松针多糖与多酚同时分级提取工艺及应用

摘要

本发明提供了一种松针多糖与多酚同时分级提取工艺及应用。本发明提取工艺包括以下步骤：取湿地松针洗净晾干并粉碎过筛得到松针粉末；将所得松针粉末与石油醚均匀混合进行脱脂、脱色处理；将所得松针粉末加入水中，超声破碎提取、分离得到多糖粗提液和滤渣，将所得多糖粗提液进行4℃沉降，固液分离得所述松针多糖和滤液1；将中所得滤渣和滤液1混合，加入乙醇并超声提取，固液分离得滤液2，将所述滤液2进行浓缩纯化得到所述松针多酚。本发明具有得率高，确实可靠，操作简便，能同时得到松针多酚与多糖等特点，同时所得松针多糖和松针多酚具有较好的抗氧化和抗菌、杀菌活性，对于松针资源的研究开发具有重要的实践意义和应用价值。

权利要求

1.一种湿地松松针中同时分级提取松针多糖和松针多酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取湿地松针洗净晾干并粉碎过筛得到松针粉末；

（2）将（1）中所得松针粉末与有机溶剂均匀混合进行脱脂、脱色处理；

（3）将（2）中所得松针粉末加入水中，超声破碎提取、分离得到多糖粗提液和滤渣，将所得多糖粗提液进行1‑4℃沉降，固液分离得所述松针多糖和滤液1；

（4）将（3）中所得滤渣和滤液1混合，加入乙醇并超声提取，固液分离得滤液2，将所述滤液2进行浓缩纯化得到所述松针多酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述松针粉末粒径大小为40‑

100目。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述松针粉末与有机溶剂的质量体积比为1:8‑1:12g/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述松针粉末和水的质量体积比为1:20‑1:30。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的超声破碎条件为：功率为200‑400W，温度为45‑65℃，超声提取时间为20‑40min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述滤液1和滤渣的体积质量为40‑50mL/g。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述乙醇体积浓度为20‑40%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述超声条件为：功率为300‑

500 W，温度为50‑70℃，超声提取时间为30‑50 min。

说明书

松针多糖与多酚同时分级提取工艺及应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物有效成分提取工艺技术领域，尤其是指一种松针多糖与多酚同时分级提取工艺及应用。

背景技术

[0002] 松针为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物的叶，又名为松毛、猪鬃松叶、山松须，其植物来源包括雪松、马尾松、湿地松、油松、黑松、西伯利亚红松、华山松、云南松、思茅松等。
我国的松树资源非常丰富、且种类繁多。据报道，我国每年可获得的松针叶大约有200～300
万t。松针用药历史悠久，《本草纲目》记载“松针气味苦、温、无毒，久服令人不老、轻身益气。
主治风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年。”现代研究表明，松针提取物具有镇静催眠、
抗衰老、抗疲劳、抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂、保肝、抗肿瘤及改善血液循环等药理作用，
其利用价值日益受到重视。

[0003] 目前有关松针多糖和多酚的研究很多，但现有相关研究没有对松针中两类主要的生物活性成分：多酚和多糖进行综合提取分离纯化，造成了资源浪费，松针综合利用价值降
低，产品附加值不高等缺点。同时现有文献未能对其抗菌活性进行研究。

[0004] 本发明主要目的是从湿地松松针中同时提取分离松针多糖及松针多酚，通过超声波辅助进行单因素和响应面试验对其提取工艺进行优化，得到优化的提取工艺条件组合，
并对其抗菌、抗氧化活性应用进行研究。克服了以往只针对松针多糖或多酚进行单独提取，
未能同时进行提取的缺点，同时，补全了松针多糖及多酚的抗菌活性研究数据。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种松针多糖与多酚同时分级提取工艺及应用。工艺条件具有得率高，确实可靠，操作简便等特点。

