基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用，沙门氏菌识别免疫探针为Au‑Fe3O4异二聚体识别探针，是金纳米粒子与Fe3O4纳米粒子的结合，并共价偶联有沙门氏菌单克隆抗体，可以实现沙门氏菌的识别、捕获及检测一体化；而且还可利用Au‑Fe3O4异二聚体识别探针通过磁捕获及比色法实现沙门氏菌的定性及半定量检测，检测速度快，且灵敏度高，可用于检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌。

权利要求

1.一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入1‑十八烯和油酸，在100～130℃下搅拌混合均匀并保温15～30min，然后注入Fe(CO)5，升温至280～300℃并反应1.5～2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，反应完成后冷却至室温；然后加入丙酮离心，并向沉淀产物中添加TMAH溶液，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；

(2)制备Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入MNPs、去离子水及柠檬酸钠溶液，并在80～120℃下搅拌混合均匀，然后加入HAuCl4溶液，继续在80～120℃下搅拌混合并反应20～30min；反应完成后间隔5min，再次加入等体积的HAuCl4溶液及等体积的柠檬酸钠溶液，在80～120℃下搅拌混合并反应3～6min，反应完毕后得到Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；

所述步骤(2)中MNPs、去离子水、柠檬酸钠溶液、HAuCl4溶液的体积比为0.1～0.2：10～

20:0.2～0.5:0.15～0.25，所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为8～10mg/mL，所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为10mmol/L；

(3)制备Au‑Fe3O4异二聚体识别探针：将步骤(2)制备得到的DBNPs与HS‑PEG‑COOH混合，并在37℃下摇晃50～60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育20～40min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液中；然后加入沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应3～4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌免疫探针，即Au‑Fe3O4异二聚体探针，记为IDBNPs，放置于冰箱内在4℃储存。

2.根据权利要求1所述的一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中1‑十八烯、油酸、Fe(CO)5、丙酮、TMAH溶液、去离子水的体积比为10～20:1～2:0.2～0.4:10～20:10～25:10～20，所述TMAH溶液的浓度为10％，所述氮气的流速为10～20mL/min。

3.根据权利要求1所述的一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中得到的Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子为一对一哑铃型结构异二聚体纳米粒子，其中，Au纳米粒子的直径为12～16nm，Fe3O4纳米粒子的直径为12～

16nm。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法制备得到的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用。

5.根据权利要求4所述的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用，其特征在于，所述应用包括通过磁捕获与紫外‑可见光吸收光谱结合定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌或通过磁捕获与比色法结合定性及半定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌。

6.根据权利要求5所述的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用，其特征在于，通过磁捕获与紫外‑可见光吸收光谱结合定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌的步骤如下：(a)取待检测牛奶或胎牛血清样品，向样品中加入等体积的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，然后用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，并将上清液与沉淀物分离，磁吸时间为10～20min；

(b)取上清液，用紫外‑可见光吸收光谱对沙门氏菌进行定量检测。

7.根据权利要求5所述的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用，其特征在于，通过磁捕获与比色法结合定性及半定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌的步骤如下：(a)取待检测牛奶或胎牛血清样品，向样品中加入等体积的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，然后用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，并将上清液与沉淀物分离，磁吸时间为10～20min；

(b)取上清液，并加入ABTS，观察上清液颜色变化，对样品中的沙门氏菌进行定性及半定量检测。

8.根据权利要求6或7所述的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用，其特征在于，所述步骤(a)中取待检测牛奶样品时，需先向待检测牛奶中加入醋酸，搅拌并静置，直至不再生成白色沉淀，取上清液作为待检测牛奶样品。

9.根据权利要求6或7所述的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用，其特征在于，所述步骤(a)中磁吸时间为15min。

