列号+菌株名称。

[0032] 图3为褐飞虱烟草肠杆菌NLB1在烟碱培养基中的培养状态。

[0033] 图4为褐飞虱烟草肠杆菌NLB1对烟碱的降解能力。

具体实施方式

[0034] 下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0035] 实施例1褐飞虱烟草肠杆菌NLB1的分离培养及鉴定

[0036] 一、耐烟碱的褐飞虱烟草肠杆菌NLB1的分离培养

[0037] 1、选择性分离培养基的配制

[0038] LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH2O水中，调pH至7.0。

[0039] EB培养基：3g牛肉浸粉，10g胰蛋白胨，15g酵母粉，5g氯化钠，10g葡萄糖，15g琼脂，溶于1L无菌水中，调pH至7.2。

[0040] NA培养基：10g胰蛋白胨，3g牛肉浸粉，5g氯化钠，15g琼脂，溶于1L无菌水中，调节pH值至7.0。

[0041] 2、生物测定及取样

[0042] 选取生长15天，长势均一的水稻，均分两组，每组三个重复，每重复4～6株。

[0043] 采用稻苗浸渍法做褐飞虱生物测定：水稻连根拔出，清水冲洗后于阴凉处晾至表面无水，分别在烟碱浓度为160mg/L溶液及清水中浸泡1min，取出于阴凉处晾至表面无水，用湿润的棉花包裹水稻根部，放置于生测杯中，接入15头成虫1～2d的褐飞虱雌成虫，置于人工气候箱培养3d后，分别吸取各组存活褐飞虱。气候箱条件：温度：28℃；湿度：85％；光周期：14～10h。

[0044] 3、研磨并涂板

[0045] 对收集的飞虱表面消毒后(70％酒精浸泡30s，2％次氯酸钠浸泡30s，清水中振荡两次，每次1min)移入装有200μL PBS的试管，手持电动研磨仪研磨成匀浆，稍离心，取上清。‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5
稀释5个浓度梯度，按稀释10 ，10 ，10 ，10 ，10 倍后分别涂布于三种选择性分离培养基上培养，每个处理三个重复。置于37℃恒温培养箱培养，每隔24h观察一次。

[0046] 4、连续纯化培养

[0047] 选择性分离培养基中有长出单菌落后。首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照，结果如图1。并将单克隆转接至相应液体培养基中，摇菌至细菌指数生长期时保存于25％的甘油水溶液中，冻存于‑80℃冰箱备用。

[0048] 二、烟草肠杆菌NLB1的鉴定

[0049] 从以上获得菌株中鉴定得到一株来自褐飞虱雌成虫的烟草肠杆菌，命名为NLB1，并进行进一步的菌种鉴定。

[0050] 1、传统的生物学鉴定

[0051] (1)菌落形态特征

[0052] 从形态上，NLB1菌在LB平板上形成圆形、边缘整齐的浅白色半透明湿润菌落，革兰染色有时不易脱色，多为杆状。经显微下观察到该菌为杆状，革兰氏阴性菌。本细菌兼性需氧，最适生长温度为30℃，营养要求不高，在普通培养基LB上生长良好。

[0053] (2)烟草杆菌NLB1的生理生化特征测定

[0054] 本发明得到的NLB1的生理生化特性结果如表1所示：能分解β‑半乳糖苷酶、精氨酸双水介酶、鸟氨酸脱羧、柠檬酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、蜜二塘、苦杏仁苷、阿拉伯糖。正常生长的pH范围为6～8，生长温度为25～40℃。

[0055] 表1 NLB1的生理生化特性

[0056]

[0057]

[0058] 2、16S rDNA鉴定

[0059] (1)使用天根生物公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)抽提保存的NLB1菌株基因组DNA，并以提取的DNA为模板，16S rDNA通用引物27F(5’‑AGTTTGATCMTGGCTCAG‑3’)和1492R(5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)为上下游引物扩增细菌的16S rDNA。将PCR体系轻轻混匀后，短暂离心，置于PCR仪上按照：98℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃，5min；10℃，4℃保存，PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送广州擎科生物技术有限公司测序鉴定。