[0006] 一种湿地松松针中同时分级提取松针多糖和松针多酚的方法，包括以下步骤：

[0007] (1)取湿地松针洗净晾干并粉碎过筛得到松针粉末；

[0008] (2)将(1)中所得松针粉末与有机溶剂均匀混合进行脱脂、脱色处理；所述有机溶剂为石油醚、二氯甲烷或正己烷。

[0009] (3)将(2)中所得松针粉末加入水中，超声破碎提取、分离得到多糖粗提液和滤渣，将所得多糖粗提液进行1‑4℃沉降，固液分离得所述松针多糖和滤液1；

[0010] (4)将(3)中所得滤渣和滤液1混合，加入乙醇并超声提取，固液分离得滤液2，将所述滤液2进行浓缩纯化得到所述松针多酚。

[0011] 在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述松针粉末粒径大小为40‑100目。

[0012] 在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述松针粉末与石油醚质量体积比为1:8‑1:12g/mL。

[0013] 在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述松针粉末和水的质量体积比为1:20‑1:30。

[0014] 在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述的超声破碎条件为：功率为200‑400W，温度为45‑65℃，超声提取时间为20‑40min。

[0015] 在本发明的一个实施例中，步骤(4)中，所述滤液1和滤渣的体积质量为40‑50mL/g。

[0016] 在本发明的一个实施例中，步骤(4)中，所述乙醇体积浓度为20‑40％。

[0017] 在本发明的一个实施例中，步骤(4)中，所述超声条件为：功率为300‑500W，温度为50‑70℃，超声提取时间为30‑50min。

[0018] 在本发明的一个实施例中，步骤(4)中，所述浓缩纯化包括旋蒸浓缩、树脂分离纯化；所述树脂纯化条件：所述树脂为D101树脂并作为固定相，以蒸馏水、20％、40％、60％、
80％浓度的乙醇为流动相进行梯度洗脱，分离纯化松针多酚。

[0019] 所述松针多糖和松针多酚在制备抗氧化剂中的应用。

[0020] 所述松针多糖和松针多酚在制备抗菌剂中的应用。

[0021] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

[0022] 本发明松针多糖和松针多酚提取通过BBD响应面方法并充分利用松针多糖提取中获得的上清液得到的优化工艺条件具有得率高，确实可靠，操作简便等特点，同时所得松针
多糖和松针多酚具有较好的抗氧化和抗菌、杀菌活性，对于松针资源的研究开发具有重要
的实践意义和应用价值。

附图说明

[0023] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

[0024] 图1是本发明工艺流程图。

[0025] 图2是提取时间与超声功率的交互作用对多糖得率影响。

[0026] 图3是提取时间与提取温度的交互作用对多糖得率影响。

[0027] 图4是提取时间与液料比的交互作用对多糖得率影响

[0028] 图5是超声功率与提取温度的交互作用对多糖得率影响。

[0029] 图6是超声功率与液料比的交互作用对多糖得率影响。

[0030] 图7是提取温度与液料比的交互作用对多糖得率影响。

[0031] 图8是乙醇浓度与提取温度的交互作用对多酚得率影响。

[0032] 图9是乙醇浓度与提取时间的交互作用对多酚得率影响。

[0033] 图10是乙醇浓度与超声波功率的交互作用对多酚得率影响

[0034] 图11是提取温度与提取时间的交互作用对多酚得率影响。

[0035] 图12是提取温度与超声波功率的交互作用对多酚得率影响。

[0036] 图13是提取时间与超声波功率的交互作用对多酚得率影响。

具体实施方式

[0037] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0038] 实施例1

[0039] 湿地松松针中同时分级提取松针多糖与多酚的方法，包括以下步骤：

[0040] 步骤1，取7月份采集的湿地松松针，用水洗净，在室温下晾干外表水，然后在室温下将松针晾干，用粉碎机粉碎、过筛，将所得的松针粉末密封储于‑20℃冰箱中，以备后用。

[0041] 步骤2，在单因素实验基础上，根据Box‑Behnken的中心组合设计原理，以液料比，提取时间，提取温度和超声功率四个因素为自变量(分别以X1，X2，X3，X4表示)，以松针多糖
得率为响应值设计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验，其实验点分为24个析
因点和5个零点。