说明书

基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法

及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于沙门氏菌检测技术领域，具体涉及一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 当今世界，食品安全问题频发，越来越多的消费者和相关部门开始关注食品安全问题。据估计，全世界每年有六亿人口因食用不安全的食品而患病，并导致近四十二万人死亡，低收入和中等收入国家每年因受污染的食品造成的生产力和医疗费用损失达千亿美元。根据食源性疾病暴发数据库的统计，存在于食品中的病原体的种类很多，包括大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等，这些病原体均不同程度的以食品为媒介对人体健康造成一定的威胁。其中，沙门氏菌属细菌是一种革兰氏阴性菌，在自然界具有广泛的宿主，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径传播，一直被认为是世界范围内食源性疾病最重要的病因之一。我国现行食品安全国家标准对沙门氏菌的限量控制是针对即食类预包装食品：GB 29921‑2013中对肉制品、水产制品、即食蛋制品等11种即食预包装食品中沙门氏菌的限量要求均为：n＝5，c＝0，m＝0CFU(n：同一批次产品采取的样品件数；c：最大允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值)。

[0003] 对于沙门氏菌的检测，常规的平板菌落计数鉴定方法虽比较灵敏，但是所需时间长，操作繁琐，需要较为严格的检测环境。近几年提出的其他检测方法，例如：聚合酶链反应(PCR)分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)，虽在一定程度上提高了检测效率以及特异性识别能力，但是仍然存在着检测前需富集，检测需要大型仪器等问题。因此，上述方法难以实现沙门氏菌的实时、快速检测。

[0004] 由于食源性病原体通常以很低的剂量存在于复杂的生物基质中，检测前进行捕获富集有助于提高检测的灵敏度。磁性材料实现磁分离就是将连接有特异性识别靶标生物亲和分子(抗体、适配体)的磁性纳米材料与含有靶标的复杂样品混合，使得磁性材料与目标物结合并利用磁场作用进而达到分离和富集的目的。氧化铁基磁性纳米粒子(MNPs)由于其能被磁场操控、比表面积大、在溶液中的动力学快等特性而被广泛地应用到细菌检测平台中(Congying Wen,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,9(2017),9416–9425；S.Zhan，et al.J.Hanzard.Mater,274(2014),115‑123)。这些方法虽然可以实现快速磁响应和磁分离，但磁性纳米材料往往需要与其他方法联用，才能最终实现病原体的检测。

[0005] 比色法因具有颜色易于裸眼观察、成本低、操作简单等优点，更适用于沙门氏菌的实时、快速检测。现有的沙门氏菌比色法主要是利用经抗体修饰的贵金属纳米材料(金纳米粒子、银纳米粒子等)进行检测，在沙门氏菌与贵金属纳米材料结合之后，形成纳米粒子聚集体，进而导致其在紫外光谱中吸收强度或者吸收峰位置发生改变，裸眼可观测到颜色变化(S,Wang,et al.Chemistry‑A European Journal,16(2010):5600‑5606；Qingmei Chen,et al.Talanta,221(2021)121476；Changqing Zhu，et al.Analytical Methods,8(2016):6560‑6565)。这些方法虽然在一定程度上实现了比色检测，但灵敏度并未能达到实际检测要求，且裸眼分辨率较低，仅为一种颜色的深浅变化。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用，可通过磁捕获及比色法快速检测食品中的沙门氏菌。

[0007] 本发明为了实现上述目的，采用的技术解决方案是：

[0008] 一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，包括如下步骤：

[0009] (1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入1‑十八烯和油酸，在100～130℃下搅拌混合均匀并保温15～30min，然后注入Fe(CO)5，升温至280～300℃并反应1.5～2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，反应完成后冷却至室温；然后加入丙酮离心，并向沉淀产物中添加TMAH溶液，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；

[0010] (2)制备Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入MNPs、去离子水及柠檬酸钠溶液，并在80～120℃下搅拌混合均匀，然后加入HAuCl4溶液，继续在80～120℃下搅拌混合并反应20～30min；反应完成后间隔5min，再次加入等体积的HAuCl4溶液及等体积的柠檬酸钠溶液，在80～120℃下搅拌混合并反应3～6min，反应完毕后得到Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；

[0011] (3)制备Au‑Fe3O4异二聚体识别探针：将步骤(2)制备得到的DBNPs与HS‑PEG‑COOH混合，并在37℃下摇晃50～60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育20～40min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液中；然后加入沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应3～4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为0.01mmol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌的免疫探针，即Au‑Fe3O4异二聚体识别探针，记为IDBNPs，并加入pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，放置于冰箱内在4℃储存。

