一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法转让专利
申请号 : CN202110921205.3
文献号 : CN113788893B
文献日 : 2022-08-09
发明人 : 蒋蔚 , 韩先干 , 王权 , 张海洋 , 张传印 , 叶方钰
申请人 : 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)
摘要 :
一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。本发明中单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列ETS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。本发明基于抗霍乱弧菌的特异性单克隆抗体(VC27112)建立了霍乱弧菌免疫磁珠富集分离方法，该方法具有快速、捕获率高、特异性高和敏感性好的特点。
权利要求 :
1.一种抗霍乱弧菌的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，LCDR2的氨基酸序列为ETS，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:
3所示，HCDR 2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
4.一种标记有如权利要求1 3任一项所述单克隆抗体的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠。
~
5.如权利要求4所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠，其特征在于，其制备方法包括使用活化的磁珠标记所述的单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠，其特征在于，所述活化的磁珠的直径为1 2 μm。
~
7.如权利要求6所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠，其特征在于，所述活化的方法包含如下步骤：（1）将待活化的磁珠与MEST溶液混合；
（2）加入EDC和NHS的混合溶液。
8.如权利要求7所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠，其特征在于，所述MEST溶液的pH为6。
9.如权利要求7所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠，其特征在于，步骤（2）中所述EDC和所述NHS的体积比为1:1，浓度均为5 mg/mL。
10.一种如权利要求4 9任一项所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠在富集分离霍乱弧菌~中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述富集包括以下步骤：（1）将如权利要求4 9任一项所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠与样品在偶联缓冲液中~孵育40 50min；
~
（2）计算捕获率。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述富集的反应体系的体积与磁珠的相对用量为5mL : 0.8mg或者10 mL : 1.2 mg。
说明书 :
一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠
及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于病原菌分离技术领域，具体涉及一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
[0002] 食源性病原微生物是引发食品安全问题的主要因素，具有群发、暴发、宿主范围广、传播速度快和社会影响与控制难度大等特点，严重时会引起社会恐慌，危及社会安定。海洋弧菌污染是威胁水和水产品质量的重要问题之一，其中，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，曾在世界上发生过几次大流行，至今仍未完全平息，是我国传染病法规定的甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一。养殖用水在霍乱的传播及流行中起着重要作用，霍乱弧菌随水体流动、水/海产品及其运输而传播。近年来，国内外关于在鲑鱼、甲鱼、鲍鱼、牛蛙等养殖用水中检测到霍乱弧菌的报道一直不断，水中或鱼类、毛蚶、螺蛳等海产品表面或体内常存留有各种致病性弧菌等，若生食或食用时加热不彻底，可引起急性胃肠炎、菌血症、败血症、尿路感染、皮肤和软组织感染、脑膜炎、细菌性肺气肿等疾病。
[0003] 对于食品中病原微生物的分析，往往需要在病原菌浓度足够高时还能做到实时检测，除了提高检测方法的灵敏性，还可以利用样品前处理方法，去除水或水产品成分中存在干扰性物质，去除难以忽略的背信号景干扰，以此提高后续检测方法的灵敏度及特异性。在众多预富集技术中，基于抗原抗体反应的免疫磁分离技术组合各种下游检测技术是目前病原微生物检测体系研究的热点，该技术已经广泛地用于病原微生物的快速富集和检测应用中。将免疫磁珠分离技术用于样品前处理有诸多优点，如缩短微生物检测的培养时间、去除基质中影响测定的物质、减少需提供的样本量等等，从而实现微生物的快速富集，尤其对于原始浓度低的样品，预富集技术有利于提高分析方法的准确度，拓展应用范围，同时还可以帮助改进检测低水平病原或散发性污染所需的采样技术。
