一种多粘类芽孢杆菌W33及其微生物育苗基质与应用

摘要

本发明具体涉及一种多粘类芽孢杆菌W33及其微生物育苗基质与应用，属于微生物的技术领域。该多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)W33，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23374，保藏日期为2021年09月08日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明还提供了一种含有多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质。本发明的多粘类芽孢杆菌W33可以高效抑制枝孢霉，其制备的微生物育苗基质可有效防治黄瓜在大棚种植中易爆发且危害性大的黄瓜黑星病。本发明的多粘类芽孢杆菌W33产植物生长激素IAA，其制备的微生物育苗基质可显著促进黄瓜生长。

权利要求

1.一种多粘类芽孢杆菌W33，其特征在于，该多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23374，保藏日期为2021年09月08日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种使用如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌W33制备的发酵液，其特征在于，制备方法如下：将多粘类芽孢杆菌W33在TSA培养基上划线三次，获得纯化的单菌落；将菌株W33单菌落接种至种子培养基上，并在32～36℃，160～180rpm培养12～16h，得到多粘类芽孢杆菌种子液；将种子液按照重量比1:50加入发酵培养基中，32～36℃，160～180rpm培养60～

70h，得到多粘类芽孢杆菌W33发酵液。

3.如权利要求2所述的发酵液，其特征在于，所述种子培养基中包含以下成分：蔗糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨2g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO4 1g/L。

4.如权利要求2所述的发酵液，其特征在于，所述发酵培养基包含以下成分：可溶性淀粉15g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨20g/L，CaCl2 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 

1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 0.5g/L。

5.一种含有如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质，其特征在于，含有如权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料；所述多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料的重量比为1:14～17。

6.如权利要求5所述的微生物育苗基质，其特征在于，所述育苗基质辅料混合物包括以下重量份的组分：辣椒秸秆发酵物2～3份，茄子秸秆发酵物1～2份，番茄秸秆发酵物1～2份，蛭石3～6份，珍珠岩3～6份，无机盐溶液0.5～1份。

7.如权利要求6所述的微生物育苗基质，其特征在于，所述辣椒秸秆发酵物、茄子秸秆发酵物和番茄秸秆发酵物为辣椒秸秆、茄子秸秆和番茄秸秆的木霉发酵物，具体制备方法9

为：将辣椒、茄子或番茄秸秆机械粉碎至1cm的短秸秆，按10cfu/kg的量混入非洲哈茨木霉Ta97的PDB发酵液，常温发酵30d，高压灭菌后晾干并粉碎至直径3～6mm。

8.如权利要求6所述的微生物育苗基质，其特征在于，所述无机盐溶液中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

9.如权利要求5所述的含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质在防止黄瓜黑星病中的应用。

10.如权利要求5所述的含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质在促进黄瓜生长中的应用。

说明书

一种多粘类芽孢杆菌W33及其微生物育苗基质与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物的技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌W33及其微生物育苗基质与应用。

背景技术

[0002] 设施作物生产过程中，育苗基质是种苗工厂化生产的基础物质。目前设施土壤连作障碍问题日趋严重，对健康抗病种苗的需求量不断增大。研究者通过向育苗基质中添加生防促生作用的功能菌，制备的微生物育苗基质对种苗抗病和促生具有积极作用。而功能菌株在基质中的活力持久性和在目标作物中的定殖能力影响了微生物育苗基质对栽培作物的作用效果以及持效性，需对常规育苗基质成分进行改良，以充分释放功能菌株效用。

[0003] 黄瓜是重要的设施蔬菜品种，在设施大棚种植环境中，由枝孢霉属(Cladosporium)引起的黄瓜黑星病是易爆发的病害之一，其发病时期早、持续时间长，幼苗、叶片、茎秆和果实均可出现病症。一旦大规模发病，则一般减产10％‑30％，并且造成果实畸形和斑点性腐烂。目前市场中的抗黑星病黄瓜品种不足，而田间的有效防治措施多采用苯并咪挫类、甲氧基丙烯酸酯类、三唑类农药，易驯化病原菌的耐药性，且持续使用对土壤、水体等造成污染。而利用生防菌拮抗枝孢霉防治黑星病的研究目前较少。