[0012] 进一步地，所述步骤(1)中1‑十八烯、油酸、Fe(CO)5、丙酮、TMAH溶液、去离子水的体积比为10～20:1～2:0.2～0.4:10～20:10～25:10～20，所述TMAH溶液的浓度为10％，所述氮气的流速为10～20mL/min。

[0013] 进一步地，所述步骤(2)中MNPs、去离子水、柠檬酸钠溶液、HAuCl4溶液的体积比为0.1～0.2:10～20:0.2:～0.5:0.15～0.25，所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为8～10mg/mL，所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为10mmol/L。

[0014] 进一步地，所述步骤(2)中得到的Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子为一对一哑铃型结构异二聚体纳米粒子，其中，Au纳米粒子的直径为12～16nm，Fe3O4纳米粒子的直径为12～16nm。

[0015] 本发明的另一目的是提供一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针在检测沙门氏菌的应用。

[0016] 进一步地，上述应用包括通过磁捕获与紫外‑可见光吸收光谱结合定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌或通过磁捕获与比色法结合定性及半定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌。

[0017] 进一步地，通过磁捕获与紫外‑可见光吸收光谱结合定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌具体包括如下步骤：

[0018] (a)取待检测牛奶或胎牛血清样品，向样品中加入等体积的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，然后用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，并将上清液与沉淀物分离，磁吸时间为10～20min；

[0019] (b)取上清液，用紫外‑可见光吸收光谱对沙门氏菌进行定量检测。

[0020] 进一步地，通过磁捕获与比色法结合定性及半定量检测牛奶及胎牛血清中的沙门氏菌具体包括如下步骤：

[0021] (a)取待检测牛奶或胎牛血清样品，向样品中加入等体积的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，然后用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，并将上清液与沉淀物分离，磁吸时间为10～20min；

[0022] (b)取上清液，并加入ABTS，观察上清液颜色变化，对样品中的沙门氏菌进行定性及半定量检测。

[0023] 进一步地，所述步骤(a)中取待检测牛奶样品时，需先向待检测牛奶中加入醋酸，搅拌并静置，直至不再生成白色沉淀，取上清液作为待检测牛奶样品。

[0024] 进一步地，所述步骤(a)中磁吸时间为15min。

[0025] 本发明的有益效果是：

[0026] (1)本发明所制备的基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针具有金纳米粒子的易修饰性、LSPR性质以及磁性材料的捕获富集功能，实现了沙门氏菌的识别、捕获以及检测一体化；

[0027] (2)通过本发明所制备的Au‑Fe3O4沙门氏菌识别免疫探针不仅可以实现沙门氏菌的定量检测，且还可以通过比色法实现沙门氏菌的定性及半定量检测，检测速度快，且灵敏度高，检测限低，检测限可达10CFU/mL；

[0028] (3)通过本发明所制备的Au‑Fe3O4沙门氏菌识别免疫探针利用磁捕获和比色法检测沙门氏菌的方法抗干扰能力强，操作简便，检测速度快，具有很高的实际应用价值，可以对牛奶和胎牛血清中的沙门氏菌进行准确的检测。

附图说明

[0029] 图1为本发明中Au‑Fe3O4异二聚体的表征图，其中，(a)为Auseed‑Fe3O4异二聚体的透射电镜图，(b)为Auseed‑Fe3O4异二聚体的HAADF‑STEM，(c)为Auseed‑Fe3O4异二聚体的的Au、Fe、O的STEM元素图及叠加图，(d)为DBNPs的TEM图，(e)为DBNPs的紫外光谱图；

[0030] 图2为本发明Au‑Fe3O4异二聚体探针(IDBNPs)的表征图，其中，(a)为Cy3标记的IDBNPs和DBNPs的荧光光谱(激发波长554nm)；(b)为用Cy3标记的IDBNPs的荧光显微镜图像；(c)为用Cy3标记的DBNPs的荧光显微镜图像；(d)为IDBNPs的紫外可见光谱和IDBNPs的颜色图；(e)为IDBNPs的TEM图(插图显示IDBNPs的粒径分布)；