[0004] 基于抗原抗体反应的免疫磁分离技术中，获得特异性单克隆抗体是其最关键的技术，亲和力高、特异性好的单克隆抗体是免疫磁珠技术达到高捕获率和高特异性的必要条件，单克隆抗体与磁珠偶联制备免疫磁珠，进一步通过优化多种反应条件，在磁场的作用下，可实现样品中的病原微生物的快速、高效和特异性的富集，进而用于目标病原的分离和检测。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的富集和检测食品和水中霍乱弧菌的方法的快速、特异性、捕获率和敏感度难以兼顾等缺陷，提供一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法。
[0006] 本发明提供一种抗霍乱弧菌的特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列ETS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。
[0007] 较佳地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的序列。
[0008] 更佳地，所述单克隆抗体的轻链包含如SEQ ID NO:7所示的序列，重链包含如SEQ ID NO:9所示的序列。
[0009] 本发明还提供一种标记有如上所述单克隆抗体的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠。
[0010] 所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠可通过本领域常规的制备方法进行制备。如，所述制备方法包括使用活化的免疫磁珠标记所述的单克隆抗体。
[0011] 其中，所述免疫磁珠可为本领域常规，例如：海狸公司4种不同规格的磁珠，DM3‑020(直径180nm)、DM3‑050(直径750nm)、70104‑5(直径1000nm)和70102‑5(直径2000nm)。本发明中优选直径为1～2μm的免疫磁珠。
[0012] 本发明中活化免疫磁珠的方法优选包含如下步骤：
[0013] (1)将待活化的免疫磁珠与MEST溶液混合；所述MEST溶液的pH优选6；
[0014] (2)加入EDC和NHS的混合溶液。
[0015] 较佳地，步骤(2)中所述EDC和所述NHS的体积比为1:1，浓度均为5mg/mL。
[0016] 本发明还通过如上所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠在富集分离霍乱弧菌中的应用。
[0017] 较佳地，所述富集包括以下步骤：
[0018] (1)将如上所述的捕获霍乱弧菌的免疫磁珠与样品在偶联缓冲液中孵育40～50min；
[0019] (2)计算捕获率。
[0020] 所述富集的反应体系的体积与磁珠的相对用量可为本领域常规，优选5mL:0.8mg或者10mL:1.2mg。
[0021] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0022] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0023] 本发明的积极进步效果在于：
[0024] 为建立针对霍乱弧菌的快速富集和检测的方法，本研究利用霍乱弧菌免疫小鼠，经细胞融合筛选，制备了针对霍乱弧菌的单克隆抗体，该抗体特异性好、敏感性高。最终，本发明制备得到的单克隆抗体的效价高(例如可达1:5120000)，且所述单克隆抗体的特异性强；并适用于单克隆抗体免疫磁珠的制备，制备得到的单克隆抗体免疫磁珠对于霍乱弧菌具有较高的捕获率，可达90％以上；具有较高的特异性，不与其他弧菌和常见食源性细菌反2
应；敏感性强，当捕获体系内细菌数量约为10CFU时，免疫磁珠的捕获率仍在80％以上。当反应体系扩大到5mL和10mL时，捕获率仍可达到85％以上。
应；敏感性强，当捕获体系内细菌数量约为10CFU时，免疫磁珠的捕获率仍在80％以上。当反应体系扩大到5mL和10mL时，捕获率仍可达到85％以上。
附图说明
[0025] 图1显示不同粒径的磁珠对霍乱弧菌捕获率的影响。
[0026] 图2显示最适免疫磁珠使用量的确定。
[0027] 图3显示不同捕获时间对霍乱弧菌捕获率的影响。
[0028] 图4显示特异性检测结果。
[0029] 图5显示敏感性检测结果。
[0030] 图6显示不同的反应体系对磁珠捕获率的影响。
[0031] 图7显示5ml捕获系统优化。
[0032] 图8显示10mL捕获系统优化。
具体实施方式
[0033] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034] 以下实施例中涉及：4种霍乱弧菌(霍乱弧菌VC0901、霍乱弧菌VC0903、霍乱弧菌VC0904、霍乱弧菌VC0907)、4种非霍乱弧菌属(副溶血弧菌SH112、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌Vm‑290、创伤弧菌ATCC27562)和4种非弧菌菌株(沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550)。
[0035] 其中，所有弧菌菌株都在新鲜的3％NaCl LB培养基上生长，并在37℃下培养。其他细菌菌株在新鲜LB培养基上培养，并在37℃下培养。
[0036] BALB/c小鼠和昆明鼠购自上海杰思捷生物有限公司。