[0004] 多粘类芽孢杆菌是一种产芽孢、具有固氮能力的革兰氏阳性细菌，具有促生生防等生物特性，被美国环境保护署(EPA)列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业农村部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。在申请号为201810939677.X的专利中。登记的以多粘类芽孢杆菌为主要活性成分制备微生物育苗基质可有效防治辣椒疫病，并对辣椒苗有促进生长作用。目前未见利用多粘类芽孢杆菌为活性成分制备的微生物育苗基质可同时防治黄瓜黑星病和促进黄瓜苗生长的报道。

发明内容

[0005] 针对现有技术中未见以多粘类芽孢杆菌为活性成分的基质同时防治黄瓜黑星病和促进黄瓜苗生长的不足，本发明提供一种多粘类芽孢杆菌W33及其微生物育苗基质与应用，以解决上述技术问题。

[0006] 本发明的技术方案为：

[0007] 本发明的第一个目的，是提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)W33，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23374，保藏日期为2021年09月08日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0008] 该多粘类芽孢杆菌W33是从设施大棚辣椒根际分离、筛选出来的，并且可以采用TSA等常规细菌培养基进行培养。将菌株W33的16S rDNA测序序列，在Genbank中Blast比对结果表明，菌株W33与多粘类芽孢杆菌L1‑9(Genbank登记号：FJ178378)的同源性达到99.65％(Query Cover:100％,E value:0)。根据菌株的形态理化特征结合16S rDNA测序比对分析，将菌株W33鉴定为多粘类芽孢杆菌。所述菌株W33对枝孢霉的抑制率为80.31％，菌株W33产生植物生长素IAA含量为32.43mg/L。

[0009] 本发明的第二个目的，是提供一种多粘类芽孢杆菌W33的发酵液。将多粘类芽孢杆菌W33在TSA培养基上划线三次，获得纯化的单菌落；将菌株W33单菌落接种至种子培养基上，并在32～36℃，160～180rpm培养12～16h，得到多粘类芽孢杆菌种子液；将所述的种子液按照重量比1:50加入发酵培养基中，32～36℃，160～180rpm培养60～70h，得到多粘类芽孢杆菌W33发酵液。

[0010] 所述种子培养基中包含以下成分：蔗糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨2g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO4 1g/L，pH＝7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

[0011] 所述发酵培养基包含以下成分：可溶性淀粉15g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨20g/L，CaCl2 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 0.5g/L。pH＝
7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0012] 所述发酵液中多粘类芽孢杆菌W33的活菌数≥5×109CFU/mL。

[0013] 本发明的第三个目的，是提供一种含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质，所述育苗基质中，含有多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料混合物。所述多粘类芽孢杆菌W33发酵液和所述育苗基质辅料的重量比为1:14～17。所述基质中多粘类芽孢杆菌W33的活8
菌数≥3×10CFU/基质重量g。基质有机质含量≥25％，总养分(N+P2O5+K2O)含量2％～5％，水分(游离水)≤35％，pH＝6～7，EC≤2ms/cm。

[0014] 所述育苗基质辅料混合物包括以下重量份的组分：辣椒秸秆发酵物2～3份，茄子秸秆发酵物1～2份，番茄秸秆发酵物1～2份，蛭石(直径3～6mm)3～6份，珍珠岩(直径3～6mm)3～6份，无机盐溶液0.5～1份。

[0015] 所述辣椒秸秆发酵物、茄子秸秆发酵物和番茄秸秆发酵物为辣椒秸秆、茄子秸秆和番茄秸秆的木霉发酵物，具体制备方法为：将辣椒、茄子或番茄秸秆机械粉碎至1cm左右9
的短秸秆，按10 cfu/kg的量混入非洲哈茨木霉Ta97(非洲哈茨木霉Ta97公开于申请号为
202011309961.2的专利中)的PDB发酵液，常温发酵30d，高压灭菌后晾干并粉碎至直径3～
6mm，即为秸秆发酵物。

[0016] 所述无机盐溶液的成分中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

[0017] 所述的含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质在防止黄瓜黑星病中的应用。

[0018] 所述的含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质在促进黄瓜生长中的应用。

[0019] 本发明的有益效果为：

[0020] 本发明的多粘类芽孢杆菌W33可以高效抑制枝孢霉，其制备的微生物育苗基质可有效防治黄瓜在设施大棚种植中易爆发且危害性大的黄瓜黑星病。本发明的多粘类芽孢杆菌W33产植物生长激素IAA，其制备的微生物育苗基质可显著促进黄瓜生长。

