本发明提供了一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。本发明利用dpe基因在大肠杆菌体内过表达，构建D‑果糖至D‑阿洛酮糖的代谢通路；再对大肠杆菌自身的fruA、manXYZ、mak三个基因进行敲除，有效缓解细胞对果糖的磷酸化作用，避免代谢底物的大量浪费；再过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因，建立果糖向包内快速转运的新途径，保证代谢底物的供给；然后敲除galE和fruK两个基因，利用Ni2+下调FbaA蛋白的功能性，加强对重组菌果糖代谢通量的控制，保证底物向D‑阿洛酮糖的最大转化效率。本发明所得的重组菌单细胞工厂可为D‑阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略。
1.一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂，其特征在于：所述重组菌单细胞工厂是利用重组载体在大肠杆菌JM109(DE3)中过表达D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶基因dpe催化D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖，再敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA、甘露糖特异性PTS转移蛋白基因manXYZ和果糖激酶基因mak共三个基因，从而减少果糖在细胞体内磷酸化后造成的浪费，同时过表达Sec蛋白转位通道的三个亚基基因secY(ΔP)、secE、secG以及外膜致孔蛋白基因sCVE共四个基因，构建大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道来加快底物进入细胞，并在此基础上敲除UDP‑半乳糖4‑差向异构酶基因galE和1‑磷酸果糖激酶基因fruK共两个基
因，利用Ni 下调FbaA蛋白的功能性，控制碳代谢通量得到的；
其中，所述dpe基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因secY(ΔP)和sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述基因secE和secG在NCBI的基因ID分别为
2.根据权利要求1所述的产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：
(1)在大肠杆菌JM109(DE3)中构建并表达将D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖的基因dpe，得到菌株E.coli‑DPE；
(2)在菌株E.coli‑DPE中利用同源重组技术敲除导致果糖磷酸化的基因fruA、manXYZ和mak，得到菌株E.coli‑DPEΔFruAΔManXYZΔMak；
(3)在菌株E.coli‑DPEΔFruAΔManXYZΔMak中构建并表达大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道的基因secY(ΔP)、secE、secG和sCVE，得到菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak；
(4)在菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak中利用同源重组技术敲除副产物代谢途径及果糖代谢途径的基因galE和fruK，得到重组菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]Δ
FruAΔManXYZΔMakΔGalEΔFruK，再通过Ni 抑制剂NiCl2，抑制FbaA活性，关闭果糖代谢总开关。
3.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)具体过程如下：使用dpe‑F和dpe‑R一对引物对人工合成的dpe基因模板进行PCR扩增反应，利用BamHI和HindIII两个酶切位点将dpe基因插入pRSFDuet‑1，得到pRSFDuet‑dpe重组载体，借助电化学转化法将重组载体转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达；所述dpe基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物dpe‑F和dpe‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)具体过程如下：依次使用fruA‑F/fruA‑R、manXYZ‑F/manXYZ‑R和mak‑F/mak‑R三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌E.coli‑DPE中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失，得到菌株E.coli‑DPEΔFruAΔManXYZΔMak；所述引物fruA‑F和fruA‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述引物manXYZ‑F和manXYZ‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述引物mak‑F和mak‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
5.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)具体过程如下：使用secY(ΔP)‑F/secY(ΔP)‑R、secE‑F/secE‑R、secG‑F/secG‑R和sCVE‑F/sCVE‑R四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet‑1和pRSFDuet‑dpe两个质粒中，得到pETDuet‑secY(ΔP)‑secE和pRSFDuet‑dpe‑secG‑sCVE，转染菌株E.coli‑DPEΔFruAΔManXYZΔMak后得到菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak；所述基因secY(ΔP)和sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述基因secE和secG在NCBI的基因ID分别为948486和947720；所述引物secY(ΔP)‑F和secY(ΔP)‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；所述引物secE‑F和secE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；所述引物secG‑F和secG‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述引物sCVE‑F和sCVE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