[0037] Prime STAR DNA聚合酶、限制性内切酶、胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；卡那霉素(Kan)购自Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。弗氏佐剂、聚乙二醇(PEG 6000)、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、青链霉素(PS)及L‑谷氨酰胺(LG)均是美国Sigma公司的产品；脱脂奶粉购自生工生物工程股份有限公司；无血清细胞冻存液购自苏州新赛美生物技术有限公司；抗体亚型鉴定试剂盒购自Southern Biotech有限公司。Trizol试剂是Invitrogen公司的产品；Prime Script去DNA反转录试剂盒和是Thermo生物科技有限公司的产品。
[0038] HT贮存液(100×)：38.8mg胸腺嘧啶脱氧核苷和136.1mg次黄嘌呤加入50mL ddH2O溶解定容至100mL，置于45℃水浴使其完全溶解，使用0.22μm滤膜过滤分装，‑20℃保存备用。
[0039] A贮存液(100×)：1.76mg氨基蝶呤加入适量dd H2O溶解，加入1mL的1mol/L NaOH，用dd H2O定容至100mL，使用0.22μm滤膜过滤分装，‑20℃保存备用。
[0040] 20％FBS培养基：1mL青链霉素(PS)、1mL L‑谷氨酰胺(LG)、20mL胎牛血清(FBS)和78mL DMEM，4℃保存备用。
[0041] HT培养基：1mL LG、1mL PS、1mL HT、20mL FBS和77mL DMEM，4℃保存备用。
[0042] HAT培养基：1mL A、1mL HT、1mL LG、1mLPS、20mL FBS和76mL DMEM，4℃保存备用。
[0043] ELISA包被液(pH 9.6)：0.848g Na2CO3和1.428g NaHCO3加入ddH2O定容至0.5L，置于4℃保存。
[0044] ELISA底物显色液：A液配制方法为冰醋酸6mL，乙酸钠2.45g和30％双氧水0.3mL加入ddH2O定容至500mL；B液配制方法为0.2g乙二胺四乙酸二钠，0.95g柠檬酸，0.15g TMB和50mL甘油加入ddH2O定容至500mL；使用时将上述A液与B液按照1:1的比例混合(现用现配)。
[0045] ELISA封闭液(5％脱脂乳)：5g脱脂乳溶于PBST定容至100mL。
[0046] ELISA终止液(2M H2SO4)：11mL 98％浓硫酸缓慢加入89mL ddH2O，同时搅拌，置于4℃保存。
[0047] ELISA洗涤缓冲液(1×PBST，pH 7.2)：8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4、和0.2g KCl加入ddH2O定容至1000mL，溶解后加入0.5mL吐温‑20。
[0048] 乳化仪购自Amalgamator公司，台式低温离心机购自Thermo Fisher科技有限公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司；多功能酶标仪购自美国BIOTEK公司；凝胶成像系统购自Bio‑Rad中国公司。
[0049] LB液体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨定容至1L去离子水中，pH调节至7.4，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。LB固体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨和15g琼脂粉定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，配制平板后4℃保存备用。BHI液体培养基、TSB液体培养基和THB液体培养基购自BD生物技术有限公司。2‑(N‑吗啉基)乙磺酸,4‑吗啉乙磺酸(MES)：购自SIGMA公司，货号：M3671‑50G。1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)：购自Thermo scientific公司，货号：PA184225。N‑羟基邻苯二甲酰亚胺(NHS)：购自SIGMA公司。活化缓冲液MEST：取0.488g的MES溶于100mL ddH2O，NaOH调pH至6.0，加入50μL Tween‑20，0.22μm滤器过滤。4℃存储。偶联缓冲液MEST：取0.488g的MES溶于100mL ddH2O，NaOH调p H至7.0，加入50μL Tween‑20，0.22μm滤器过滤。4℃存储。EDC溶液：4℃储存的MES配制5mg/mL EDC(25mM，p H6.0)，0.22μm滤器过滤。NHS溶液：4℃储存的NHS配制5mg/mL NHS(25mM，pH6.0)，0.22μm滤器过滤。现配现用。封闭液：1％BSA的PBST(pH7.4)，0.22μm滤器过滤。4℃存储。储存液：0.2g NaN3和5g BSA，溶于
1000mL 0.01M的PBST(pH7.4)，后0.22μm滤器过滤。4℃存储。DM3‑020(直径180nm)、DM3‑050(直径750nm)、70104‑5(直径1000nm)和70102‑5(直径2000nm)超顺磁性纳米磁珠购自苏州海狸生物医学工程有限公司。
1000mL 0.01M的PBST(pH7.4)，后0.22μm滤器过滤。4℃存储。DM3‑020(直径180nm)、DM3‑050(直径750nm)、70104‑5(直径1000nm)和70102‑5(直径2000nm)超顺磁性纳米磁珠购自苏州海狸生物医学工程有限公司。
[0050] 实施例1霍乱弧菌免疫原的制备
[0051] 将霍乱弧菌培养至OD600值为1.0时，加入终浓度为0.3％的甲醛，37℃摇床200rpm灭活4h。后各取1mL菌液置于1.5mL EP管中，12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用PBS离心洗10