[0021] 本发明提供的微生物育苗基质以设施大棚蔬菜秸秆发酵物代替了传统的泥炭，优点有二，其一，在我国设施蔬菜主产区比如寿光等地，大量的蔬菜秸秆直接废弃，造成农用地污染和资源浪费。泥炭是重要的土地资源，是一些稀有动植物生活、繁殖的良好场所，在自然平衡重占重要地位，秸秆发酵产物是泥炭的良好替代。本发明可在设施蔬菜产区当地高效利用废弃蔬菜秸秆，对环境保护具有促进作用；其二，多粘类芽孢杆菌W33采集自设施大棚，天然适应大棚栽培作物凋落腐殖质营养成分，对蔬菜秸秆发酵物消化性好，从而使该菌能在基质产品中长期稳定存活，180天活菌数为原始菌量的90％以上，且在黄瓜根际的定殖效果好，具有防病促生效果。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0023] 图1是本发明实施例1的TSA平板培养菌落图。

[0024] 图2是本发明实施例9中四种育苗基质种植对黄瓜黑星病病情程度的影响对比图。

[0025] 图3是本发明实施例10中四种育苗基质种植对黄瓜生长的影响对比图。

[0026] 图中，1‑待测样品，2‑对照样品1，3‑对照样品2，4‑对照样品3。

具体实施方式

[0027] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0028] 实施例1

[0029] 本发明提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)W33，已于2021年9月8日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.23374。该多粘类芽孢杆菌W33是从设施大棚辣椒根际分离、筛选出来的，并且可以采用TSA等常规细菌培养基进行培养。具体如下：

[0030] 1.1菌株分离

[0031] 采集设施大棚辣椒新鲜根系，用无菌水清洗至无肉眼可见的土壤颗粒附着。将根系转移至新的50mL Falcon离心管，加入30mL灭菌的1×PBS(pH＝7)，在室温下180r/min振荡15min。重复PBS清洗3次。将清洗后的根系取出并置于灭菌的滤纸上吸干根系表面的PBS。将根系切分成约2mm小段并混合，称出重量为1g的根系组织转移至50mL离心管。在无菌环境中加入10mL 10mM的灭菌MgCl2溶液重悬，然后用无菌捣杵研磨直至均质。用无菌水在无菌
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试管中梯度稀释至10、10、10 、10、10、10 和10倍，从各梯度中吸取100μL均匀涂布在TSA平板上。平板倒置培养于30℃微生物培养箱内1～3d，观察菌落生长情况。根据菌落形态特征，将差异菌落在新TSA平板上划线获得单菌落，重复划单菌落操作三次纯化株系。

[0032] 1.2菌株生防促生特性筛选

[0033] 枝孢霉分离纯化自黄瓜病果，经ITS测序鉴定为Cladosporium sp.。通过经典对峙平板试验，筛选对枝孢霉有显著抑制作用的菌株，其中菌株W33对枝孢霉的抑制率为80.31±1.35％。另外，通过经典的Salkowski比色法测定IAA含量，筛选具有促生潜力的菌株，其中菌株W33产生植物生长素IAA含量为32.43±5.24mg/L。

[0034] 1.3菌株鉴定

[0035] 菌株W33在TSA培养基上划线获得单菌落，其菌落颜色为白色半透明，表明湿润光滑，革兰氏染色呈阳性，显微镜观察细胞形状为长杆状。菌株W33可水解淀粉、接触酶阳性、氧化酶阴性、具有硝酸还原反应等生理生化特性。

[0036] 引物序列为：

[0037] 27F：5'‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3'。

[0038] 1492R：5'‑TACGGYTACCTTGTTACGACTT‑3'。

[0039] 菌株W33的16S rDNA测序序列如下：

[0040] GGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGGGTTAGTTAGAAGCTTGCTTCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCCTGGTAGAGTAACTGCTATTGAGGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTTTGACCGGTCTAGAGATAGGTCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGTG。

[0041] 在Genbank中Blast比对结果表明，菌株W33与多粘类芽孢杆菌L1‑9(Genbank登记号：FJ178378)的同源性达到99.65％(Query Cover:100％,E value:0)。根据菌株的形态理化特征结合16S rDNA测序比对分析，将菌株W33鉴定为多粘类芽孢杆菌。

