一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用转让专利
申请号 : CN202111344786.5
文献号 : CN113789388B
文献日 : 2022-03-25
发明人 : 张良禄 , 周俊 , 董兰兰 , 吴志诚 , 熊杨辉 , 万康康 , 李婷婷
申请人 : 苏州艾米森生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种试剂,其特征在于,其包括如下至少一种的核酸组合:核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4、核酸组合5和核酸组合6;
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1‑3所示,所述核酸组合2的碱基序列如SEQ ID NO.4‑6所示,所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7‑9所示,所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10‑12所示,所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13‑15所示,所述核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16‑18所示;区域所在位置参考的人类基因组版本号为GRCh38.p13。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括如下至少一种的核酸组合:核酸组合2和核酸组合4。
3.一种试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1或2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的检测样本为组织样本、血液样本或食管来源的细胞样本;
所述血液样本选自血浆样本、血清样本或全血样本。
5.用于检测OTOP2基因CpG岛甲基化水平的核酸组合在制备产品中的应用,其特征在于,所述产品的用途为如下中的至少一种:诊断或辅助诊断食管癌或癌前病变;
区分食管癌样本和非癌样本;所述产品选自如下产品中的至少一种:试剂、试剂盒、芯片和测序文库;
所述OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域的甲基化水平:区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6;
其中,所述区域1选自Chr17:74923881‑74924015正链,所述区域2选自Chr17:
74924159‑74924335正链,所述区域3选自Chr17:74924422‑74924581正链,所述区域4选自Chr17:74924603‑74924449负链,所述区域5选自Chr17:74924425‑74924297负链,所述区域
6选自Chr17:74924080‑74923981负链;区域所在位置参考的人类基因组的版本号为GRCh38.p13。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域的甲基化水平:区域2和区域4。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种:用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4、用于检测所述区域5的核酸组合5和用于检测所述区域6的核酸组合6;
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1‑3所示,所述核酸组合2的碱基序列如SEQ ID NO.4‑6所示,所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7‑9所示,所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10‑12所示,所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13‑15所示,所述核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16‑18所示。
说明书 :
一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用
技术领域
背景技术
细胞、流行病学和肿瘤分子生物学。食管鳞状细胞癌主要来源于食道的鳞状上皮细胞,食管
腺癌起源于胃食管交界处的腺细胞,并与食管下段胃酸反流有关。二者的流行病学特征也
不同,全球约有 79% 的食管鳞状细胞癌病例发生在东南亚和中亚,也存在于非洲东南部和
南美洲,食管腺癌主要流行与欧洲、北美和大洋洲。食管鳞状上皮内瘤变与食管鳞癌的发生
密切相关,属于鳞癌的癌前病变,Barrett食管相关异性增生则是腺癌的癌前病变。
率可>95%。因此,癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率、提高生存率的主要
策略。
人群筛查,食管癌检测亟需无创检测方法。
瘤来源的cfDNA,称为循环肿瘤 DNA(ctDNA),ctDNA中含有肿瘤特异性的遗传改变和表观遗
传学改变,可以用作癌症检测的标志物。其中,DNA甲基化水平异常是癌症发生的早期事件,
可以用于早期食管癌检测。由于cfDNA在血液中具有含量少、提取困难、存在周期短等缺点,
且血液中的cfDNA 来源于全身各个组织,很多标记物在多种类型的癌症中均会出现甲基化