涤5次。后将4种细菌的菌液等量混合，用PBS调整菌液浓度为1.0×10 CFU/mL。初次免疫加入等量的弗氏完全佐剂，后期免疫加入等量的弗氏不完全佐剂，乳化90s。乳化后的菌液作为免疫原进行小鼠免疫。
涤5次。后将4种细菌的菌液等量混合，用PBS调整菌液浓度为1.0×10 CFU/mL。初次免疫加入等量的弗氏完全佐剂，后期免疫加入等量的弗氏不完全佐剂，乳化90s。乳化后的菌液作为免疫原进行小鼠免疫。
[0052] 实施例2动物免疫程序以及血清效价测定
[0053] 初次免疫原为菌液和等量的弗氏完全佐剂，第2‑4次是霍乱弧菌和等量的弗氏不完全佐剂，乳化90s后的进行小鼠免疫。第5次腹腔免疫时用生理盐水稀释霍乱弧菌至100μL小鼠的免疫程序如表1。
[0054] 表1小鼠免疫程序
[0055]
[0056] 将免疫Balb/C小鼠，第3次免疫后将收集小鼠血清，按1:2×103、1:4×103、1:8×3 3 3 3 3
10、1:16×10、1:32×10、1:64×10、1:128×10比例倍比稀释后，利用间接ELISA方法测定血清效价，健康小鼠血清作为阴性对照。选取最佳免疫小鼠，进行细胞融合。
10、1:16×10、1:32×10、1:64×10、1:128×10比例倍比稀释后，利用间接ELISA方法测定血清效价，健康小鼠血清作为阴性对照。选取最佳免疫小鼠，进行细胞融合。
[0057] 小鼠在3免后第7‑10d断尾取血，间接ELISA法测定小鼠的血清效价。实验结果显3
示，小鼠的血清效价在256×10以上(表2)。效价均较高，可以进行细胞融合。小鼠效价相对最高，将免疫原降低一半腹腔冲击免疫，加强免疫小鼠。
示，小鼠的血清效价在256×10以上(表2)。效价均较高，可以进行细胞融合。小鼠效价相对最高，将免疫原降低一半腹腔冲击免疫，加强免疫小鼠。
[0058] 表2免疫后小鼠血清水平的ELISA检测
[0059]
[0060] 间接ELISA实验步骤：
[0061] (1)将灭活后的霍乱弧菌(等比混合)用ELISA包被液稀释至1.0×109CFU/mL的包被液，向96孔酶标板中加入稀释好的包被液100μL/孔。无包被原作为空白对照，37℃孵育4h或者4℃包被过夜。
[0062] (2)包被结束后，弃去包被液，再使用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次，向每孔中加入5％脱脂乳(200μL/孔)，置于37℃温箱封闭2h。
[0063] (3)封闭完成后，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次后即为霍乱弧菌抗体ELISA检测板，保存于4℃备用。
[0064] (4)用5％FBS的PBST(1×PBST，pH 7.2)对待检血清进行倍比稀释，将倍比稀释后的血清加入霍乱弧菌抗体ELISA检测板(每孔加入100μL)，置于37℃温箱孵育2h。
[0065] (5)洗涤缓冲液洗涤霍乱弧菌抗体ELISA检测板3次，每孔加入(1：2000)的稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体100μL，置于37℃孵育1h。
[0066] (6)孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤3次，向每孔中加入显色液100μL，置于37℃孵育15min后，加入50μL终止液，最后使用酶标仪读取OD450下的吸光值。
[0067] 实施例3霍乱弧菌单克隆抗体的制备
[0068] 1、培养骨髓瘤细胞(SP2/0)
[0069] 将SP2/0细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中至完全融化，加入提前准备7mL空白DMEM培养基于15mL离心管中，1000rpm，离心8min，弃去上清后，使用适量的DMEM完全培养基重悬SP2/0细胞，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。每日注意观察细胞生长状态，待细胞生长至90％培养瓶底面时，进行分瓶操作。为了使融合时细胞处于最佳生长状态，融合前1天晚上将细胞更换新鲜培养基。将SP2/0细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中至完全融化，加入提前准备7mL空白DMEM培养基于15mL离心管中，1000rpm，离心8min，弃去上清后，使用适量的DMEM完全培养基重悬SP2/0细胞，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。每日注意观察细胞生长状态，及时更换培养基，待细胞生长至90％培养瓶底面时，进行分瓶操作。为了使融合时细胞处于最佳生长状态，融合前1天晚上将细胞更换新鲜培养基。
[0070] 2、饲养细胞的制备
[0071] 将6‑8周龄的昆明鼠通过眼球放血的方法处死，放入75％的酒精中浸泡5min。消毒结束后将小鼠腹部朝上固定于超净工作台内，使用经高压灭菌的剪刀和镊子按照常规操作沿腹白线剪开腹部皮肤，暴露腹膜，注意不要触碰腹膜。用5mL注射器将4mL DMEM培养基注入小鼠腹腔内，随后用镊子轻轻拍打小鼠腹腔50次左右，然后用原来的注射器从进针抽取腹腔中的培养基加入15mL离心管中，重复以上操作2‑3次，将收集到的腹腔冲洗液移至无菌的离心管，低速离心10min后，弃去上清，用50ml的HAT培养基重悬饲养层细胞，将饲养层细胞滴加至96孔细胞培养板中，置于5％CO2细胞培养箱中备用。
[0072] 3、细胞融合
[0073] (1)SP2/0细胞的准备：将生长状态良好的SP2/0细胞收集于离心管中，以1000rpm，8min离心后弃上清，重悬细胞并转移至融合管中。