[0031] 图3为本发明IDBNPs的磁响应速率图；

[0032] 图4为本发明IDBNPs的检测信号值与不同磁捕获时间的关系图；

[0033] 图5(a)为本发明IDBNPs检测不同浓度沙门氏菌的紫外光谱图，(b)为紫外吸光度与沙门氏菌浓度的线性关系图；

[0034] 图6为本发明IDBNPS基于ABTS以及实际的裸眼检测效果图；

[0035] 图7为本发明IDBNPs检测不同种类细菌的效果图，在图7中，(a)为IDBNPs检测不同种类细菌的信号值柱状图(插图为相应的紫外‑可见光谱)；(b)为不同种类细菌的比色检测图；(c)为经IDBNPs捕获后的显微镜图像，比例尺为10μm，误差线＝±SD(n＝3)；

[0036] 图8为本发明IDBNPs检测不同合成样品中沙门氏菌的效果图，(a)合成样品的光谱检测信号值；(b)不同合成样品的比色检测图片，误差线＝±SD(n＝3)。

具体实施方式

[0037] 本发明提供了一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合附图对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例提供一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，具体包括如下步骤：

[0040] (1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入20mL的1‑十八烯和2mL的油酸，在120℃下搅拌混合均匀并保温30min，然后注入0.4mL的Fe(CO)5，升温至295℃并反应2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，氮气的流速为15mL/min，反应完成后冷却至室温；然后加入20mL的丙酮离心，并向沉淀产物中添加25mL的TMAH溶液(即四甲基氢氧化铵溶液，其浓度为10％)，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在20mL去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；

[0041] (2)制备Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入0.2mL的MNPs、20mL的去离子水及0.5mL的柠檬酸钠溶液(柠檬酸钠溶液的质量浓度为10mg/mL)，并在100℃下搅拌混合均匀，然后加入0.25mL的HAuCl4溶液(HAuCl4溶液的摩尔浓度为10mmol/L)，继续在100℃下搅拌混合并反应30min，得到Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子；

[0042] (3)在步骤(2)反应完成后间隔5min，再次加入0.25mL的HAuCl4溶液及0.5mL的柠檬酸钠溶液，在100℃下搅拌混合并反应5min，反应完毕后得到Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；

[0043] (4)制备Au‑Fe3O4异二聚体识别探针：取15mL的DBNPs与20mg的HS‑PEG‑COOH(巯基‑聚乙二醇‑羧酸)混合，并在37℃下摇晃60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育30min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在15mL的PBS溶液(pH为7.2、浓度为0.01mol/L的)中；然后加入15μg沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为
0.01mol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌的免疫探针，记为IDBNPs，放置于冰箱内4℃储存。

[0044] 通过上述制备方法制备得到的Au‑Fe3O4异二聚体识别探针为一对一哑铃型结构异二聚体纳米粒子，且其表面偶联有沙门氏菌单克隆抗体。

[0045] 实施例2

[0046] 本实施例提供一种基于Au‑Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，具体包括如下步骤：

[0047] (1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入15mL的1‑十八烯和1mL的油酸，在120℃下搅拌混合均匀并保温30min，然后注入0.3mL的Fe(CO)5，升温至295℃并反应2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，氮气的流速为15mL/min，反应完成后冷却至室温；然后加入10mL的丙酮离心，并向沉淀产物中添加15mL的TMAH溶液(即四甲基氢氧化铵溶液，其浓度为10％)，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在20mL去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；

[0048] (2)制备Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入0.1mL的MNPs、10mL的去离子水及0.3mL的柠檬酸钠溶液(柠檬酸钠溶液的质量浓度为10mg/mL)，并在80～120℃下搅拌混合均匀，然后加入0.15mL的HAuCl4溶液(HAuCl4溶液的摩尔浓度为10mmol/L)，继续在110℃下搅拌混合并反应30min，得到Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子；

[0049] (3)在步骤(2)反应完成后间隔5min，再次加入0.15mL的HAuCl4溶液及0.15mL的柠檬酸钠溶液，在110℃下搅拌混合并反应6min，反应完毕后得到Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；

[0050] (4)制备Au‑Fe3O4异二聚体识别探针：取15mL的DBNPs与20mg的HS‑PEG‑COOH(巯基‑聚乙二醇‑羧酸)混合，并在37℃下摇晃60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育30min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在15mL的PBS溶液(pH为7.2、浓度为0.01mol/L的)中；然后加入15μg沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为
0.01mol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌的免疫探针，记为IDBNPs，放置于冰箱内4℃储存。