6.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)具体过程如下：依次使用galE‑F/galE‑R和fruK‑F/fruK‑R两对引物利用同源重组技术继续完成对菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak的galE和fruK两个基因的敲除，得到重组菌株E.coli‑DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMakΔGalEΔFruK，再向重组菌培养基中添加8μM的NiCl2以抑制FbaA活性；所述引物galE‑F和galE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；所述引物fruK‑F和fruK‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
7.如权利要求1所述的重组菌单细胞工厂在生产D‑阿洛酮糖中的应用。
一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。
背景技术
[0002] 随着人们生活水平大幅度提高，低热量饮食逐渐成为一种潮流，阿斯巴甜、木糖醇和三氯蔗糖等化学品随之出现。稀有糖中D‑阿洛酮糖（D‑psicose）也属低热量的代表之一，它是D‑果糖的C3差向异构体，其甜度为蔗糖的70%，但热量仅为等量蔗糖的0.3%。据科学研究证实，D‑阿洛酮糖在预防肥胖、调节血糖、降血脂以及抗氧化等方面更具有独特的生理学功能，未来它将在食品、饮料、保健、医药等领域拥有巨大的市场前景。
[0003] D‑阿洛酮糖的制备方法包括化学合成法和生物合成法。前者普遍存在副产物多、分离步骤复杂、废弃物难处理等问题，导致了极高的生产成本，实现工业化生产困难。而生物合成法所需的反应条件温和，且具有特异性高、绿色环保等优势，对D‑阿洛酮糖的生产十分有利。目前生物合成法是利用酶的催化作用，主要是两条路线：（1）以果糖为底物，通过D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶或D‑塔格糖‑3‑差向异构酶将果糖一步催化为D‑阿洛酮糖；（2）以葡萄糖为底物，通过D‑木糖异构酶和D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶或D‑塔格糖‑3‑差向异构酶进行级联催化，将葡萄糖先后催化为D‑果糖和D‑阿洛酮糖。
[0004] 虽然酶催化用于D‑阿洛酮糖的合成已经实现，但仍存在诸多挑战。酶的固定化方法、热稳定性、级联催化的最佳反应条件等问题优化依旧困难。如能通过细胞工厂生产D‑阿洛酮糖，省去酶的制备及固定化程序，将会大大降低生产成本，节省生产时间。然而，微生物体内的代谢途径十分复杂，如何理性设计D‑阿洛酮糖合成路径，保证底物的最佳转化效率，是能否实现细胞工厂生产D‑阿洛酮糖的关键。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对上述问题，提供一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用，在实现大肠杆菌发酵生产D‑阿洛酮糖的同时，最大限度的降低D‑果糖的损耗，保证D‑阿洛酮糖的得率维持在较高水平，实现D‑阿洛酮糖在细胞工厂中的高效生产。
[0006] 为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
[0007] 一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂，所述重组菌单细胞工厂是利用重组载体在大肠杆菌中异源表达D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，构建D‑阿洛酮糖合成途径，再敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA、甘露糖特异性PTS转移蛋白基因manXYZ和果糖激酶基因mak共三个基因，消除果糖在大肠杆菌中的磷酸化问题，然后构建并表达Sec蛋白转位通道三个亚基基因secY(ΔP)、secE、secG和外膜致孔蛋白基因sCVE共四个基因，搭建果糖向胞内转运的非磷酸化通道，再进一步敲除UDP‑半乳糖4‑差向异构酶基因galE和1‑磷酸果糖激酶基因fruK共两个基因，利用NiCl2抑制FbaA蛋白的活性，阻断大肠杆菌对D‑阿洛酮糖代谢路径的同时理性控制碳代谢流量得到的。
[0008] 上述一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂的构建方法，包括以下步骤：
[0009] （1）在大肠杆菌JM109(DE3)中构建并表达D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖的基因dpe，得到菌株E.coli (DPE);
[0010] （2）敲除导致果糖磷酸化的基因，包括fruA，manXYZ和mak，得到菌株E.coli (DPE, ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；
[0011] （3）构建并融合表达大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道的基因，包括secY(ΔP)、secE、secG和sCVE，得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；
[0012] （4）敲除副产物代谢途径及果糖代谢途径的基因，包括galE和fruK，得到菌株2+
E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)，同时通过Ni抑制剂，抑制FbaA活性，关闭果糖代谢总开关，实现完整的细胞工厂构建。