[0042] 步骤3，对实验所得松针多糖提取液抽滤得到多糖提取后的松针粉末及多糖上清液。然后对多糖上清液进行旋蒸浓缩，再用无水乙醇在低温下沉降，抽滤获得松针多糖和上
清液，然后用丙酮洗涤杂质，最后冷冻干燥得到松针多糖。

[0043] 步骤4，以步骤3松针多糖提取后所得的松针粉末为原料，松针多糖沉淀后抽滤所得的上清液为提取剂，根据Box‑Behnken的中心组合设计原理，以乙醇浓度，提取时间，提取
温度和超声功率四个因素为自变量(分别以Y1，Y2，Y3，Y4表示)，以松针多酚得率为响应值设
计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验，其实验点分为24个析因点和5个零点。

[0044] 步骤5，将得到的提取液合在一起进行抽滤的多酚抽提液，然后进行柱层析分离纯化，得到松针多酚纯化液，然后旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到松针多酚。

[0045] 具体操作流程为：

[0046] 1.松针多糖提取工艺优化与制备

[0047] 在单因素实验的基础上，选定液料比，提取时间，提取温度和超声功率四个因素进行响应面优化实验。

[0048] (1)响应面实验设计表：

[0049] 表1四因素三水平响应面分析实验设计表

[0050]

[0051] 实验以随机次序进行，将实验所得的松针多糖得率用Design‑Expert 8.06程序进行分析，并得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表。响应面实验设计与结果见表
2。

[0052] (2)响应面中心组合设计(BBD)设计与实验结果表：

[0053] 表2松针多糖响应面BBD设计方案及实验结果

[0054]

[0055]

[0056] (3)模型的建立与方差分析

[0057] 根据Box‑Behnken中心组合设计原理，利用Design‑Expert.V8.0.6软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，可得提取时间、超声功率、提取温度及料液比与松针多糖得率
之间相互关系的二次多元回归方程:

[0058] 松针多糖得率(％)＝6.92+0.11X1‑0.2X2+0.15X3+0.096X4‑0.12X1X2+0.45X1X3‑2 2 2 2
0.37X1X4‑0.19X2X3+0.41X2X4+0.13X3X4‑0.76X1‑0.74X2‑0.18X3‑0.59X4

[0059] 式中X1、X2、X3、X4的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对松针多糖得率的影响程度，系数的正负反映出松针多糖得率增加或减小。对表2中的实验结果进行统计分
析，分析结果如表3所示。

[0060] 表3响应面回归模型的方差分析

[0061]

[0062]

[0063] 注：“**”表示P＜0.01，差异极其显著；“*”表示P＜0.05，差异显著；“‑‑”表示P＞0.05，差异不显著。

[0064] 由表3可知，模型的一次项中超声功率(X2)对松针多糖的影响最显著；二次项中的提取时间(X1)和超声功率(X2)和液料比对松针多糖的影响均达到极显著水平(p＜0.05)。由
F值可知，各因素对松针多糖得率的影响次序为：超声功率(X2)＞提取温度(X3)＞提取时间
(X1)＞液料比(X4)。整体模型的Prob>F值小于0.01，表明该回归模型达到极显著水平；回归
2
模型的相关系数R＝

[0065] 0.9109，且失拟项不显著(Prob>F值为0.4265，大于0.05),说明模型与数据之间拟合度很好，因此可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。

[0066] 同时做出中心组合设计实验所得的三组响应面曲面图，参见附图2、附图3、附图4、附图5、附图6和附图7。

[0067] (4)松针多糖最佳提取条件的预测与检验

[0068] 响应面图形是特定的松针多糖的率响应值对应的因素X1、X2、X3、X4构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。
图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的实验方
案。