[0042] 实施例2

[0043] 一种多粘类芽孢杆菌W33的发酵液的制备

[0044] 将多粘类芽孢杆菌W33在TSA培养基上划线三次，获得纯化的单菌落；将菌株W33单菌落接种至种子培养基上，并在35℃，180rpm培养12h，得到多粘类芽孢杆菌种子液。所述种子培养基中包含以下成分：蔗糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨2g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO4 1g/L，pH＝7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

[0045] 将制备的种子液按照重量比1:50加入发酵培养基中，35℃，180rpm培养70h，得到多粘类芽孢杆菌W33发酵液。所述发酵培养基包含以下成分：可溶性淀粉15g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨20g/L，CaCl2 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 0.5g/L，pH＝7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0046] 经检测，多粘类芽孢杆菌W33的发酵液中的活菌数为5.89×109CFU/mL。

[0047] 实施例3

[0048] 一种含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质，含有实施例2制备的多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料混合物。所述多粘类芽孢杆菌W33发酵液和所述育苗基质辅料的重量比为1:14。

[0049] 所述育苗基质辅料包括重量份的以下组分：辣椒秸秆发酵物3份，茄子秸秆发酵物1份，番茄秸秆发酵物1份，蛭石(直径3～6mm)5份，珍珠岩(直径3～6mm)5份，无机盐溶液0.8份。

[0050] 所述辣椒秸秆发酵物、茄子秸秆发酵物和番茄秸秆发酵物为辣椒秸秆、茄子秸秆和番茄秸秆的木霉发酵物，具体制备方法为：将辣椒、茄子或番茄秸秆机械粉碎至1cm左右9
的短秸秆，按10 cfu/kg的量混入非洲哈茨木霉Ta97的PDB发酵液，常温发酵30d，高压灭菌后晾干并粉碎至直径3～6mm，即为秸秆发酵物。

[0051] 所述无机盐溶液的成分中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

[0052] 将多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料按照重量比1:14混合均匀，得含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质。经检测，育苗基质中多粘类芽孢杆菌W33的活菌数为8
4.10×10CFU/基质重量g。

[0053] 实施例4

[0054] 一种多粘类芽孢杆菌W33的发酵液的制备

[0055] 将多粘类芽孢杆菌W33在TSA培养基上划线三次，获得纯化的单菌落；将菌株W33单菌落接种至种子培养基上，并在32℃，170rpm培养16h，得到多粘类芽孢杆菌种子液。所述种子培养基中包含以下成分：蔗糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨2g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO4 1g/L，pH＝7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

[0056] 将制备的种子液按照重量比1:50加入发酵培养基中，32℃，170rpm培养75h，得到多粘类芽孢杆菌W33发酵液。所述发酵培养基包含以下成分：可溶性淀粉15g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨20g/L，CaCl2 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 0.5g/L，pH＝7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0057] 经检测，多粘类芽孢杆菌W33的发酵液中的活菌数为5.42×109CFU/mL。

[0058] 实施例5

[0059] 一种含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质，含有实施例2制备的多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料混合物。所述多粘类芽孢杆菌W33发酵液和所述育苗基质辅料的重量比为1:15。

[0060] 所述育苗基质辅料包括重量份的以下组分：辣椒秸秆发酵物2份，茄子秸秆发酵物2份，番茄秸秆发酵物1份，蛭石(直径3～6mm)6份，珍珠岩(直径3～6mm)3份，无机盐溶液1份。

[0061] 所述辣椒秸秆发酵物、茄子秸秆发酵物和番茄秸秆发酵物为辣椒秸秆、茄子秸秆和番茄秸秆的木霉发酵物，具体制备方法为：将辣椒、茄子或番茄秸秆机械粉碎至1cm左右9
的短秸秆，按10 cfu/kg的量混入非洲哈茨木霉Ta97的PDB发酵液，常温发酵30d，高压灭菌后晾干并粉碎至直径3～6mm，即为秸秆发酵物。

[0062] 所述无机盐溶液的成分中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

[0063] 将多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料按照重量比1:15混合均匀，得含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质。经检测，育苗基质中多粘类芽孢杆菌W33的活菌数为8
3.57×10CFU/基质重量g。