[0074] (2)脾细胞的分离：将用于融合的小鼠进行安乐死，随后依次剪开小鼠开腹部皮肤、腹膜，充分暴露脏器，在小鼠内脏左侧，分离黏连在脾脏上的脂肪和其他结缔组织后，取出脾脏放入12孔细胞培养板，用空白DMEM培养基清洗表面后转入另一孔，用注射器吸取空白DMEM培养基反复冲洗脾脏，将脾细胞洗至透明，洗脱液以1000rpm，8min离心后弃上清，接着弃去上清，重悬备用。
[0075] (3)SP2/0和脾细胞的融合：混匀后转移至已经装有SP2/0细胞的融合管中，以1000rpm，8min离心并完全弃去上清，将融合管放在左手心拍打，剧烈震荡充分混匀两种细胞后，置于37℃温箱10min。在45s内时间均匀的加入1mL预热的PEG，作用90s后，适量的DMEM培养基终止PEG作用。接着将融合管在37℃作用10min后，以1000rpm，8min离心后弃去上清后用适量的20％FBS的HAT培养基重悬，稀释成不同浓度分别加入长有饲养层细胞的96孔板中(100μL/孔)，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0076] 4、阳性细胞的筛选
[0077] 每天适度观察生长状态，由于前3天最好不移动细胞培养板，所以暂时挑选其中一个观察。阳性细胞的筛选需要根据杂交瘤细胞生长状态，融合后8‑10d观察细胞生长状态，筛选并标记每孔中仅有单克隆细胞团生长的孔。抽取各单克隆孔上清各100μL，另补足HAT9
培养基。利用间接ELISA方法进行测定，包被缓冲液分别将霍乱弧菌液释为1.0×10CFU/mL包被96孔酶标板。同时阴性小鼠血清作阴性对照，空白对照为空白包被缓冲液，适量的细胞上清和PBST(含5％FBS)混合为100μL作为一抗，其余ELISA操作步骤同小鼠血清效价测定，鉴定阳性孔。
培养基。利用间接ELISA方法进行测定，包被缓冲液分别将霍乱弧菌液释为1.0×10CFU/mL包被96孔酶标板。同时阴性小鼠血清作阴性对照，空白对照为空白包被缓冲液，适量的细胞上清和PBST(含5％FBS)混合为100μL作为一抗，其余ELISA操作步骤同小鼠血清效价测定，鉴定阳性孔。
[0078] 5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆
[0079] 挑取细胞上清效价较高、生长状态良好的单克隆细胞株进行亚克隆。首先在显微镜下标记出阳性克隆的细胞位置，使用200μL的移液器吸取少量细胞转移至96孔细胞板中，用20％FBS的不完全培养基进行梯度稀释。于倒置显微镜下观察，选取每孔含有90‑120个细胞的孔，将该孔中液体转移至10mL 20％FBS的不完全培养基中，吹打混匀。然后滴加至含饲养细胞的96孔细胞板中(100μ/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。及时观察细胞生长状态并在3‑5天内适量补充培养基，待细胞生长至指甲盖大小时再次进行筛选及亚克隆操作，直至单克隆孔的细胞上清阳性率达到100％后，扩大培养并冻存同时做好标记。
[0080] 细胞融合后第3‑4d，镜检所有细胞培养孔，标记有1‑2个单克隆的96孔。细胞融合后第8‑9d，挑选长有单克隆细胞的培养上清进行效价检测。随后，选择效价值高、特异性良好的单克隆细胞株进行亚克隆。
[0081] 6、小鼠腹水的制备
[0082] 向雌性Balb/C小鼠腹腔中每7d注射0.5mL灭菌的石蜡油，共注射3次。接着向小鼠6
腹腔内注射0.5mL亚克隆后的阳性细胞(浓度为2×10/mL)和等体积量的灭菌石蜡油。注射后7‑15天，每天多次观察小鼠生理及精神状态，对精神萎靡、腹腔膨大、按压有波动感的小鼠，在濒临死亡时无菌收集腹水。腹水静置1‑2h后在4℃、5000rpm条件下离心30min。离心完成后腹水分为三层，其中中间层即为黄色透亮腹水。在超净台内，用移液枪收集腹水，分装保存于干净的EP管中，‑80℃冻存。
腹腔内注射0.5mL亚克隆后的阳性细胞(浓度为2×10/mL)和等体积量的灭菌石蜡油。注射后7‑15天，每天多次观察小鼠生理及精神状态，对精神萎靡、腹腔膨大、按压有波动感的小鼠，在濒临死亡时无菌收集腹水。腹水静置1‑2h后在4℃、5000rpm条件下离心30min。离心完成后腹水分为三层，其中中间层即为黄色透亮腹水。在超净台内，用移液枪收集腹水，分装保存于干净的EP管中，‑80℃冻存。
[0083] 实施例4单克隆抗体分析
[0084] 1、效价及特异性测定
[0085] 采用ELISA方法测霍乱弧菌特异性单克隆抗体的效价。使用包被缓冲液将灭活的9
霍乱弧菌VC0903菌液稀释为1×10 CFU/mL，每孔100μL包被96孔酶标板。抗体检测步骤同实施例2。将收集到的腹水单抗按照1:10,000、1:20,000、1:40,000、1:80,000、1:160,000、1:
320,000、1:460,000、1:1,280,000、1:2,560,000、1:5,120,000进行梯度稀释，每个浓度取
100μL加入各孔作为一抗，其余ELISA操作步骤同小鼠血清效价测定。同时设置阴阳性对照。
根据酶标仪测定其OD450值，通过P/N值≥2.1判定阳性值，呈阳性的最大稀释度即为抗体的效价。使用包被缓冲液将灭活的霍乱弧菌VC0903、副溶血弧菌ATCC33847、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:
H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550包被96孔酶标板，抗体检测步骤同实施例2测定单抗的特异性。
霍乱弧菌VC0903菌液稀释为1×10 CFU/mL，每孔100μL包被96孔酶标板。抗体检测步骤同实施例2。将收集到的腹水单抗按照1:10,000、1:20,000、1:40,000、1:80,000、1:160,000、1:
320,000、1:460,000、1:1,280,000、1:2,560,000、1:5,120,000进行梯度稀释，每个浓度取