[0069] 在实验范围内，通过Design‑Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测，得出松针多糖的最优提取工艺条件为：提取时间33.96min，超声功率270W，提取温度65℃，液料比
24.83:1，在此优化条件下，做三组平行试验。所得湿地松松针多糖得率均值为7.44％，与理
论预测值7.05％相差仅0.39％。本发明的多糖优化提取工艺条件下的松针多糖得率比现有
报道的松针多糖得率都要高。说明了回归方程的预测值与实验值之间具有较好的拟合度。
因此，基于响应面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实用价值。

[0070] 2.松针多糖提取后松针多酚提取工艺优化与制备

[0071] 以松针多糖提取后所得的松针粉末为原料，以松针粗多糖沉淀后所得的上清液为提取剂(经过实验测试，其上清液中含有较多的松针多酚)进行松针多酚单因素实验，在此
基础上，选定乙醇浓度，提取时间，提取温度和超声功率四个因素进行响应面优化实验。

[0072] (1)响应面实验设计表：

[0073] 表4松针多酚四因素三水平响应面分析实验设计表

[0074]

[0075] 实验以随机次序进行，将实验所得的松针多糖得率用Design‑Expert 8.06程序进行分析，并得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表。响应面实验设计与结果见表
5。

[0076] (2)松针多酚响应面中心组合设计(BBD)设计与实验结果表：

[0077] 表5响应面BBD设计方案及实验结果

[0078]

[0079]

[0080] (3)模型的建立与方差分析

[0081] 根据Box‑Behnken中心组合设计原理，利用Design‑Expert.V8.0.6软件对表5中的实验数据进行多元回归拟合，可得乙醇浓度、提取时间、提取温度及超声功率与松针多酚得
率之间相互关系的二次多元回归方程:

[0082] 松针多酚得率(％)＝1.72‑0.21Y1‑0.044Y2+0.082Y3‑(2.14E‑03)Y4‑0.062Y1Y2‑‑03 2 2 2
0.051Y1Y3+(5.35E )Y1Y4‑0.092Y2Y3‑0.021Y2Y4+0.08Y3Y4‑0.19Y1 ‑0.11Y2 ‑0.19Y3 ‑
2
0.061Y4

[0083] 式中Y1、Y2、Y3、Y4的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对松针多酚得率的影响程度，系数的正负反映出松针多糖得率增加或减小。对表6中的实验结果进行统计分
析，分析结果如表3所示。

[0084] 表6响应面回归模型的方差分析

[0085]

[0086]

[0087] 注：“**”表示P＜0.01，差异极其显著；“*”表示P＜0.05，差异显著；“‑‑”表示P＞0.05，差异不显著。

[0088] 由表6可知，该模型的F值为11.87，P＜0.0001,这表明该模型为极显著的水平。模2 2 2
型一次项Y1和Y3影响显著(p＜0.05)，二次项Y1 、Y2 和Y3影响均显著(p＜0.05)。交互项除
Y2Y3以外，其余五个交互项影响均不显著(p＞0.05)。该模型的各项方差分析中F值的大小可
以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对湿地松松针多酚得率影响的顺序为：Y1
＞Y3＞Y2＞Y4，即乙醇浓度对湿地松松针多酚的提取得率影响最大，提取时间和提取温度次
之，超声功率对其影响最小。失拟误差项的P＝0.5204＞0.05，说明实验不存在失拟因素，模
2
型的相关系数R ＝0.9223，说明松针多酚的实际得率和这个模型的预测的结果具有很好的
拟合度，这表明优化得到的松针多酚的提取工艺条件是可信的，多酚得率的结果可以用此
模型进行预测分析。

[0089] 同时做出中心组合设计实验所得的响应面曲面图，参见附图8、附图9、附图10、附图11、附图12和附图13。

[0090] (4)松针多酚最佳提取条件的预测与检验

[0091] 为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，我们通过Design‑Expert.V 8.0.6软件绘制响应面曲线图来进行可视化分析，可以直观地反映各因素的交互
作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型
最大值，即为最优的实验方案。