异常,因此寻求肿瘤特异性的甲基化标记物充满挑战,目前尚缺乏可用于食管癌检测的血
液甲基化标志物。
发明内容
因的高甲基化和原癌基因的低甲基化等。而且DNA甲基化较稳定,如果可以发现肿瘤特异的
血液DNA甲基化分子标志物则有巨大的临床应用价值。
效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。
能在待测样本中有效区分癌症/癌前病变样本和正常样本,对癌症的检测灵敏性超过50%,
对癌前病变的检测灵敏性超过30%,特异性高于95%。而且用OTOP2基因CpG岛区域的甲基化
作为检测标记物能够有效的区分食管癌样本和癌旁样本(非癌样本)。本发明为食管癌的无
创检测提供了新思路。
斑。
域6。
74924449负链,区域5选自Chr17:74924425‑74924297负链,区域6选自Chr17:74924080‑
74923981负链。
特异性要优于其他区域对于样本的检测灵敏度和特异性。
为唯一确定指标。
式中,可根据样本检测的Ct值进行比较,在一些情况下,可计算出样本中标记物的甲基化比
例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较。在一种实
施方式中,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
CGGGCTGCCCGGTGGTACTGGTCGTTCATGGCGCCCGAAGTGGACGGGGCGGGCGGGGGACACGGAGAAAGGCCCC
CCGCAGGGGAGGGCGGCGGTATTAGGGCTGAGGCATGAGGTTGGAGGACGGGGCCGGGCAGGGGCCGGGGCCGCCA
GCCCCCGCTGCCGCAGACGGAGGGTGCGGAGCGCCAGAGCCGCGACTACCAAGACATCTGAAACGCTCACCCGGGG
GCGGGGGCGGAGGGGGCGGGGGACGAAATCTCCCGCTGTCCAGGGAGCCGCCCCCGGTCTTCCCCTGGGTCCTAAA
CACCCTGCATGCACCTCAATACACGAGGGTGACCCACGCAAGGCCCTGTCCTCCTCTTCAAAAGTGCCCACCCCGG
GGCCGCGCACTGTGACGCCCAGTCCGGGGACAGTCAGAGATCTGTCCTCACTAGAGCCTGGGGCGCTGTGGCTCCG
TATTTCTCCACCTGTCAGTGGAACGAACCGAGAGCTGGGGAGGGGTGCCGGAGGGCGGGGTGGGGGAGCCGTCCTG
AGCCCCAGGACAGTGGACCTAAGAAGGGGCACCGTGACCGACCGCGGTTCGGTCAGCGAGTGGGACGGGCCAGGCC
GCCGCCGCCTGAACGGAGTCCCTCGACCGCACTCCAGCAGGGGGCGCTGGAGGACTGGCAGCGGCTCCGCGTGCCG
CGTGGAACTTCGCACCCAAGCCCCGGAGTCCAACGGAGCGCGGGCCGGCGGCGGGGGCGGGCAGGGCGGTGGGATA
GAGGAAAGGGGAGCTTGGATCACTGCGAGGACCGTGGGGGAGAGGGGAACTGGGGTTGCCATCCCAGGCAGGAGCA
CAGGAGCACAGGATTCAGGGTGCGCCGCGGCTGGAGGGCGTCAGGGTGCCCGCAGGCTTTTTGGACGTCTCTTGAG
CTTAGCTCTCGGGGCTCTGGGCGCCTGGAATGCTGCGCGCCAGGGCGCGGTGGGCACCAGGGGCGGGGTGCCCTCT
AGGTGCCGCAGTGCGGGGCCGCGCCCGAGCCTGGCCGCACCGGGGTGACGGAGTGGGGTCGCCTCTCAAAGGGTAA
ATATGAATCTTGCCTTATCTGGCTCCAGCGGGCTCTTCCCTAAATTCACCTTGGAGAAAGATGGATCATGTGAGCG
GGACTGAGAGCTTTATGGAGCCAAACTCCCGCAGCTGTAAATCACCCTGTCCTCCTGGGTATAAAGCGCCTGTCCA
TCTCGGCGTGGGAGAGAGGAGACGCTCGCCGTCCCCTGACCCCCAGCTCAGCGCCGGCTCCAAGCCCAGCCAGGTG
GGTGCCCCGGGCCGGAGGGCAGTCGGACTTGGGGAGTGGGGACCTTGGAGGGGTCCAACCGGGTGCTGCCGCTTCT
CCTTTCTTCCCATCCAGCGAGAGGGGCAGGTTCCGCATTTTCTCTTCCCCTTTCCCAGCGCTTCCTCCAGCACCCG
AAGCCCCAACCCTGCGGGTCAGGAACTCCCTAGTCCCCAAGTCTAGGGATGAGATGGGGGAAGGAGAGCCGTCAGG
GTTGACCTGGAGTTTTGTCCGCTCCTCCCCTACAGTGATCCCTCTAGCCTTCTCCAGTCGCCTCCGCCATGTCCGA
GGAGCTGGCCCAGGGCCCCAAGGAGAGCCCCCCGGCGCCGCGTGCGGGCCCCAGGGAGGTGTGGAAGAAGGGTGGC
CGCCTGCTGTCGGTGCTGCTGGCGGTGAACGTGCTGCTCCTCGCCTGCACGCTCATCAGCGGCGGAGCCTTCAACA
AGGTGGCCGTGTACGACACCGACGTGTTCGCGCTGCTCACTGCGATGATGCTGCTGGCAACGCTCTGGATCCTCTT
CTACCTCCTCCGAACCGTGCGCTGCCCCTGCGCGGTACCCTACCGGGACGCGCACG。