[0064] 实施例6

[0065] 一种多粘类芽孢杆菌W33的发酵液的制备

[0066] 将多粘类芽孢杆菌W33在TSA培养基上划线三次，获得纯化的单菌落；将菌株W33单菌落接种至种子培养基上，并在36℃，170rpm培养14h，得到多粘类芽孢杆菌种子液。所述种子培养基中包含以下成分：蔗糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨2g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO4 1g/L，pH＝7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

[0067] 将制备的种子液按照重量比1:50加入发酵培养基中，36℃，160rpm培养65h，得到多粘类芽孢杆菌W33发酵液。所述发酵培养基包含以下成分：可溶性淀粉15g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨20g/L，CaCl2 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 0.5g/L，pH＝7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0068] 经检测，多粘类芽孢杆菌W33的发酵液中的活菌数为5.35×109CFU/mL。

[0069] 实施例7

[0070] 一种含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质，含有实施例2制备的多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料混合物。所述多粘类芽孢杆菌W33发酵液和所述育苗基质辅料的重量比为1:17。

[0071] 所述育苗基质辅料包括重量份的以下组分：辣椒秸秆发酵物2份，茄子秸秆发酵物1份，番茄秸秆发酵物2份，蛭石(直径3～6mm)3份，珍珠岩(直径3～6mm)6份，无机盐溶液0.5份。

[0072] 所述辣椒秸秆发酵物、茄子秸秆发酵物和番茄秸秆发酵物为辣椒秸秆、茄子秸秆和番茄秸秆的木霉发酵物，具体制备方法为：将辣椒、茄子或番茄秸秆机械粉碎至1cm左右9
的短秸秆，按10 cfu/kg的量混入非洲哈茨木霉Ta97的PDB发酵液，常温发酵30d，高压灭菌后晾干并粉碎至直径3～6mm，即为秸秆发酵物。

[0073] 所述无机盐溶液的成分中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

[0074] 将多粘类芽孢杆菌W33发酵液和育苗基质辅料按照重量比1:15混合均匀，得含多粘类芽孢杆菌W33的微生物育苗基质。经检测，育苗基质中多粘类芽孢杆菌W33的活菌数为8
3.11×10CFU/基质重量g。

[0075] 实施例8

[0076] 以实施例3制备的微生物育苗基质为例，利用两种不同的育苗基质试验菌株W33在基质中长时间储存后的活性。

[0077] 8.1育苗基质

[0078] 待测样品：实施例3制备的微生物育苗基质；

[0079] 对照样品1：采用实施例2制备的发酵液，与普通育苗基质辅料混合均匀，混合比例为重量比1:14。所述普通育苗基质辅料包括重量份的以下组分：无菌泥炭5份、蛭石(直径3～6mm)5份，珍珠岩(直径3～6mm)5份，无机盐溶液0.8份；所述无机盐溶液的成分中含有以下组分：(NH4)3PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。经检测，对照样品中菌株W33活菌数为4.10×8
10CFU/基质重量g。

[0080] 8.2试验条件

[0081] 将待测样品和对照样品存放于无菌透气罐中(每种样品设6个重复)，置于室温25±5℃，阴凉通风处。采用稀释涂TSA平板法分别于存放后0d、90d和180d检测菌株W33的活菌数。

[0082] 8.3测试结果

[0083] 在采用上述试验条件的过程中，测试上述两种微生物育苗基质辅料组成对菌株W33的活菌数影响，测试结果如下表1所示：

[0084] 表1‑育苗基质辅料组成对菌株W33活菌数的影响

[0085]

[0086] 从表1中可以看出，利用本发明实施例2提供的微生物育苗基质，在长时间存放时，菌株W33的活菌数保持较高水平，而对比样品中菌株W33的活菌数在长时间存放后显著下降。