[0060] (2)烟草肠杆菌NLB1系统发育分析

[0061] 用细菌16S通用引物27F及1492R对细菌基因组扩增分析，并用SeqMan(DNAStar)拼接序列，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:1的扩增产物，然后将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对。用ClustalW软件对NLB1菌株的近缘序列进行比对分析，之后用Mega7.0软件采取邻接法(Neighbor‑Joining)构建系统进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图2表明NLB1与烟草肠杆菌Enterobacter tabaci strainYIM Hb‑3(NR 146667.2:13‑1450)相似性最高，表明NLB1为烟草肠杆菌属。

[0062] 该烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1于2021年3月18日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC NO：61569，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

[0063] 实施例2烟草肠杆菌NLB1在烟碱上培养基的培养

[0064] 一、实验方法

[0065] 1、培养基

[0066] 无机盐基础培养基(MSM)：13.3g K2H PO4、4.0g KH2 PO4、0.1g(NH4)2SO4、1.0g酵母粉、10.0mL微量元素(1.0g MgSO4·7H2O、0.4g MnSO4·H2O，0.2g CaCl2·2H2O、0.2g CuCl2·2H2 O、0.02g FeSO4·7H 2O，用0.1mo l/L HCl溶解，定容到100mL)，加蒸馏水到1L。

[0067] 烟碱培养基：90％烟碱用0.22μm滤膜过滤后加入灭菌后的无机盐基础培养基中。

[0068] 2、菌落培养

[0069] 将活化后的实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1在含有200mg/L烟碱的MSM固体培养基上划板，于30℃培养箱倒置培养24h，观察培养皿中菌落的生长情况。

[0070] 二、实验结果

[0071] 菌落生长状态如图3。由图3可知，实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1能在200mg/L添加烟碱的MSM固体长出单菌落，菌落透明。说明实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1能在含有烟碱的培养基上生长，对烟碱有降解作用。

[0072] 实施例3温度和pH对NLB1降解烟碱速率和NLB1生长速度的影响

[0073] 一、降解种子菌制备

[0074] 将‑80℃保存的甘油菌(实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1)以1：100接入新鲜液体LB培养基，220rpm/min，37℃振荡培养14h，再以1：100的比例重新转接于新鲜LB液体培养基，220rpm/min，37℃振荡培养OD600＝0.6，收集菌体，用等体积的灭菌MSM基础盐培养基重悬菌体，离心洗涤两次，再加基础盐培养基重悬以获得降解种子菌。

[0075] 二、分光光度计法测定烟碱浓度

[0076] 用0.05mol/L的HCl溶液，把纯烟碱配成质量浓度为5.0g/L的工作液，分别取工作液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、和0.06mL，以0.05mol/L HCl溶液定容至10mL。以0.05mol/L HCl溶液为参比，测定不同烟碱质量浓度下，烟碱溶液在260nm处的光密度值。结果显示：烟碱质量浓度为0.005～0.030g/L时，回归方程为Y＝35.429X+0.0053，R2为0.9993。说明在这个范围内，吸光值(Y)与烟碱浓度(X)关系成正相关，吸光值可以用来反应烟碱的浓度。

[0077] 三、温度对菌株NLB1生长和对烟碱降解的影响

[0078] 将配置好的降解种子菌按5％的接入量接种于含烟碱(1g/L)的基础培养基MSM中，分别在25℃、30℃、35℃、和40℃，180r/min条件下振荡培养24h，采用分光光度法测定细菌在OD600波长下的吸光度和OD260处烟碱的吸光值。

[0079] 结果表2所示，NLB1菌株在25℃～40℃范围内可以生长，在30℃～40℃范围内生长良好且差异不大。烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株的最适生长温度为30℃，在该温度下，实施案例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株达到最大的生长量为0.998和烟碱降解率最高达到24.9％。

[0080] 四、pH对菌株NLB1生长和对烟碱降解的影响

[0081] 将含烟碱(1g/L)的基础培养基MSM配成不同的pH值基础培养基MSM，即分别为6.0、6.5、7.0、和8.0基础培养基MSM。将上面配制的降解种子菌分别按5％的接入量接种于含烟碱(1g/L)的不同初始pH基础培养基MSM中，在30℃、180r/min条件下振荡培养24h，吸取24h培养液，4℃、12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm水相滤膜，用浓度0.05mol/L HCl稀释上清液到0.005～0.030g/L范围内，以浓度0.05mol/L HCl作参比液，采用分光光度法，分别测定在OD600下和波长OD260的吸光度，进一步获得细胞生长状态和烟碱降解情况。