[0013] 上述步骤（1）具体过程如下：使用dpe‑F和dpe‑R一对引物对人工合成的dpe模板进行PCR扩增反应，利用BamH I和Hind III两个酶切位点将dpe基因插入pRSFDuet‑1，得到pRSFDuet‑dpe重组载体，借助电化学转化法将重组载体转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达；所述基因dpe核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物dpe‑F和dpe‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0014] 上述步骤（2）具体过程如下：依次使用fruA‑F/fruA‑R，manXYZ‑F/ manXYZ ‑R，和mak‑F/mak‑R三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌JM109(DE3)中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失，得到E.coli (DPE, ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；所述引物fruA‑F和fruA‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述引物manXYZ‑F和 manXYZ‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述引物mak‑F和mak‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
[0015] 上述步骤（3）具体过程如下：使用secY(ΔP)‑F/secY(ΔP)‑R、secE‑F/secE‑R、secG‑F/secG‑R和sCVE‑F/sCVE‑R四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet‑1和pRSFDuet‑dpe两个质粒中，得到pETDuet‑secY(ΔP)‑secE和pRSFDuet‑dpe‑secG‑sCVE，转染后得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；所述基因secY(ΔP)和sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；所述引物secY(ΔP)‑F和secY(ΔP)‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述引物secE‑F和secE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；所述引物secG‑F和secG‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述引物sCVE‑F和sCVE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
[0016] 上述步骤（4）具体过程如下：使用galE‑F/galE‑R和fruK‑F/ fruK‑R两对引物利用步骤（2）的方法继续完成galE和fruK两个基因的敲除，得到重组菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)；再向培养基中添加8µM的NiCl2以抑制FbaA活性；所述引物galE‑F和galE‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；所述引物fruK‑F和fruK‑R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
[0017] 上述一种重组菌单细胞工厂在生产D‑阿洛酮糖中的应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 本发明利用重组菌单细胞工厂直接通过发酵法以D‑果糖为底物生产D‑阿洛酮糖，相比于现有的酶催化法更加简便，同时无需涉及酶的制备过程，通过碳代谢流量的合理设计，实现了底物向产物转化的最优代谢路线，可为D‑阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略，同时符合人们日渐形成的“绿色”新理念，即“原料绿色、过程绿色、产品绿色”。
附图说明
[0020] 图1为大肠杆菌利用D‑果糖产D‑阿洛酮糖的代谢示意图。
[0021] 图2为E.coli (DPE)中dpe基因表达后的SDS‑PAGE蛋白质凝胶电泳图。Lane 1：蛋白质标准条带；Lane 2：空白对照，大肠杆菌携带空质粒；Lane 3：E.coli (DPE)。
[0022] 图3为E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)发酵结果图。图中包含D‑果糖的消耗量，D‑阿洛酮糖的生成量以及细胞密度。
[0023] 图4为E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)发酵结果图。图中包含D‑果糖的消耗量，D‑阿洛酮糖的生成量以及细胞密度。
具体实施方式
[0024] 以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。
[0025] 本发明中完整的重组菌单细胞工厂的构建流程如图1所示。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例中的dpe基因来自根瘤农杆菌（ATCC 33970），核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0028] 利用质粒pRSFDuet‑1过表达dpe基因，实现D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶在大肠杆菌JM109(DE3)中高效表达。具体方法为，使用dpe‑F（SEQ ID NO.2）和dpe‑R（SEQ ID NO.3）一对引物对人工合成的dpe模板进行PCR扩增反应，利用BamH I和Hind III两个酶切位点将dpe插入pRSFDuet‑1，得到pRSFDuet‑dpe重组载体，借助电化学转化法将重组质粒转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达。
[0029] 得到的菌株命名为E.coli (DPE)，进行细胞培养。首先在LB试管中，37℃、220rpm过夜活化，转接至100ml LB培养基中37℃、220rpm培养至细胞密度约0.6‑0.8之间，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂0.4mM，30℃、220rpm培养8小时，诱导DPE蛋白质表达。LB培养基包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl；卡那霉素使用浓度为50mg/ml。8小时后，使用冷冻离心机4℃离心10分钟收集菌体，再用Tris‑HCl缓冲液（50mM，pH7.5）重悬，保存于4℃冰箱中。采用超声波破碎细胞，利用蛋白质凝胶电泳检验蛋白质表达情况。如图2所示，与空白对照（lane 2）相比，在30kDa附近有大量蛋白质聚集（lane 3），表明dpe基因在大肠杆菌中异源表达成功。