100μL加入各孔作为一抗，其余ELISA操作步骤同小鼠血清效价测定。同时设置阴阳性对照。
根据酶标仪测定其OD450值，通过P/N值≥2.1判定阳性值，呈阳性的最大稀释度即为抗体的效价。使用包被缓冲液将灭活的霍乱弧菌VC0903、副溶血弧菌ATCC33847、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:
H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550包被96孔酶标板，抗体检测步骤同实施例2测定单抗的特异性。
[0086] 经过4次亚克隆后共筛选出1株单克隆抗体，命名为VC27112。以霍乱弧菌为包被原，间接ELISA方法测定腹水效价，具体方法同上。由结果(表3)可以看出，在稀释了5.12×6
10 倍时，OD450依然在0.4以上，同时P/N≥2.1,因此抗霍乱弧菌单克隆抗体的效价为1：
6
5.12×10 。以灭活的霍乱弧菌VC0903、副溶血弧菌SH112、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550包被原，将单克隆抗体进行50000倍稀释，测定抗体特异性，结果(表4)显示，所制备的单克隆抗体不与上述8种常见的食源性病原微生物发生反应，提示单克隆抗体特异性较好。
10 倍时，OD450依然在0.4以上，同时P/N≥2.1,因此抗霍乱弧菌单克隆抗体的效价为1：
6
5.12×10 。以灭活的霍乱弧菌VC0903、副溶血弧菌SH112、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、坂崎肠杆菌ATCC21550包被原，将单克隆抗体进行50000倍稀释，测定抗体特异性，结果(表4)显示，所制备的单克隆抗体不与上述8种常见的食源性病原微生物发生反应，提示单克隆抗体特异性较好。
[0087] 表3单克隆抗体的效价测定
[0088]稀释倍数 重复孔1 重复孔2
3
1:1×10 1.47 1.47
4
1:1×10 1.37 1.39
4
1:2×10 1.41 1.29
4
1:4×10 1.38 1.27
4
1:8×10 1.35 1.21
4
1:16×10 1.22 1.15
4
1:32×10 1.21 1.13
4
1:64×10 1.09 1.00
4
1:128×10 0.99 0.87
4
1:256×10 0.66 0.59
4
1:512×10 0.42 0.45
阴性 0.07 0.07
3
1:1×10 1.47 1.47
4
1:1×10 1.37 1.39
4
1:2×10 1.41 1.29
4
1:4×10 1.38 1.27
4
1:8×10 1.35 1.21
4
1:16×10 1.22 1.15
4
1:32×10 1.21 1.13
4
1:64×10 1.09 1.00
4
1:128×10 0.99 0.87
4
1:256×10 0.66 0.59
4
1:512×10 0.42 0.45
阴性 0.07 0.07
[0089] 表4单克隆抗体的特异性测定
[0090]
[0091]
[0092] 2、单克隆抗体的鉴定
[0093] 用灭活的霍乱弧菌包被96孔酶标板，使用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别对收集到阳性抗体进行抗体亚型鉴定，一抗稀释倍数为1:10,000，二抗为试剂盒中的抗体按1:300稀释倍数添加。利用抗体亚型鉴定试剂盒对单抗的亚型鉴定结果显示，抗体的轻链类型皆为Kappa型，重链类型为IgG1型。
[0094] 3、抗霍乱弧菌单抗序列的测定和分析
[0095] 为了鉴定抗体序列，使用Trizol试剂从杂交瘤细胞中分离总RNA。具体步骤：1)Trizol裂解：用1mL Trizol重悬全部细菌，吹打混匀静置3‑5min。(2)氯仿分相：每个样品加入0.2mL的氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡15s，室温放置充分作用3min后12,000rpm离心15min。(3)RNA沉淀：将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶EP管中，加入500μL的异丙醇使RNA分子沉淀，充分颠倒混匀。(4)RNA洗涤：轻轻吸出上清液(注意不要吸到白色沉淀)，在纸上控干，在沉淀中加入1mL 75％乙醇(750μL无水乙醇，250μL DEPC水，提前配制)，7,500rpm离心
5min。(5)RNA溶解：弃上清，干燥10min。加入适量DEPC水吹打溶解，置于冰上，测OD260/280。
5min。(5)RNA溶解：弃上清，干燥10min。加入适量DEPC水吹打溶解，置于冰上，测OD260/280。
[0096] 然后使用抗体恒定区特异性引物并利用Thermo逆转录试剂盒反转录为cDNA，并以相应的cDNA为模板用Ex Taq酶(Takara)和简并引物进行PCR扩增，随后测序，以获得单抗的重链和轻链的可变区序列。使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。测序结果显示单抗可变区的序列的胚系基因家族的基因片段(表5)。
[0097] 表5抗霍乱弧菌单抗可变区的胚系基因(IgBlast分析)
[0098]MAb VH DH JH VK JK
VC 8‑8*01 N/A 2*01 4‑70*01 1*01
VC 8‑8*01 N/A 2*01 4‑70*01 1*01
[0099] 注：VH，DH，JH分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段。
[0100] VK，JK分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。