[0051] 通过上述制备方法制备得到的Au‑Fe3O4异二聚体识别探针为一对一哑铃型结构异二聚体纳米粒子，且其表面偶联有沙门氏菌单克隆抗体。

[0052] 下面，我们对采用实施例1的制备方法制备得到的DBNPs、IDBNPs进行相关检测，对其进行表征，并利用IDBNPs对沙门氏菌进行相关检测，验证IDBNPs检测沙门氏菌的有效性。

[0053] 一、DBNPs的表征

[0054] 分别取实施例1步骤(2)得到的产物Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子溶液及实施例1步骤(3)得到的产物Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子溶液，即DBNPs，制备试样进行透射电镜等检测，如图1所示。图1为DBNPs的表征图，其中，图1(a)、(b)、(c)分别为Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子的TEM图、HAADF‑STEM图及Au、Fe、O元素的STEM元素分布图及叠加图，从图1(a)、(b)、(c)中可以看出，Auseed‑Fe3O4异二聚体纳米粒子为一对一哑铃型结构，即金纳米粒子与Fe3O4纳米粒子形成一对一哑铃型结构，且金纳米粒子与Fe3O4纳米粒子形成很好的结合；图1(d)为DBNPs的TEM图，从图1(d)中可以看出，继续添加HAuCl4溶液及柠檬酸钠溶液得到的Au‑Fe3O4异二聚体纳米粒子仍保持一对一哑铃型结构，且金纳米粒子与Fe3O4纳米粒子的粒径均为15nm左右，另外，图1(d)中的插图为DBNPs的粒径分布图，显示了DBNPs的平均尺寸约为30nm；图1(e)为DBNPs的紫外光谱图，显示DBNPs的最大紫外吸收波长为520nm，DBNPs颜色显示为酒红色。

[0055] 二、IDBNPs的表征

[0056] 取上述实施例1步骤(4)得到的IDBNPs溶液，即Au‑Fe3O4异二聚体识别探针，在实施例1步骤(4)中，通过加入HS‑PEG‑COOH对DBNPs进行修饰，并激活DBNPs表面的羧基，然后加入沙门氏菌单克隆抗体，DBNPs上的羧基与抗体的氨基通过共价偶联进行结合，得到Au‑Fe3O4异二聚体识别探针。为了证实这种结合，将获得的IDBNPs、DBNPs分别与Cy3标记的羊抗鼠IgG反应，并进行如下检测，检测结果如图2所示。图2为IDBNPs的表征图，其中，图2(a)为Cy3标记的IDBNPs和DBNPs的荧光光谱，激发波长为554nm，从图2(a)中可以看出，Cy3的最大吸收峰(568nm)出现在IDBNPs的荧光光谱中，而DBNPs的荧光光谱中没有出现在相应的吸收峰中；图2(b)、(c)为Cy3标记的IDBNPs及Cy3标记的DBNPs的荧光显微镜图像，在IDBNPs样品中可以观察到许多代表抗体的橙色荧光点，在DBNPs中未发现明显的荧光，表明沙门氏菌单克隆抗体成功地与DBNPs结合；图2(d)为IDBNPs的紫外可见光谱和IDBNPs的颜色图，其紫外可见光谱及颜色与DBNPs基本一致；图2(e)为IDBNPs的TEM图(插图显示IDBNPs的粒径分布)，IDBNPs的直径约为30±6nm，其直径略有增大，说明其表面偶联有沙门氏菌单克隆抗体。

[0057] 三、IDBNPs的磁响应性能

[0058] 取实施例1步骤(4)得到的IDBNPs溶液，即Au‑Fe3O4异二聚体识别探针，利用磁性支架进行磁响应检测，如图3所示，图3为IDBNPs的磁响应速率图，说明Au‑Fe3O4异二聚体识别探针具备磁响应性能，且随着磁吸引时间的增加，IDBNPs在磁场作用下逐渐富集，但完全富集所需时间较长，因此需确定较优的磁捕获时间。