3、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域5的核酸组合5和用于检测区域6的核酸组合
6;
的碱基序列与SEQ ID NO.7‑9所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合4的碱基序
列与SEQ ID NO.10‑12所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合5的碱基序列与SEQ
ID NO.13‑15所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合6的碱基序列与SEQ ID
NO.16‑18所示的碱基序列具有至少90%的一致性。
90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合3的碱基序列与SEQ ID NO.7‑9所示的碱
基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合4的碱基序列与SEQ ID
NO.10‑12所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合5的碱基序
列与SEQ ID NO.13‑15所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组
合6的碱基序列与SEQ ID NO.16‑18所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一
致性。
断的需求均在本发明的保护范围内。
甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶
法和flap endonuclease 法(参见专利文献US8715937、US8361720)。
的碱基序列与SEQ ID NO.7‑9所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合4的碱基序
列与SEQ ID NO.10‑12所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合5的碱基序列与SEQ
ID NO.13‑15所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合6的碱基序列与SEQ ID
NO.16‑18所示的碱基序列具有至少90%的一致性。区域所在位置参考的人类基因组的版本
号为GRCh38.p13。
括不限于PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、水)和进行飞行时间质谱所用的其他常规试剂。
冲液中。
敏度和特异性。对于提高食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社
会意义。本发明为食管癌的无创检测提供了新思路。
具体实施方式
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
体步骤包括:
的胞嘧啶不变,尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对,胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对,以
此实现甲基化与未甲基化序列的区分。
列如表1所示。
的检测引物和探针,同时加入内参基因的检测探针。
GGAGTGGTTTTTGGGTTTG (SEQ ID NO.21)。
体积加入到反应体系中。每个样本设置三个复孔。
和A保持不变)进行人工合成,并克隆至载体pUC57上,形成人工合成质粒。将完全甲基化的
区域1‑6对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即分别将各区域中除CG二核苷酸中的C保持不
变外,其余位置的C均转换成T,其他三种碱基T、G和A保持不变)进行人工合成,并克隆至
3
pUC57上,形成人工合成质粒。区域1‑6的阳性对照为10 拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和
3 3
10拷贝/微升的区域1‑6的人工合成质粒按体积1:1混合而成,如区域1的阳性对照为10 拷
3
贝/微升的ACTB人工合成质粒和10拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1:1混合而成。
下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
的Ct值,读取每个样本待检测目的区域的Ct值和内参基因ACTB的Ct值。
基化阳性,否则为甲基化阴性。计算区域1‑6在食管癌前病变样本、食管癌样本中的灵敏性,
计算各区域在癌旁样本或正常样本中的特异性。
DNA进行亚硫酸氢盐转化和甲基化特异性PCR,然后分别检测区域1‑6在24例食管癌组织样
本和24例癌旁样本中的甲基化状态,计算灵敏度和特异性,结果如表4所示。
能最优,二者的灵敏度均在90%以上。
亚硫酸氢盐转化和甲基化特异性PCR,分别检测区域1‑6在食管癌样本、食管高级别瘤变样
本和健康样本的甲基化状态,计算灵敏度和特异性,结果如表5所示。
30%以上,其中区域2和区域4的检测灵敏性最优,二者对食管癌样本的检测灵敏性均大于
65%,对食管高级别瘤变样本的检测灵敏性均大于40%。
改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。