[0101] 测序结果如下：
[0102] 轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:10)：
[0103]
[0104] 注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。
[0105] 轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
[0106]
[0107] 注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:6)，蓝色部分为恒定区序列，*为终止密码子。
[0108] 其中：
[0109] LCDR1：SSISY(SEQ ID NO:1)
[0110] LCDR2：ETS
[0111] LCDR3：HQRSSYPWT(SEQ ID NO:2)
[0112] 重链核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：
[0113]
[0114] 注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。
[0115] 重链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
[0116]
[0117]
[0118] 注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:8)，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。
[0119] 其中：
[0120] HCDR1：GFSLSTSGMG(SEQ ID NO:3)
[0121] HCDR2：IWWDDDK(SEQ ID NO:4)
[0122] HCDR3：SRIDPYYFDY(SEQ ID NO:5)
[0123] 实施例5霍乱弧菌免疫磁珠的制备
[0124] 1、免疫磁珠的活化
[0125] (1)取2mg(即200μL，10mg/mL)磁珠置于1.5mL EP管中，置于磁力架；静置1min，磁珠与上清分离后弃上清，加入500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)重悬磁珠，涡旋振荡器混合均匀，置于磁分离架上1min，弃上清，反复洗涤3次，每次1min，弃上清；
[0126] (2)加入200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)(现配现用)，混匀磁珠后，置于37℃摇床，200rpm/min，活化30min；
[0127] (3)取出，瞬离，放置磁力架1min，加入500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)，将磁珠混匀，转移到新的EP管中；
[0128] (4)磁分离，移除上清，500μL活化缓冲液(MEST，pH6.0)洗涤2次，用磁力架进行磁分离，移液器吸取上清，此时，磁珠表面的羧基已经活化，能够与带有伯胺基的生物配体进行共价偶联。
[0129] 2、免疫磁珠标记单克隆抗体
[0130] (1)500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH7.0)洗涤1次，弃上清；
[0131] (2)取新EP管，加入500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH7.0)，吸取适量腹水与偶联缓冲液中涡旋震荡，将混合物吸入装有磁珠的EP管中，混匀后置于旋转培养仪，30rpm/min，室温反应2h；
[0132] (3)偶联后，轻柔瞬离，将EP管置于磁分离架，静置1min，500μL PBST轻柔洗涤3次；
[0133] (4)加入1mL封闭液进行封闭，EP管置于37℃摇床，200rpm/min，封闭至少30min(或者4℃过夜)；
[0134] (5)取出，轻柔瞬离，置于磁力架，静置，弃上清，PBST洗涤4次，每次1min，弃上清；
[0135] (6)加入600μL储存液，重悬免疫磁珠，4℃保存，待用。
[0136] 3、免疫磁珠检测流程
[0137] 各细菌培养条件均为37℃，180rpm摇床增菌。待OD600为1.0时，用PBST对菌液进行10倍(或5倍)梯度稀释，吸取稀释后的菌液涂LB平板，计算原始菌液浓度。同时，吸取稀释后的菌液加入到新的EP管中，取适量偶联后的免疫磁珠(提前轻柔混匀)于其混匀，置于旋转培养仪，30r/min，室温反应。捕获结束后，轻柔瞬离，置于磁力架。吸取上清100μL，涂LB平板，计算磁珠捕获后，上清残留细菌数量。后500μL PBST轻柔洗涤免疫磁珠1次，适量PBST将磁珠重悬混匀，吸取100μL挂LB平板，计算磁珠捕获菌数。免疫磁珠捕获率计算公式如下：
[0138] 捕获率＝磁珠捕获菌数/(上清残留菌数+磁珠捕获菌数)
[0139] 4、免疫磁珠检测条件的优化
[0140] 1)免疫磁珠最佳直径的确定
[0141] 免疫磁珠的直径变化可对特定细菌的捕获造成较大的影响。本实验以霍乱弧菌4
VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10 CFU/mL，选择海狸公司4种不同规格的磁珠，DM3‑
020(直径180nm)、DM3‑050(直径750nm)、70104‑5(直径1000nm)和70102‑5(直径2000nm)进行偶联和捕获实验，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。
VC0903为目的菌，PBST梯度稀释至约10 CFU/mL，选择海狸公司4种不同规格的磁珠，DM3‑