[0059] 我们设置6组0.5mL浓度106的CFU/mL的沙氏门菌溶液，并分别加入0.5mL的IDBNPs，经恒温振荡器孵育后(37℃，120rpm，30min)，采用磁性支架对其进行不同时间的磁捕获，分离上清液，对上清液进行紫外‑可见光吸收光谱检测，得到检测磁捕获时间与紫外光谱检测信号值的关系，如图4所示，从图4中可以看出，15分钟的磁捕获时间产生了最大的检测信号值，在检测过程中，可选定磁捕获时间为15min。

[0060] 四、采用IDBNPs对沙门氏菌进行定量及定性检测

[0061] 分别配制0.5mL浓度分别为0、10、102、104、106的CFU/mL的沙氏门菌溶液，然后分别加入0.5mL的IDBNPs，经恒温振荡器孵育后(37℃，120rpm，30min)，采用磁性支架分离与IDBNPs结合的沙门氏菌，磁吸时间为15min，然后将上清液与沉淀物分离，并保留上清液及沉淀物。

[0062] 如图5所示，采用紫外‑可见光吸收光谱检测上清液的紫外最大吸收强度，如图5(a)所示，并绘制曲线，从图5(b)所示，可以看出，吸光度的变化值与沙门氏菌浓度在10‑3
10CFU/mL的范围内呈现良好的线性关系，且最低检测限为10CFU/mL，说明利用IDBNPs并通过磁捕获与紫外‑可见光吸收光谱相结合可用于沙门氏菌的定量检测，而且，在实际使用过
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程中，通常都是取样进行微量检测，10‑10CFU/mL沙氏门菌浓度与紫外吸光度的线性关系已足够日常检测使用。

[0063] 另外，取上述分离后的上清液，观察其颜色变化，并在上清液中加入0.5mL浓度为5mg/mL的ABTS，观察颜色变化，如图6所示。图6为磁分离后的上清液颜色及加入ABTS后上清液颜色随沙门氏菌浓度变化照片，从图6中可以看出，随着沙门氏菌浓度增大，经磁分离后，上清液中剩余的IDBNPs减少，通过裸眼观测，上清液颜色从红色变为浅红色；然后在上清液中加入ABTS后，随着沙门氏菌浓度增大，上清液颜色从棕色变为红棕色最终变为绿色。

[0064] 上述颜色的变化是因为所制备的IDBNPs具有拟过氧化氢酶活性，当将ABTS加入上清液后，在游离的IDBNPs催化作用下，过氧化氢将ABTS氧化为绿色螯合物，即OxABTS，依据混色原理，绿色螯合物会与上清液原本的红色进行共混，呈现丰富的颜色变化。而且，随着沙门氏菌浓度的增加，上清液中IDBNPs浓度逐渐降低，不仅导致IDBNPs的红色逐渐变浅，且IDBNPs浓度的降低削弱了其对ABTS的催化性能，所产生的OxABTS绿色也逐渐减弱，依据混色原理会呈现不同颜色变化，可以对沙门氏菌进行比色检测，通过颜色变化，可判断是否存在沙门氏菌，且还可以通过对比颜色，大致判断沙门氏菌的浓度范围，实现对沙门氏菌的定性及半定量检测。且参照图6，当沙门氏菌浓度为10CFU/mL时，就发生了颜色变化，比色检测的最低检测限可达到10CFU/mL。通过该比色法检测沙门氏菌，快速灵敏。

[0065] 五、检测IDBNPs的选择性及特异性

[0066] 为验证IDBNPs只对沙门氏菌具有选择性，本实施例还将其与其他常见食源性病原体(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)进行检测对比，如图7所示。

[0067] 具体操作过程为，分别配制0.5mL浓度为106CFU/mL的沙门氏菌(SE)、大肠杆菌(E.coil)、金黄色葡萄球菌(SA)、铜绿假单胞菌(PAE)溶液，然后分别加入0.5mLIDBNPs，经恒温振荡器孵育后(37℃，120rpm，30min)，采用磁性支架进行分离，即将上清液与沉淀复合物分离，并保留上清液及沉淀复合物，并设置空白对照组，空白对照组为等量的IDBNPs溶液。