[0030] 实施例2
[0031] 本实施例中的secY(ΔP)基因来自大肠杆菌JM109(DE3)中secY基因并将其中60‑74位氨基酸组成的帽子结构用一段短链氨基酸（Gly‑Ser‑Gly‑Ser）组成的柔性片段替换，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；sCVE基因是来自SARS冠状病毒中的小包膜E蛋白基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；secE和secG基因来自大肠杆菌JM109(DE3)自身基因的过表达，核苷酸序列分别可参考Gene ID: 948486和Gene ID: 947720。
[0032] 在大肠杆菌中对磷酸化果糖的三个基因fruA，manXYZ和mak进行敲除，得到菌株E.coli (ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；再将secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因融合表达，实现果糖非磷酸化转运途径的建立，初步建立D‑阿洛酮糖生产的单细胞工厂，得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)。具体措施为使用λred同源重组的方法进行基因敲除工作。具体方法如下：
[0033] 依次使用fruA‑F（SEQ ID NO.6）/fruA‑R（SEQ ID NO.7），manXYZ‑F（SEQ ID NO.8）/ manXYZ ‑R（SEQ ID NO.9），和mak‑F（SEQ ID NO.10）/mak‑R（SEQ ID NO.11）三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌JM109(DE3)中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失。在此基础上，使用secY(ΔP)‑F（SEQ ID NO.12）/secY(ΔP)‑R（SEQ ID NO.13）、secE‑F（SEQ ID NO.14）/secE‑R（SEQ ID NO.15）、secG‑F（SEQ ID NO.16）/secG‑R（SEQ ID NO.17）和sCVE‑F（SEQ ID NO.18）/sCVE‑R（SEQ ID NO.19）四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet‑1和pRSFDuet‑dpe两个质粒中，得到pETDuet‑secY(ΔP)‑secE和pRSFDuet‑dpe‑secG‑sCVE重组载体。使用电化学转化法将上述重组载体转染至E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)，具体步骤如下：采用LB培养基培养培养E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)细胞，离心收集菌体，在冰浴中使用体积分数为10%的甘油清洗菌体3次（离心条件为4℃、6000 rpm、10min），得到E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)感受态细胞；取重组载体ETDuet‑secY(ΔP)‑secE和pRSFDuet‑dpe‑secG‑sCVE各1µL加入E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)感受态细胞，使用电穿孔仪进行电击，条件为1mm电击杯、1.8 kV放电、放电时间4‑5 mS，然后置于LB培养基中复苏培养2小时，进而得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)。
[0034] 发酵验证菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)生产D‑阿洛酮糖的能力。发酵培养基包括：20g/L果糖，5g/L yeast extract, 10g/L氯化钠，10g/L tryptone，1mM MnCl2；氨苄霉素使用浓度为100mg/ml，卡那霉素使用浓度为50mg/ml。发酵条件为30℃，220rpm，0.4mM的IPTG，接种量0.2vol%。如图3所示，实验结果表明，重组菌种E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)在24小时内消耗5.5g/L的D‑果糖可以产生1.83g/L的D‑阿洛酮糖，D‑果糖的转化率为30.6%，D‑阿洛酮糖的得率约为0.33g/g。
[0035] 实施例3
[0036] 继续对菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)进行改善，目的是降低D‑果糖的转化率，提高D‑阿洛酮糖的得率。继续敲除D‑阿洛酮糖下游代谢途径galE基因，保证产生的D‑阿洛酮糖不参与细胞代谢。同时敲除D‑果糖下游代谢途径中的2+
fruK基因，防止果糖的过度浪费。同时利用Ni 产生竞争性抑制FbaA的催化能力，下调果糖代谢的总开关，保证底物‑产物的最大转化效率。
[0037] 具体方法为使用galE‑F（SEQ ID NO.20）/galE‑（SEQ ID NO.21）R和fruK‑F（SEQ ID NO.22）/ fruK‑R（SEQ ID NO.23）两对引物依次对E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)中的galE和fruK进行敲除，得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)。通过向培养基中添加8µM NiCl2，抑制FbaA的催化能力。
[0038] 发酵培养基包括：20g/L果糖，5g/L yeast extract，10g/L氯化钠， 10g/L tryptone， 1mM MnCl2，8µM NiCl2；氨苄霉素使用浓度为100mg/ml，卡那霉素使用浓度为50mg/ml。发酵条件为30℃，220rpm，0.4mM的IPTG，接种量0.2vol%。如图4所示，E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)的生长速率维持在‑1
0.17h 的正常水平，D‑阿洛酮糖的得率提高到0.95g/g，总量达到3.3g/L。