[0087] 实施例9

[0088] 以实施例3中制备的微生物育苗基质为例，对比四种不同的育苗基质试验对黄瓜黑星病的防病效果

[0089] 9.1育苗基质

[0090] 待测样品：实施例3制备的微生物育苗基质。

[0091] 对照样品1：同实施例8中的对照样品1。

[0092] 对照样品2：采用实施例3中的育苗基质辅料。

[0093] 对照样品3：采用实施例8中对照样品1的普通育苗基质辅料。

[0094] 9.2试验条件

[0095] 黄瓜(津优35号)种子用温汤浸种法在28℃黑暗条件下催芽，四种育苗基质事先装入育苗钵中，每个育苗钵播种一粒露白种子，待子叶完全伸展后，四个处理各挑选苗齐的68
株为重复。然后将1mL枝孢霉(分离纯化自黄瓜病果)孢子悬液(1×10CFU/mL)接种至根围，后续浇水管理常规，培育14天后记录病情指数。病情分级标准参照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 144.38‑2011第38部分：杀菌剂防治黄瓜黑星病》的叶片分级方法和病情指数计算方法。

[0096] 9.3测试结果

[0097] 在采用上述试验条件的过程中，测试上述四种微生物育苗基质对黄瓜黑星病的防治效果影响，测试结果如下表2和图1。

[0098] 表2‑四种育苗基质对黄瓜黑星病病情程度的影响

[0099]

[0100]

[0101] 从表2中可以看出，利用本发明实施例3提供的微生物育苗基质，相比于不添加多粘类芽孢杆菌W33的育苗基质，高效抑制了黄瓜黑星病的发生。并且采用秸秆发酵物代替泥炭也显著提高了多粘类芽孢杆菌W33的生防效力。

[0102] 实施例10

[0103] 以实施例3中制备的微生物育苗基质为例，对比四种不同的育苗基质试验对黄瓜的促生效果

[0104] 10.1育苗基质

[0105] 待测样品：实施例3制备的微生物育苗基质。

[0106] 对照样品1：同实施例8中的对照样品1。

[0107] 对照样品2：采用实施例3中的育苗基质辅料。

[0108] 对照样品3：采用实施例8中对照样品1的普通育苗基质辅料。

[0109] 10.2试验条件

[0110] 黄瓜(津优35号)种子用温汤浸种法在28℃黑暗条件下催芽，四种育苗基质事先装入育苗钵中，每个育苗钵播种一粒露白种子，待子叶完全伸展后，四个处理各挑选苗齐的6株为重复。后续浇水管理为常规管理。

[0111] 10.3测试结果

[0112] 在采用上述试验条件的过程中，出苗后7天测量株高、茎粗、地上和地下部分干重，计算壮苗指数＝(茎粗/株高+地下干重/地上干重)×单株干重。试验结果如下表3和图2所示。

[0113] 表3‑四种育苗基质对黄瓜的促生效果

[0114]

[0115]

[0116] 从表3中可以看出，利用本发明实施例3提供的微生物育苗基质，相比于不添加多粘类芽孢杆菌W33的育苗基质，显著提高了黄瓜生物量和壮苗指数。并且采用秸秆发酵物代替泥炭也显著提高了菌株W33的促生作用。

[0117] 实施例11

[0118] 以实施例3中制备的微生物育苗基质为例，对比利用两种不同的育苗基质试验对菌株W33在黄瓜根际的定殖效果。

[0119] 11.1育苗基质

[0120] 待测样品：实施例3制备的微生物育苗基质。

[0121] 对照样品1：同实施例8中的对照样品1。

[0122] 11.2试验条件

[0123] 将黄瓜种植在两种微生物育苗基质中，分别在第10、25、30、45、60天采集黄瓜根系，置于装有30mL 1×PBS缓冲液的离心管中，在摇床中180rpm清洗三次每次20min，每次换8
新鲜PBS。无菌滤纸吸干根系表面水分，取出0.2g用无菌水充分研磨，以10倍梯度稀释至10倍后涂布于TSA平板，30℃培养至长出肉眼可见的单菌落后进行计数。试验设三个重复。按照菌落形态对多粘类芽孢杆菌进行识别，并使用16S rDNA基因对菌株进行鉴定确定多粘类芽孢杆菌形态识别的准确性。

[0124] 11.3测试结果

[0125] 采用上述试验条件，试验结果如下表4所示。

[0126] 表4‑两种育苗基质中菌株W33的定殖活菌数

[0127]

[0128] 从表4中可以看出，利用本发明实施例提供的微生物育苗基质，多粘类芽孢杆菌W33在黄瓜根际定殖后，在黄瓜生长周期内(60d)菌株W33的活菌数保持较高水平，而对比样品中菌株W33的定殖活菌数下降显著。

[0129] 尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。