[0068] 将磁分离后的沉淀复合物分别重悬于2mL的PBS(0.01M，pH＝7.2)，加入吖啶橙使其终浓度为10μg/mL，然后置于恒温振荡器中在37℃、150rpm下避光振荡30min，反应结束后，用磁性支架洗涤3次，检测沉淀复合物的荧光强度，并在上清液中加入0.5mL的浓度为5mg/mL的ABTS，观察颜色变化，检测结果如图7所示。图7为采用IDBNPs检测不同种类细菌的效果图，其中，图7(a)为IDBNPs检测不同种类细菌的信号值柱状图(插图为相应的紫外‑可见光谱)，说明IDBNPs分别与其它常见食源性病原体(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)孵育时，仅能够实现对沙门氏菌的检测，其他致病菌的检测信号值均与空白对照组的信号值相似；图7(b)为不同种类细菌的比色检测图，仅沙门氏菌发生颜色变化，且颜色为绿色，说明IDBNPs与沙门氏菌结合，游离的IDBNPs的含量减少；图7(c)为经磁分离后的复合沉淀物的显微镜图像，从图7(c)中可以看出，IDBNPs与沙门氏菌结合的样品中可以观察到许多绿色荧光点，为被染色的细菌，在IDBNPs与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌结合的样品中均未观察到明显的荧光点，上述结果说明IDBNPs对沙门氏菌具有良好的选择性和特异性，仅可以捕获沙门氏菌。

[0069] 实施例3

[0070] 本实施例3利用实施例1所制备的IDBNPs检测实际样品，验证IDBNPs在实际样品中沙门氏菌含量检测的可行性，所选样品为牛奶及胎牛血清，对照组为加入沙门氏菌的PBS溶液，如图8所示为IDBNPs检测不同合成样品中沙门氏菌的效果图。检测步骤具体为：

[0071] 取0.5mL的待检测牛奶及胎牛血清，并分别加入浓度为0、10、102、104、106CFU/mL的沙门氏菌悬液混合(体积比为9：1)，得到合成样品，向样品中加入0.5mL的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，然后用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，并将上清液与沉淀物分离，磁吸时间为15min；在取待检测牛奶样品时，需先向待检测牛奶中加入醋酸，搅拌并静置，直至不再生成白色沉淀，取上清液作为待检测牛奶样品，是为防止蛋白质等对检测结果产生影响，另外，在合成样品中加入沙门氏菌是保证样品中确实含有沙门氏菌。

[0072] 对合成样品的光谱信号进行检测，如图8(a)所示，图8(a)为合成样品的光谱检测信号值，三者的光谱检测信号值基本相同，可以利用用紫外‑可见光吸收光谱对沙门氏菌进行定量检测。

[0073] 另外，取上清液，并加入0.5mL的浓度为5mg/mL的ABTS，观察上清液颜色变化，如图8(b)所示，图8(b)为不同合成样品的比色检测图片，牛奶样品及胎牛血清蛋白样品的颜色变化与理想环境即PBS溶液中的颜色变化基本相同，表明可以用比色法对沙门氏菌进行定性及半定量检测。

[0074] 通过上述检测，也说明IDBNPs具有良好的抗干扰能力，可应用于实际样品检测。

[0075] 在对待检测样品实际检测过程中，可具体采用如下步骤：

[0076] (1)取0.5mL待检测牛奶或胎牛血清样品，向样品中加入0.5mL的IDBNPs，然后在37℃下轻轻摇动，并在37℃培养30min，用磁性支架捕获IDBNPs结合的沙门氏菌，磁吸时间为15min，然后将上清液与沉淀物分离；需注意在取待检测牛奶样品时，需先向待检测牛奶中加入醋酸，搅拌并静置，直至不再生成白色沉淀，取上清液作为待检测牛奶样品；

[0077] (2)取上清液，用紫外‑可见光吸收光谱检测上清液的吸光度，参照试验过程中确定的吸光度的变化值与沙门氏菌浓度的线性关系，即可对沙门氏菌进行定量检测；

[0078] (3)取上清液，加入0.5mL的浓度为5mg/mL的ABTS，观察上清液颜色变化，参照试验过程中确定的沙门氏菌浓度与颜色的对应关系进行比色，可大致判断沙门氏菌的浓度范围，即可对样品中沙门氏菌的定性及半定量检测。

[0079] 本发明中未述及的部分，采用或借鉴已有技术即可实现。

[0080] 当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。