[0082] 结果表2所示，烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株菌在pH6.0～8.0范围内菌株生长良好。细胞生长的最适pH为7.0，在该pH条件下，烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株达到最大的生长量为0.998，对烟碱的降解率也最高，达到49.8％。

[0083] 表2 NLB1在不同pH和不同的温度下生长情况和烟碱的降解率

[0084]

[0085] 实施例4菌株NLB1对烟碱的降解能力

[0086] 一、降解种子菌的制备

[0087] 将‑80℃保存的甘油菌(实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1)以1：100接入新鲜液体LB培养基，220rpm，37℃振荡培养14h，再以1：100的比例重新转接于新鲜LB液体培养基，220rpm/min，37℃振荡培养OD600＝0.6，收集菌体，用等体积的灭菌MSM基础盐培养基重悬菌体，离心洗涤两次，再加基础盐培养基重悬以获得降解种子菌NLB1。

[0088] 二、NLB1对烟碱的降解能力

[0089] 将降解种子菌NLB1以5％的接种量接种至1g/L烟碱培养基MSM中，以未接菌烟碱培养基为对照，在30℃、180rpm条件下培养。吸取6h、12h、24h、36h、48h、和72h培养液，4℃、12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm水相滤膜，用浓度0.05mol/L HCl稀释上清液到
0.005～0.030g/L范围内，以浓度0.05mol/L HCl作参比液，采用分光光度法，分别测定波长OD600和波长OD260的吸光度，进一步获得细胞生长状态和烟碱降解情况。

[0090] 三、实验结果

[0091] 在pH＝7.0，30℃下将实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1降解种子菌接入烟碱液体培养基中，培养至72h。分别测定6h、12h、24h、36h、48h、和72h的吸光度。结果如图4所示，菌株NLB1在0～36h内细胞持续增殖，在36～72h细胞浓度有所下降，在9
3d培养时间内最高浓度约为10cfu/mL；培养基中烟碱浓度24h后下降明显，在60h烟碱浓度曲线趋于平缓。因此，菌株NLB1在此实验条件下对烟碱的降解能力约为72h，50％。

[0092] 实施例5菌株NLB1耐受浓度试验

[0093] 一、实验方法

[0094] 实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1降解种子菌在普通培养基中培养至对数后期，以5％的接种量接种至基础培养基中，分别添加不同浓度烟碱为碳源，在30℃，180rpm条件下培养NLB1，36h取样，4℃、12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm水相滤膜，用浓度0.05mol/L HCl稀释上清液到0.005～0.030g/L范围内，以浓度0.05mol/L HCl作参比液，采用分光光度法，分别测定波长OD600和波长OD260的吸光度，进一步获得细胞生长状态和烟碱降解情况。

[0095] 二、实验结果

[0096] 结果表明，当烟碱的浓度低于2g/L时，实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株能降解烟碱到50％，同时细胞的生长随烟碱浓度的提高而增强，2g/L时达到最大OD值。而当烟碱浓度高于2g/L时，细胞的生长和对烟碱的降解均呈下降趋势。烟碱浓度达到6g/L时，实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株基本不能生长，底物作用明显，对烟碱的降解也停止。

[0097] 实施例6菌株NLB1处理后烟草的感官评价

[0098] 一、实验方法

[0099] 使用实施例1得到的烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)NLB1菌株对2019年云南产地的B2F等级的复烤烟进行烟碱的降解处理，具体的方法：将降解种子菌NLB1菌液以浓度9
为1×10cfu/mL均匀喷洒在复烤片烟上，并不断轻柔翻动烟叶，平衡水分静置30分钟；水分平衡后，将烟叶置于室内阴凉处，并遮光处理，时间为3天。处理后完毕后，将烟叶切丝并烘干，烟丝水分控制在12％～12.5％，进行感官质量评价，以没有经过处理的同批样品作为对照。

[0100] 其中，感官质量得分＝(香气质×0.35+香气量×0.25+杂气×0.1+刺激性×0.15+余味×0.15)×11.11。

[0101] 二、实验结果

[0102] 结果表3，NLB1菌株处理后，能显著改善2019云南B2F风格特征指标，适当降低了烟气浓度和劲头，提高了烟气的舒适性，提高了烟叶的配方适用性。NLB1菌株处理对2019云南B2F的品质特征指标无明显影响，能够保持烟叶原有的品质特征。

[0103] 表3 NLB1对2019年云南产地的B2F等级的复烤烟进行烟碱的降解处理

[0104]

[0105] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。