[0092] 在实验范围内，通过Design‑Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测，得出松针多酚的最优提取工艺条件为：乙醇浓度为24.24％、提取温度57.67℃、提取时间44.02min、
超声功率426.06W，在此优化条件下，做三组平行试验，所得湿地松松针多酚得率均值为
1.763％，与理论预测值1.802％相差2.16％。按此优化条件继续对湿地松粉末进行多次提
取，直至所得多酚提取液的得率小于0.001％，最后几次提取所得到的多酚含量总和即得到
松针粉末中多酚的总含量2.074％。本发明的优化工艺条件下的松针多酚得率处于现有文
献报道的松针多酚得率的中间位置，比文献报道的红松松针多酚得率要低，究其原因主要
是本发明采用的是湿地松松针为原料，其材料中的多酚含量要比红松松针要低。说明了回
归方程的预测值与实验值之间具有较好的拟合度。因此，基于响应面法所得的优化工艺参
数准确可靠，具有实际应用价值。

[0093] 实施例2

[0094] 湿地松松针中同时分级提取松针多糖和松针多酚的方法，包括以下步骤：

[0095] 步骤1，将7月份采集到的湿地松松针10kg，用水洗净，在常温下晾干外表水，然后在室温下将松针晾干，用粉碎机粉碎、过60目筛，将所得的松针粉末密封储于‑20℃冰箱中，
以备后用。

[0096] 步骤2，在松针粉末中按24.83:1(mL：g)的比例加入蒸馏水，在超声功率270W，提取温度65℃条件下在超声波破碎仪里提取时间33.96min。所得多糖粗提液在4℃低温沉降、抽
滤、除杂、冷冻干燥后，得到松针多糖740.8g，所得湿地松松针多糖得率为7.408％，即
7.40g/100g松针干粉。

[0097] 步骤3，利用步骤2中松针多糖提取后所得的松针粉末(总重量为9.1kg)，以松针粗多糖沉淀后所得的上清液为提取剂。按45mL/g的比例加入提取剂，乙醇浓度为24.24％、提
取温度57.67℃、超声功率426.06W的条件下超声提取44.02min，然后进行抽滤、40℃旋蒸浓
缩、大孔树脂分离纯化、再旋蒸浓缩、冷冻干燥得到松针多酚171.5g，所得湿地松松针多酚
得率为1.715％，即1.715g/100g松针干粉。根据前面所得的湿地松松针粉末的多酚总量为
2.074％可知，在本发明的优化条件下，松针多酚的一次提取率达到82.3％。

[0098] 测试例

[0099] 1、松针多糖与松针多酚抗氧化作用

[0100] (1)DPPH清除率的测定

[0101] 首先称量5mg DPPH加入棕色容量瓶中，再加入167mL甲醇，得到所需浓度的DPPH试剂，用移液管吸取配制好DPPH试剂3.9mL放入干净的棕色容量瓶中，用移液枪精准并且迅速
的加入0.1mL用二甲基亚砜(DMSO)溶解的不同浓度梯度松针多酚或多糖样品溶液，其中松
针多酚或多糖来自实施例2，迅速混合均匀后，在25℃左右条件下避光反应30min，然后再用
紫外分光光度计在750nm波长下测定OD值，得A样品值。另取3.9mL DPPH试剂，加入0.1mL溶
剂，同样迅速摇匀后，在室温(25℃左右)、黑暗条件下反应30min，然后再在415nm波长下测
定吸光度值，得A空白值。

[0102] DPPH清除率％＝[(A空白‑A样品)/A空白]×100％

[0103] (2)总抗氧化能力的测定

[0104] 将实施例2纯化后的多糖、多酚样品用DMSO溶解，配制成1mg/mL的样品溶液，再依次将其稀释为浓度为0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的稀释液。

[0105] 按T‑AOC试剂盒的说明书(说明书中表格)加入相应的试剂。

[0106] 试剂二应用液为将厂家提供的试剂二加入到200mL蒸馏水里。由于试剂二较为难溶，因此可以在37℃中水浴将其溶解；试剂三的应用液为提供的试剂三与溶剂三按照1:19
比例将两种试剂混合均匀。(见表7)。