020(直径180nm)、DM3‑050(直径750nm)、70104‑5(直径1000nm)和70102‑5(直径2000nm)进行偶联和捕获实验，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。
[0142] 不同粒径大小的磁珠制备的免疫磁珠效果不同，本次试验分别使用粒径为750、3
1000、1150、2000nm的磁珠制备免疫磁珠，用以捕获浓度为10CFU/mL的霍乱弧菌，在1mL反应体系进行捕获、四种粒径磁珠捕获率依次为12％、25％、65％和94％。捕获率最高的最佳磁珠为粒径2μm的磁珠(图1)三组平行实验。
1000、1150、2000nm的磁珠制备免疫磁珠，用以捕获浓度为10CFU/mL的霍乱弧菌，在1mL反应体系进行捕获、四种粒径磁珠捕获率依次为12％、25％、65％和94％。捕获率最高的最佳磁珠为粒径2μm的磁珠(图1)三组平行实验。
[0143] 2)免疫磁珠最佳数量的确定
[0144] 探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀3
释至约10 CFU/mL，运用免疫磁珠进行捕获实验。通过每管依次加入0.1、0.2、0.3、0.4及
0.5mg免疫磁珠用于确定免疫磁珠的最佳工作量，该实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳数量。
释至约10 CFU/mL，运用免疫磁珠进行捕获实验。通过每管依次加入0.1、0.2、0.3、0.4及
0.5mg免疫磁珠用于确定免疫磁珠的最佳工作量，该实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳数量。
[0145] 如图2所示，使用量在0.2mg之前时，随着磁珠用量上升捕获率也随之上升；而在磁珠用量超过0.2mg后，捕获率趋于缓慢增加，为了实现最大捕获率，当霍乱弧菌浓度约为3
10CFU/mL，磁珠使用量为0.4mg时，磁珠捕获率可达到95％以上，该磁珠使用量为最佳使用量。
10CFU/mL，磁珠使用量为0.4mg时，磁珠捕获率可达到95％以上，该磁珠使用量为最佳使用量。
[0146] 3)免疫磁珠最佳捕获时间的确定
[0147] 探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀3
释至约10CFU/mL，运用免疫磁珠进行捕获实验。分别选取捕获时间为10min、20min、30min、
40min、50min和60min为检测点，进行捕获。该实验重复3次，计算捕获率，确定最佳捕获时间。
释至约10CFU/mL，运用免疫磁珠进行捕获实验。分别选取捕获时间为10min、20min、30min、
40min、50min和60min为检测点，进行捕获。该实验重复3次，计算捕获率，确定最佳捕获时间。
[0148] 在10min‑40min之间时，随着时间增长，捕获率也从60％达到91％。捕获率在40min后超过90％，之后时间内基本平稳。出于快速富集的需要，本次试验选择的最佳捕获时间为40min(图3)。
[0149] 4)免疫磁珠检测方法的特异性检测
[0150] 使用霍乱弧菌VC0901、霍乱弧菌VC0903、霍乱弧菌VC0904、霍乱弧菌VC0907、副溶血弧菌ATCC33847、溶藻弧菌ATCC1749、拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌CICC21662等菌株检测免疫磁珠的特异性，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。
[0151] 如图4所示，对霍乱弧菌的捕获率均较高，除拟态弧菌ATCC33653外其余细菌捕获率均低于10％，其中溶藻弧菌ATCC1749、创伤弧菌ATCC27562、沙门氏菌CVCC503、大肠杆菌O157:H7ATCC35150、单核细胞增生李斯特菌CICC21662捕获率低于5％，证明本次制备出的免疫磁珠特异性良好。
[0152] 5)免疫磁珠检测方法的敏感性检测
[0153] 探索不同菌液浓度对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀1 2 3 4 5
释至约10、10、10、10、10CFU/mL，免疫磁珠使用量为0.4mg进行捕获实验。该实验重复3次，计算捕获率，确定该免疫磁珠的敏感性。
释至约10、10、10、10、10CFU/mL，免疫磁珠使用量为0.4mg进行捕获实验。该实验重复3次，计算捕获率，确定该免疫磁珠的敏感性。
[0154] 如图5，捕获体系内细菌数量约为102CFU时，免疫磁珠的捕获率仍在80％以上，提示该免疫磁珠拥有较高的敏感性。
[0155] 6)不同反应体系对免疫磁珠捕获率的影响
[0156] 探索不同反应体系对于捕获率的影响，以霍乱弧菌VC0903为目的菌，PBST梯度稀3
释至约10CFU/mL，将反应体系分别设置为50mL、25mL、10mL、5mL和1mL运用使用量为0.4mg的免疫磁珠进行捕获实验，重复3次，计算捕获率。
释至约10CFU/mL，将反应体系分别设置为50mL、25mL、10mL、5mL和1mL运用使用量为0.4mg的免疫磁珠进行捕获实验，重复3次，计算捕获率。
[0157] 如图6，随着体系体积的增长，捕获率有所下降。所以在反应体系5mL和10mL里进一步优化最佳磁珠量。
[0158] 通过在5mL和10mL的反应体系中使用不同磁珠量进行捕获霍乱弧菌，结果表明，在5mL体系中磁珠量为0.8mg时捕获率可达到90％以上(图7)。在10mL体系中磁珠量为1.2mg时捕获率达到85％左右，且随着磁珠量的增加捕获率基本稳定(图8)。以上结果说明即使扩大体系，本发明中涉及的磁珠捕获率仍然达到85％以上，提示本发明制备的单克隆抗体和相应的免疫磁珠具有很好的应用价值。