[0107] 表7总抗氧化能力测定操作表

[0108]

[0109] 总抗氧化能力的定义为：37℃条件下，每分钟每毫升样液使反应体系的吸光度增加0.01时为一个总抗氧化能力单位，可按照下面提供的公式进行计算：

[0110] (3)实验结果

[0111] 松针多糖和松针多酚清除DPPH自由基结果如表8所示。

[0112] 表8松针多糖和松针多酚对DPPH自由基清除作用

[0113]

[0114] 表9松针多糖和松针多酚的总抗氧化能力

[0115]

[0116] 其中，总抗氧化能力计算方法为：

[0117]

[0118] 由表8结果可知，松针多糖和松针多酚与阳性对照VC的相差不大，所以松针多糖和松针多酚对DPPH自由基具有较好的清除作用。表9中结果表明，1g松针多酚和松针多糖分别
相当于123.03mg和79.17mg的VC的总抗氧化力，进一步说明松针多酚和多糖具有抗氧化能
力，且松针多酚抗氧化能力强于松针多糖。

[0119] 2，松针多糖与松针多酚抗菌作用

[0120] (1)供试菌种：

[0121] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 26112)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 87394)、李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19115)和枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis ATCC 6633)，灰绿青霉(Penicillium chrysogenum ATCC 10106)

[0122] (2)培养基：

[0123] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1.5％‑2.0％(液体培养基不含琼脂)，水1000mL，pH7.0‑7.2(使用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH)。

[0124] 马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，自来水1000mL。

[0125] (3)菌悬液的配制：

[0126] 从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5mL，加入无菌水倍比稀
5 6 ‑1
释到10‑10mL ，备用。

[0127] (4)供试药物：

[0128] 对照药：头孢拉定；样品：实施例1所得的常熟白芹挥发油。

[0129] (5)抑菌活性的测定：

[0130] 采用滤纸片法测定抑菌活性。使用打孔器，将定性滤纸制成小圆纸片(D＝6mm)，高压灭菌后备用。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入相应菌种的培养基25.00mL，冷却凝
固后制成固体平板。将上述接种活化好的各种菌分别取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀
6 7
释成含菌量为10～10CFU/mL的菌悬液备用(其中真菌采用显微镜血球计数板计数，用接种
环挑取真菌于无菌生理盐水中，调整稀释均匀后吸取一部分置于血球计数板(16×25规格)
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中，使得其在显微镜下观测视野中每个中方格中孢子数为14～18个，成为10～10个/mL的
孢子菌悬液)。

[0131] 将灭完菌的干燥的滤纸片用镊子夹到配制好的溶液(用DMSO稀释配制)中浸泡30min，用无菌镊子在试管壁上弄去多余溶液，放到上述的各个含菌培养皿上，每个培养皿
上放置三片滤纸片，细菌于37℃倒置培养24h，真菌于28℃倒置培养48h后观察结果。培养时
间到后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方
向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径
的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。

[0132] (6)实验结果

[0133] 抑菌活性测定结果如表10和表11所示。

[0134] 表10松针多糖的抑菌作用

[0135]

[0136] 表11松针多酚的抑菌作用

[0137]

[0138] 备注：针对Escherichiacoli，Bacillussubtilis，Staphylococcusaureus和Listeriamonocytogenes三种受试菌的挥发油浓度均为5mg/mL，而对Penicilliumglaucum
使用的挥发油浓度为20mg/mL；抑菌圈直径含滤纸片直径6.0mm。

[0139] 由表10和表11可知，实施例2所得的松针多糖和松针多酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌和灰绿青霉均具有较强的抑菌活性，且对大肠杆菌的抑菌活
性最强。

[0140] 通过以上实例可以发现，本发明的关于松针多糖和松针多酚提取的优化工艺条件具有得率高，确实可靠，操作简便等特点，同时也具有较好的抗氧化和抗菌、杀菌活性，对于
松针资源的研究开发具有重要的实践意义和应用价值。

[0141] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变
动仍处于本发明创造的保护范围之中。